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Skript Modul Molekulare Pflanzenphysiologie by S9AJ32J8

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									                                         Master-Modul:




        Molekulare Pflanzenphysiologie
                                             WS 2008-2009




Inhalt:

1. Molekulargenetische Analyse von Arabidopsis thaliana ........................ S. 2
2. Vergleichende Promotoranalysen ............................................................ S. 8
3. Pflanzentransformation ............................................................................ S. 12




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1. Molekulargenetische Analyse von Arabidopsis thaliana
1.1 Einleitung
        Die Fokussierung auf das Modellsystem Arabidopsis thaliana hat in den letzten 20
Jahren grundlegende Erkenntnisse zur pflanzlichen Physiologie und Entwicklung in einem
kaum vorstellbaren Ausmaß ermöglicht. Viele grundlegende Fragen der Pflanzenbiologie
konnten adressiert und zum Teil auch schon beantwortet werden. Dutzende von Beispielen
hierfür sind in den Vorlesungen „Pflanzenphysiologie“, „Molekularbiologie und Biochemie
der Pflanzen“ und „Molekulare Pflanzenphysiologie“ dargestellt worden. Entscheidender
Ansatz war und ist die Isolierung von Mutanten und die positionelle Klonierung der
betroffenen Gene (Forward Genetics, Abb. 1). Seit der Veröffentlichung der Genomsequenz
im Jahre 2000 ist letzteres deutlich leichter geworden, da neue molekulare Marker nun in
silico entworfen werden können (Abb. 2). Zusätzlich hat der Aufbau großer Populationen von
T-DNA-Insertionslinien Reverse Genetics ermöglicht (Abb. 1).




                 Abb. 1: Forward und Reverse Genetics im Überblick. Ostergaard &
                 Yanofsky (2004) Establishing gene function by mutagenesis in
                 Arabidopsis thaliana. Plant J 39: 682-96

Pflanzen benötigen wie andere Organismen zahlreiche Übergangsmetalle als Mikronährstoffe.
Ionen dieser Metalle können allerdings leicht toxische Wirkungen entfalten, da sie sehr
reaktiv sind. Da oft Fluktuationen in der Verfügbarkeit auftreten können und zudem auch
nicht-essentielle toxische Metalle wie Cadmium in der Natur auftreten können, besitzen
Pflanzen Metalltoleranzmechanismen. Grundsätzlich bestehen diese nach bisherigem
Erkenntnisstand aus der Synthese metallbindender Liganden, der Liganden- und Transporter-
vermittelten Sequestrierung und dem Auspumpen (Abb. 3). Wir gehen jedoch davon aus, dass
weitere Mechanismen existieren. Zudem ist die Regulation dieser Prozesse noch gänzlich
unverstanden.

                                               2
 Abb. 2: Gebräuchliche molekulare Marker für die positionelle
 Klonierung von Genen. Lukowitz et al. (2000) Positional
 cloning in Arabidopsis. Why it feels good to have a genome
 initiative working for you. Plant Physiol 123: 795-805




Abb. 3.: Zn2+-Toleranzmechanismen von Pflanzen im
Überblick. Krämer (2005) MTP1 mops up excess zinc in
Arabidopsis cells. Trends Plant Sci 10: 313-315.


                            3
        In den letzten Jahren ist in unserer Arbeitsgruppe deshalb ein genetischer Screen
durchgeführt worden, um Zn2+-hypersensitive A. thaliana-Mutanten zu finden und die
betroffenen Gene zu isolieren und zu charakterisieren. Das Prinzip des Screens ist in Abb. 4
dargestellt. Wir sind dabei, die Zahl der betroffenen Loci zu bestimmen, die Mutanten
physiologisch zu charakterisieren und die betroffenen Gene zu isolieren.




                50 µM Zn2+                            control                              control

Abb. 4: Screening auf Zn2+-hypersensitive A. thaliana-Mutanten. Aus EMS-mutagenisierten Samen wachsende
Keimlinge wurden auf Zn2+-haltigem Medium ausgebracht. Pflanzen mit einem Wachstumsdefekt unter diesen
Bedingungen wurden auf Platten mit Kontrollmedium gebracht. Solche Pflanzen, die eine Erholung des
Wurzelwachstums zeigten, wurden als putative Mutanten angesehen und weiter kultiviert.



1.2 Versuchsdurchführung
       Ziel dieses Versuchsteil ist es zum einen die Hypersensitivität der untersuchten
Mutante (IZS 133) gegenüber Zn2+ zu dokumentieren und zum anderen durch die Berechnung
des Aufspaltungsverhältnisses die Anzahl der für die Mutation verantwortlichen Loci zu
ermitteln. Darüber hinaus kann man mit diesem Versuch auch eine Aussage darüber treffen,
ob es sich um eine rezessive oder dominante Mutation handelt. Als dritter Punkt soll mittels
Kartierungs PCRs die grobe Lokalisation der Mutation im Genom von A. thaliana festgestellt
werden.

Teil 1: Plattenassay (Hypersensitivität)
        Samen des Vergleichs-Ökotyps (Col-0) und der Mutante IZS133 werden sterilisiert
und auf Hoagland-Platten mit normaler und erhöhter (80 µM) Zn-Konzentration ausgelegt.
Pro Bedingung werden 3 Platten angefertigt d.h. 3x Kontrolle und 3x 80 µM Zn2+. Nach dem
Auslegen der Samen werden die Platten mit „Leucopore tape“ abgeklebt und für 2 Tage bei
4°C stratifiziert. Anschließend werden die Platten vertikal bei 16h Belichtung für 12-14 Tage
kultiviert.

 Zusammensetzung der Platten:
      (von den ersten vier Komponenten je eine 1 M Stammlösung ansetzen)
      - 0,28 mM     Ca(NO3)2 x 4 H2O
      - 0,1 mM      (NH4)H2(PO3)
      - 0,2 mM      MgSO4
      - 0,6 mM      KNO3
      - 5 µM        Fe-HBED (Stock Lösung 10 mM wird gestellt)
      - 5 mM        MES
      - 1% (w/v)    Saccharose
      - pH 5,7
      - 1% (w/v) Agar (Typ A)


                                                  4
 Sterilisation von Arabidopsis thaliana Samen
    - eine kleine Portion Samen in ein 2 ml Eppi füllen
    - Kristallisationsschale im Exikator mit 10 ml Na-Hypochlorit-Lösung füllen
    - Keramikplatte und Ständer mit Eppis in den Exikator stellen (Deckel müssen offen
      sein !!)
    - 6 ml rauchende HCl (32%) zugeben (Achtung es entsteht Chlorgas !!!)
    - zügig den Exikator verschließen und den Schlauch anschließen
    - Stellung des Hahn beachten Exikator muss Verbindung zu den Waschflaschen haben
    - Chlorgas 30-45 Minuten einwirken lassen
    - Chlorgas anschließend mittels Vakuumpumpe absaugen (dauert ca. 45 Minuten)
      Achtung: Dreiwegehahn muß in der richtigen Position sein !!!
    - anschließend die Samen unter der Sterilbank aus dem Exikator entnehmen und für
      mindestens 10 Minuten noch ablüften lassen
    - Deckel der Eppis verschließen und Samen bei RT lagern

 Auslegen der Samen
    Mit Hilfe eines sterilen Zahnstochers werden jeweils 10-12 sterile Samen einer Linie auf
    die linke bzw. rechte Seite einer Agarplatte ausgelegt. Die Anordnung der Samen erfolgt
    entlang einer horizontalen Linie (mit Edding anzeichnen).


Teil 2: Plattenassay (Aufspaltungsverhältnis)
       Samen der F2 Generation einer Col-0 x IZS 133 Kreuzung werden auf Platten mit
80 µM Zn ausgelegt. Pro Gruppe werden 100 Samen der jeweiligen Kreuzung ausgelegt (25
Samen pro Platte. Nach dem Auslegen der Samen werden die Platten mit „Leucopore tape“
abgeklebt und für 2 Tage bei 4°C stratifiziert. Anschließend werden die Platten vertikal bei
16h Belichtung für 12-14 Tage kultiviert.


Teil 3: Kartierungs-PCR
       Pro Gruppe werden je 12 Pflanzenproben geerntet und analysiert. Die Proben setzen
sich aus Col-0, Ler-0 und 10 Rekombinationslinien zusammen (Aufteilung wird vom Betreuer
bekannt gegeben). Für jede Probe werden 3-5 kleine Sprosse vereinigt und sofort in flüssigen
Stickstoff eingefroren. Die Proben werden unter ständigem Kühlen (flüssiger Stickstoff)
gemörsert und anschließend wird die genomische DNA isoliert (Quick-Prep). Diese DNA
dient als Matrize für die späteren PCR -Analysen. Jede Gruppe wird anfangs drei PCR-
Analysen durchführen wobei jede Gruppe zwei SSLP-Marker und einen CAPS-Marker
verwendet. Im weiteren Verlauf sollen auch eigene Primer entworfen und getestet werden.
Nach Beendigung aller Markeranalysen sollen die Ergebnisse aller Gruppen gemeinsam
ausgewertet werden, um eine Aussage über die Position der Mutation(en) zu treffen.


 Isolation der genomischen DNA (Quick-Prep)
     - Pflanzenmaterial fein mörsern (immer mit Stickstoff kühlen)
     - 500 µl Extraktionspuffer darauf geben und gut resuspendieren
     - 5 Minuten bei max rpm zentrifugieren
     - 300 µl des Überstandes in ein neues 1,5 ml Eppi überführen
       (keine Zelltrümmer mit überführen nur klaren Überstand !!!)
     - Überstand mit 300 µl Isopropanol versetzen
     - Gefäße durch mehrmaliges Umdrehen mischen (NICHT vortexen)

                                             5
     - 5 Minuten bei max rpm zentrifugieren
     - Überstand vollständig abnehmen und verwerfen
     - 500 µl 70 % (v/v) EtOH auf das Pellet pipettieren (Pellet nicht resuspendieren)
     - 5 Minuten bei max rpm zentrifugieren
     - Überstand vollständig abnehmen
     - Pellet trocknen
     - 40 µl Wasser (Millipore) auf Pellet geben und 5 Minuten bei 50°C inkubieren
     - 1 Minute auf Eis
     - 1 Minute bei max rpm zentrifugieren
     - 30-35µl des Überstandes in neues Gefäß überführen (enthält die DNA !!!)

           Genomische DNA bei 4°C lagern und NICHT einfrieren

     # Quick-prep Extraktions-Puffer:        200 mM      Tris-HCl (pH 7,5)
                                             250 mM      NaCl
                                              25 mM      EDTA
                                          0,5 % (w/v)    SDS

 Ansatz PCR (SSLP-Marker)
     Gesamtvolumen 21µl
     2,1 µl      10x Puffer (wird gestellt)
     0,42 µl     20 mM dNTPs
     0,42 µl     20 µM Primer fw
     0,42 µl     20 µM Primer rev
     0,42 µl     Taq-Polymerase
     1,00 µl     gDNA
     16,22 µl    Millipore-Wasser


      PCR-Programm:      96°C       3 min
                         96 °C      30 sec
                         X°C        2 min
                         72°C       30 sec 10 Zyklen
                         96°C       30 sec
                         X°C        30 sec
                         72°C       30 sec 30 Zyklen
                         72°C       5 min
                         14°C       ∞


 Ansatz PCR (CAPS-Marker)
    Gesamtvolumen 50µl
     5 µl 10x Puffer (wird gestellt)
     1 µl 20 mM dNTPs
     1 µl 20 µM Primer fw
     1 µl 20 µM Primer rev
     1µl    Taq-Polymerase
     1µl    gDNA
     40 µl Millipore-Wasser



                                              6
     PCR-Programm:       96°C      3 min
                         96 °C     30 sec
                         X°C       2 min
                         72°C      1 min 10 Zyklen
                         96°C      30 sec
                         X°C       30 sec
                         72°C      1 min 30 Zyklen
                         72°C      7 min
                         14°C      ∞

 Spezial-Agarose-Gel
        Agarose (NuSieve) für ein 3%iges (w/v) Gel abwiegen und unter schnellem Rühren
    LANGSAM in 1x TBE Puffer einrühren. Klumpen sind unbedingt zu vermeiden. Nach
    dem Einrühren das Gel für mindestens 20 Minuten quellen lassen. Anschließend das Gel
    aufkochen und unmittelbar vor dem Gießen mit Ethidiumbromid (6 µl pro 100 ml)
    versetzen. PCR Proben mit 6µl Stopp-Puffer versetzen und auftragen. Als Marker wird
    der 20 bp Marker verwendet (5µl).

          * TBE-Puffer: - 89 mM    Tris
                        - 89 mM    Borsäure       5-fach TBE Puffer ansetzen!
                        - 2 mM     EDTA


 Verwendete PCR Marker und Annealing Temperaturen

    Marker                    Art                      Annealing-Temperatur
    NF21M12                   SSLP                     55 °C
    CIW12                     SSLP                     50 °C
    NF19K23                   SSLP                     50 °C
    MW-SNP217                 CAPS                     55 °C
    MW-NGA162                 SSLP                     60 °C
    NGA172                    SSLP                     52 °C
    MW-SNP3902                CAPS                     57°C
    NGA168                    SSLP                     57 °C
    MW-SNP9556                CAPS                     48 °C


 Aufreinigung von CAPS-PCR-Reaktionen für späteren Verdau
    - 1/10 Volumen 3M Kalium-Acetat zugeben
    - gut mischen
    - 3-faches PCR-Volumen an eiskaltem Ethanol (96%) zugeben
    - gut mischen
    - Ansatz für 1-2 h bei -80°C oder bei -20°C über Nacht inkubieren
    - anschließend bei max rpm 15 min zentrifugieren
    - Pellet mit 500µl 70% (v/v) Ethanol waschen
    - Pellet trocknen und in 18-30µl H2O resuspendieren

 Verdau für CAPS-Marker
    - 2 µl    10x Puffer
    - 0,5 µl  Enzym (10U)
    - 17,5 µl aufgereinigtes PCR-Fragment

                                              7
 Entwerfen von Primern für Tetra-Primer Marker-PCR
    - wichtige Parameter für Primer:
        * GC Gehalt zwischen 40 und 60%
        * 3´Ende soll mindestens ein G bzw. C enthalten
        * inneren Primer müssen einen „Mismatch“ bei Position -3 enthalten
        * Tm der inneren Primer müssen niedriger sein als die der äußeren
        * Tm-Differenz zwischen inneren und äußeren Primern darf höchstens 5°C betragen
        * die entstehenden Fragmente müssen sich um mindestens 60 bp in der Größe
          unterscheiden
        * das äußere Fragment sollte eine Größe von ca. 500 -600 bp haben
        * die inneren Fragmente sollten nicht kleiner als 250 bp sein



       -wichtige Programme und Internetseiten
       * http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/download.htm
       * http://www.arabidopsis.org/
       * http://www.arabidopsis.org/servlets/Search?action=new_search&type=polyallele
       * http://www.arabidopsis.org/cgi-bin/patmatch/RestrictionMapper.pl




2. Vergleichende Promotoranalysen
2.1 Einleitung
        Die Nutzung von Reportergenen für die Analyse von Promotoren, die Lokalisierung
von Proteinen, die Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen, die Isolierung von
Signaltransduktionsmutanten etc. ist in der Vorlesung „Molekulare Pflanzenphysiologie“ an
zahlreichen Beispielen besprochen worden. Das -Glucuronidase-Gen aus E. coli ist seit ca.
20 Jahren das am häufigsten benutzte Reportersystem, um die Aktivität pflanzlicher
Promotoren zu untersuchen. Die Aktivität ist einfach zu messen, Hintergrundaktivität in
Pflanzen ist vernachlässigbar, histologische Assays sind möglich und das GUS-Protein ist in
Pflanzen sehr stabil.
        Arabidopsis halleri ist eine an schwermetallbelastete Böden angepasste Pflanze, die
u.a. eine Hypertoleranz zeigt (Abb. 4). Vergleichende Transkriptom-Untersuchungen mit
Hilfe von Microarrays haben in den letzten Jahren ergeben, dass eine Reihe von Genen der
Metallhomöostase in A. halleri eine deutlich erhöhte Expression zeigen im Vergleich zu A.
thaliana. Daraus haben sich die Fragen ergeben, ob diese Unterschiede (i) auf cis-
regulatorische Elemente zurückzuführen sind und wenn ja (ii), welche cis-regulatorischen
Elemente das sind. Zur Klärung dieser Fragen sind die Promotoren von Kandidatengenen aus
A. halleri und die der orthologen Gene aus A. thaliana kloniert und mit GUS fusioniert
worden für die Charakterisierung in A. thaliana. Ein Kandidatengen kodiert für eine
Nicotianaminsynthase. Nicotianamin ist ein niedermolekularer Metallchelator, der in A.
thaliana offenbar an der Verteilung von Fe, Zn und Mn beteiligt ist.




                                            8
                                              A. thaliana




                                              A. halleri
                 Abb. 4: A. halleri ist hypertolerant gegenüber Schwermetallen.
                 Pflanzen wurden auf Kontrollerde (links) und auf belasteter Erde aus
                 dem Harz (rechts) angezogen. Weber et al. (2006) Comparative
                 transcriptome analysis of toxic metal responses in Arabidopsis thaliana
                 and the Cd2+-hypertolerant facultative metallophyte Arabidopsis halleri.
                 Plant, Cell and Environment 29: 950-963




2.2 Versuchsdurchführung
        Ziel dieses Versuchsteil ist es die Promotoren des NAS2-Gens aus A. thaliana und
A. halleri hinsichtlich ihrer Expressionsstärke zu vergleichen. Darüber hinaus soll festgestellt
werden in welchem Bereich der Promotoren wichtige regulatorische Elemente vorhanden
sind. Um diese Untersuchungen durchzuführen werden transgene A. thaliana Pflanzen
verwendet die ein β-Glucuronidase-Gen (GUS) unter der Kontrolle der verschiedenen
Promotoren bzw. Promotorfragmente tragen. Der Versuch beruht auf dem Prinzip, dass die
Aktivität des Reportergens (GUS) in direktem Zusammenhang mit der Promotorstärke steht.
        Jede Gruppe erhält je eine transgene A. thaliana Linien und eine untransformierte
A. thaliana Linie als Negativkontrolle. Mit Hilfe eines quantitativen GUS Assays und PCR
soll herausgefunden werden, um welches Konstrukt aus der unten aufgeführten Liste es sich
handelt und im welchen Bereich des A. halleri Promotors die entscheidenden regulatorischen
Elemente sitzen.

Zur Auswahl stehende Konstrukte:         - A. thaliana     1500 bp Promotor
                                         - A. halleri      1500 bp Promotor
                                         - A. halleri      1350 bp Promotor
                                         - A. halleri      500 bp Promotor
                                         - A. halleri      300 bp Promotor


                                                    9
Des Weiteren soll eine qualitative GUS-Färbung vorgenommen werden, um das Expressions-
Profil des NAS2 Gens in planta zu visualisieren.


Teil 1: Identifizierung der Fragmentgröße mittels PCR

 Isolation der genomischen DNA (PCI-Methode)
     - 2-3 junge Blätter in flüssigen Stickstoff einfrieren und fein mörsern
     - Zugabe von 1 ml Extraktionspuffer
     - 10 min bei 65 °C inkubieren
     - Zugabe von 300 µl Kalium-Acetat-Lösung
     - 10 min bis 1 h auf Eis inkubieren
     - Zentrifugieren: max rpm, 10 min, 4°C
     - von der oberen Phase 800 µl abnehmen und in ein neues Eppi überführen
     - mit 800 µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol versetzen
     - durch Umdrehen der Gefäße mischen (nicht Vortexen !!!)
     - Zentrifugieren: max. rpm, 5 min, 4°C
     - obere Phase in neues Eppi überführen und mit gleichen Volumen an Isopropanol
     versetzen
     - durch Umdrehen der Gefäße mischen (nicht Vortexen !!!)
     - Zentrifugieren: max. rpm, 5 min, 4°C
     - Überstand dekantieren und Pellet mit 70% (v/v) EtOH waschen
     - nach dem Trocknen Pellet in 50 -100 µl Wasser aufnehmen

            * Extraktionspuffer: 100 mM         Tris/HCl pH 8,0
                                 50 mM          EDTA pH 8,0
                                 1,5 % (w/v)    SDS
                                 0,7 % (v/v)    β-Mercaptoethanol

           * Kalium-Acetat-Lösung: 60 ml           5M K-Acetat
                                     11,5 ml       Eisessig
                                     28,5 ml       Wasser
 Test PCR (Ansatz 50 µl)
      5 µl 10x Pfu-Puffer (wird gestellt)
      1 µl 20 mM dNTPs
      1 µl 20 µM Primer fw
      1 µl 20 µM Primer rev
      1µl    Taq-Polymerase
      1µl    gDNA
      40 µl Millipore-Wasser

       PCR-Programm:      96°C    3 min
                          96 °C   30 sec
                          X°C     2 min
                          72°C    2 min 10 Zyklen
                          96°C    30 sec
                          X°C     30 sec
                          72°C    2 min 30 Zyklen
                          72°C    7 min
                          14°C    ∞


                                           10
Teil 2: Quantitativer GUS-Assay
 Kultivierung der Pflanzen für quantitativen GUS-Assay
            Eine kleine Menge der zur Verfügung gestellten Samen werden zuerst sterilisiert
    und anschließend in flüssigem Hoagland-Medium für ca. 8 Tage unter leichtem
    Schütteln und bei 16h Belichtung kultiviert.

       *Hoagland-Medium
             (von den ersten vier Komponenten je eine 1 M Stammlösung ansetzen)
             - 0,28 mM          Ca(NO3)2 x 4 H2O
             - 0,1 mM           (NH4)H2(PO3)
             - 0,2 mM           MgSO4
             - 0,6 mM           KNO3
             - 5 µM             Fe-HBED (Stock Lösung 10 mM wird gestellt)
             - 5 mM             MES
             - 1% (w/v)         Saccharose
             - pH 5,7

 Protein Isolation
    Für die quantitativen Analysen der β-Glucuronidase-Aktivität wird ausschließlich
    Wurzelmaterial benutzt.
    - Wurzeln mörsern
    - 100 µl kalter GUS Extraktionspuffer zugeben und mischen
    - Zentrifugieren: max rpm, 15 min, 4°C
    - Überstand in neues Eppi überführen und Proteinkonzentration bestimmen

       * GUS Extraktionspuffer: 50 mM        NaPO4 (pH 7,0)
                                10 mM        β-Mercaptoethanol
                                10mM         EDTA (pH8,0)
                                0,1%         SDS
                                0,1%         Triton X-100

 Bestimmung der Proteinkonzentration
           Die Bestimmung der Proteinkonzentration wird in Mikrotiterplatten
    durchgeführt. Die Proben der Standardreihe werden wie folgt vorbereitet: 90 µl BCA
    werden jeweils mit 10 µl des BSA Standards (in der jeweiligen Konzentration)
    versetzen, so dass sich folgende Konzentrationen im Gesamtvolumen befinden: 0 µg/µl,
    0,5 µg/µl, 1 µg/µl, 1,5 µg/µl und 2 µg/µl BSA. Die Proben werden auf dieselbe Weise
    vorbereitet, wie die Standards (10 µl Probe + 90 µl BCA-Lösung). Zur besseren
    Kalkulierbarkeit sollen von jedem Extrakt zwei Verdünnungen (1:5 und 1:10)
    vermessen werden. Die Mikrotiterplatte wird in Alufolie verpackt und 30 Minuten bei
    37°C inkubiert. Die Messung der Absorption erfolgt bei 562 nm.

 Quantitativer GUS Assay
            Für jede GUS-Aktivitätsmessung werden 7,5 µg Protein in ein Volumen von
    180 µl Extraktionspuffer vorgelegt. Durch Zugabe von 20 µl GUS Assay Puffer wird die
    enzymatische Reaktion gestartet. Der Ansatz wird bei einer Temperatur von 37°C
    inkubiert. Nach t = 0 min, t = 30 min und t = 60 min werden 60 µl aus dem Ansatz
    entnommen und mit 390 µl Stopp Puffer versetzt, wodurch die Reaktion beendet wird.
    Die Proben werden in einer 400 µl Quarzglasküvette im Spektrofluorometer gemessen.
    Angeregt wird die Probe mit einer Wellenlänge von 355 nm (UV-Licht)
    (Anregungsmaximum). Das von der Probe emittierte Fluoreszenzlicht wird bei seinem

                                            11
     Emissionsmaximum von 460 nm (blaues Licht) gemessen. Vor jeder Messung wird eine
     Standardkurve mit ansteigenden Konzentrationen (50 pM, 100 pM, 250 pM, 500 pM,
     1000 pM, 1500 pM, 2000 pM, bis 2500 pM) von 4-MU (1 mM 4-MU in Milli-Q-
     Wasser; Verdünnung der 1 mM 4-MU-Stammlösung in Carbonat Stopp Puffer)
     angelegt. Alle für die Messung relevanten Schritte müssen auf Eis durchgeführt werden
     und die Proben müssen vor Lichteinstrahlung geschützt werden.

       * GUS Assay Puffer: 10 mM 4-MUG in 0,1 M NaPO4 (pH 6,5)

       * Stop-Puffer: 0,2 M Na2CO3 (pH11,2)


Teil 3: Qualitative GUS-Färbung
 Kultivierung der Pflanzen für qualitative GUS-Färbung
              Eine kleine Menge der zur Verfügung gestellten Samen werden in Wasser für
      ca. 10 Tage unter leichtem Schütteln und bei 16h Belichtung kultiviert.

 Qualitativer GUS -Assay
            Die Keimlinge aus Flüssigkultur werden in Mikrotiterplatten überführt und für
    eine Stunde in Waschpuffer inkubiert. Die Waschlösung wird anschließend durch den
    GUS-Assay-Puffer ersetzt. Die Inkubation erfolgt bei 37°C über 24 Stunden. Die
    Färbung der Wurzeln soll in den ersten 3 Stunden im Abstand von 30 Minuten verfolgt
    werden. Nach 24 Stunden soll abschließend die Verfärbung nochmals dokumentiert
    werden. Die Dokumentation erfolgt mittels Mikroskop und Digitalkamera.

       * Waschpuffer: 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,0-7,5)
                      1 mM K3[Fe(CN)6]

       * GUS-Assay-Puffer: 50 mM       Phosphatpuffer (pH 7,0-7,5)
                           10 mM       EDTA
                           0,1%        Triton
                           1 mM        K3[Fe(CN)6]
                           0,24 mM     X-Gluc (gelöst in DMF)



3. Pflanzentransformation
3.1 Einleitung
       Die Transformation von Pflanzen, d.h. die gentechnische Veränderung durch gezielte
Einführung von Genen in das Genom von Pflanzen, stellt zuallererst eine unverzichtbare
Methode der Grundlagenforschung dar. Überexpression mittels starker konstitutiver
Promotoren wie 35S oder Inaktivierung durch RNAi sind integrale Bestandteile der
funktionellen Charakterisierung eines Gens. Ebenso gehört es heute zur Routine der
Untersuchung von Genen und Proteinen, durch die Transformation mit Reportergen-
Konstrukten die Aktivität von Promotoren (s. Versuch 2) oder die subzelluläre Lokalisierung
von Proteinen und deren Dynamik zu analysieren.
       Ökonomisch unmittelbar relevant ist der Anbau von transformierten Nutzpflanzen auf
inzwischen mehr als 100 Millionen Hektar Fläche weltweit. Transgene Nutzpflanzen sind
bisher vor allem Sojabohne (s. unten), Baumwolle, Mais und Raps (Abb. 5), Anwendungen

                                            12
fast ausschließlich Herbizidresistenz und Resistenz gegen Insektenfraß. Diese Beschränkung
hängt zusammen mit der Transformierbarkeit von Nutzpflanzen (Weizen z.B. ist kaum
effizient transformierbar), mit dem Entwicklungsstand der pflanzenphysiologischen
Erkenntnis (z.B. ist das Verständnis der pflanzlichen Stresstoleranz noch zu fragmentarisch,
um transgene Varietäten zu entwickeln, die auch unter Feldbedingungen ökonomisch
interessant sind) und natürlich mit den politisch-ideologisch bedingten Schwierigkeiten bei
der Zulassung eigentlich einsatzbereiter transgener Sorten (s. als Beispiel „Golden Rice“).




                    Abb. 5: Anbau transgener Nutzpflanzen weltweit (Weiler/Nover,
                    Allgemeine und Molekulare Botanik).




                  Abb. 6: Transformation von Arabidopsis thaliana mittels „floral dip“
                  (Weiler/Nover, Allgemeine und Molekulare Botanik).




                                                  13
Pflanzentransformation
       Die Transformierbarkeit von Pflanzen ist art- und sortenabhängig hoch variabel. Im
Detail sind die Ursachen für diese Unterschiede bisher nicht verstanden. Ein wesentlicher
Faktor ist das Wirtsspektrum von Agrobacterium tumefaciens (vor allem dikotyle Pflanzen).
Die Nutzung der Fähigkeit zur natürlichen Genübertragung durch A. tumefaciens stellt mit
Abstand die wichtigste Transformationsmethode dar. Klassisch werden dafür Gewebestücke
wie Blattscheiben oder undifferenziertes Gewebe (Kalli) mit A. tumefaciens infiziert. Ein
Glücksfall für die molekulare Pflanzenphysiologie ist die extrem leichte Transformierbarkeit
von Arabidopsis thaliana durch „floral dip“ (s. Abb. 6). Diese kommt ohne in vitro-Kultur
aus und damit ohne aufwändige Arbeiten unter sterilen Bedingungen.
       Die zweite wichtige Methode ist der Partikelbeschuss. Meist werden dabei unreife
Embryonen beschossen, die dann in vitro zu ganzen Pflanzen regeneriert werden müssen.

Herstellung von DNA-Konstrukten für die Transformation mittels Agrobacterium
       Das Gen von Interesse wird meist in einen Vektor subkloniert, der die für die
Vermehrung in E. coli nötigen Elemente enthält sowie innerhalb der T-DNA-
Bordersequenzen einen selektierbaren Marker und eine Multiple Cloning Site (MCS) (siehe
Abb. 7). Die für die Integration der T-DNA in das Wirtsgenom erforderlichen vir-Gene trägt
ein Helferplasmid des verwendeten Agrobacterium-Stammes. Das Konstrukt wird durch
Restriktion und Ligation hergestellt und in E. coli selektiert. Anschließend werden
Agrobakterien transformiert.




                           Abb. 7: Vektor für die Agrobacterium-
                           vermittelte Transformation. Aus: (Weiler/Nover,
                           Allgemeine und Molekulare Botanik)


Nachweis von Transgenen in Lebensmitteln
        Der Nachweis von rekombinanter DNA (rDNA) in Lebensmitteln wird zurzeit
öffentlich stark diskutiert, da Schwellenwerte für die Kennzeichnung über die
Vermarktbarkeit als Bioprodukt entscheiden. Nicht zu kennzeichnen sind mithilfe von Pilzen
oder Bakterien hergestellte Vitamine und andere Zusatzstoffe, da es sich hierbei juristisch
nicht um Lebensmittel handelt. Außerdem sind diese Stoffe sehr stark gereinigt, und der
Nachweis rekombinanter DNA ist dort meist unmöglich. Daher stehen bisher nur pflanzliche
Lebensmittel wie Sojaprodukte, Mehl oder Öl in der öffentlichen Diskussion und können auch
über Vorschriften reguliert werden. Die Schwellenwerte für eine Kennzeichnung betragen
0,9% bei „erwarteten“ Fremdgenen und 0,5% bei unabsichtlichen Vermischungen. Die Werte

                                               14
sind bezogen auf den Gewichtsanteil an gvO-Material im Lebensmittel und nicht auf den
Anteil rDNA in der Gesamt-DNA. Die Nachweisgrenze liegt etwa bei 0,1%, wobei diese nur
von spezialisierten Labors erreicht wird. Die Schwellenwerte wurden im Gegensatz zu
Schwellenwerten von Pestiziden nicht daran orientiert, welche Menge schädlich sein könnte,
denn ein Schaden durch gvO konnte bisher nicht nachgewiesen werden, sondern an der
technischen Machbarkeit ihrer Einhaltung, z.B. in Mühlen, beim Schiffstransport etc.
       Abgesehen von den bereits erwähnten durch transgene Mikroorganismen hergestellten
Zusatzstoffen sind Nahrungsmittel aus gvOs bisher in Europa nicht sehr verbreitet. Lediglich
nicht-deklarierte transgene Papayas und Spuren von genverändertem Mais und Soja (in
Bayern waren bei Soja 2005 von 387 Proben 136 positiv, davon aber nur 4 mit einem Anteil
über 0,9%, z.B. auch ein Fertigbrei von Milupa) wurden bislang bei Kontrollen gefunden.
Sehr zuverlässig scheint dagegen der Anteil an genverändertem Soja im Tierfutter zu sein.
       Als Nachweismethode dient grundsätzlich die PCR. Nur sie bietet eine genügende
Empfindlichkeit für sehr geringe Mengen an rDNA. Um die Menge an rDNA auch
quantifizieren zu können, wird normalerweise die Methode der quantitativen Real-Time-PCR
(qPCR) verwendet. Hierbei gibt es zwei Hauptmethoden, die Bildung des Produkts über
Fluoreszenz zu verfolgen: die Färbung doppelsträngiger DNA (dsDNA) durch den
Fluoreszenzfarbstoff SYBR-Green oder die Verwendung fluoreszenzmarkierter Sonden (z.B.
Taq-Man-Sonden oder molekulare Beacons).


3.2 Versuchsdurchführung
       Ziel diese Versuchsteil ist es einen Einblick in einige Pflanzentransformation
Methoden (indirekter Gentransfer mittels Agrobacterium) zu bekommen. Darüber hinaus soll
die Detektion von rDNA in Lebens- bzw. Futtermitteln demonstriert werden.


Teil 1: Klonierung der zu transformierenden Gene
        Jede Gruppe bearbeitet ihr eigenes Gen welches kloniert werden muss und später per
Agrobakterientransformation in A. thaliana (Kandidatengen) bzw. Tabak (gfp) eingebracht
werden soll. Zuerst wird die codierende Sequenz mittels PCR amplifiziert und anschließend in
einen Vektor kloniert, der eine 35S Promotor trägt. Als Matrize für die PCR dient genomische
DNA, da keines der gewählten Gene ein Intron trägt. Im Anschluss an die PCR wird die
gesamte Reaktion auf ein Gel aufgetragen und die Band mit der richtigen Größe
ausgeschnitten. Dieses Fragment wird aufgereinigt und anschließend in zwei Schritten mit
zwei verschiedenen Enzymen (nacheinander) verdaut. Parallel dazu wird der Vektor ebenfalls
mit beiden Enzymen (nacheinander) verdaut. Zusätzlich wird der Vektor nach dem Verdau
noch dephosphoriliert. Nach Beendigung all dieser Schritte werden die gesamten Ansätze
wieder auf ein Gel aufgetragen, die erhaltenen Fragmente ausgeschnitten und aufgereinigt.
Zur Bestimmung der Mengen-Verhältnisse werden je 2µl der Eluate auf ein weiteres Gel
aufgetragen. Als nächstes wird die Ligation über Nacht bei 14°C durchgeführt (Ansatz 1:
Vektor plus Insert, Ansatz 2 nur Vektor). Je 2µl der Ligation werden dann für die
Transformation kompetenter E. coli Zellen verwendet. Die entstandenen Kolonien werden
mittels Plasmidpräparation und Verdau auf Korrektheit hin überprüft.

 Isolation genomischer DNA (PCI-Methode)
     - 2-3 junge Blätter in flüssigen Stickstoff einfrieren und fein mörsern
     - Zugabe von 1 ml Extraktionspuffer
     - 10 min bei 65 °C inkubieren
     - Zugabe von 300 µl Kalium-Acetat-Lösung

                                              15
     - 10 min bis 1 h auf Eis inkubieren
     - Zentrifugieren: max rpm, 10 min, 4°C
     - von der oberen Phase 800 µl abnehmen und in ein neues Eppi überführen
     - mit 800 µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol versetzen
     - durch Umdrehen der Gefäße mischen (nicht Vortexen !!!)
     - Zentrifugieren: max. rpm, 5 min, 4°C
     - obere Phase in neues Eppi überführen und mit gleichen Volumen an Isopropanol
     versetzen
     - durch Umdrehen der Gefäße mischen (nicht Vortexen !!!)
     - Zentrifugieren: max. rpm, 5 min, 4°C
     - Überstand dekantieren und Pellet mit 70% (v/v) EtOH waschen
     - nach dem Trocknen Pellet in 50 -100 µl Wasser aufnehmen

            * Extraktionspuffer: 100 mM         Tris/HCl pH 8,0
                                 50 mM          EDTA pH 8,0
                                 1,5 % (w/v)    SDS
                                 0,7 % (v/v)    β-Mercaptoethanol

            * Kalium-Acetat-Lösung: 60 ml          5M K-Acetat
                                    11,5 ml        Eisessig
                                    28,5 ml        Wasser

 Klonierungs-PCR (Ansatz 50 µl, Polymerase: Pfu/Taq Gemisch)
      5 µl 10x Pfu-Puffer (wird gestellt)
      1 µl 20 mM dNTPs
      1 µl 20 µM Primer fw
      1 µl 20 µM Primer rev
      1µl   Pfu/Taq-Polymerase
      1µl   gDNA
      40 µl Millipore-Wasser

       PCR-Programm:      96°C    3 min
                          96 °C   30 sec
                          X°C     2 min
                          72°C    Y min 10 Zyklen
                          96°C    30 sec
                          X°C     30 sec
                          72°C    Y min 30 Zyklen
                          72°C    7 min
                          14°C    ∞

 Aufreinigung der Gel-Fragmente
      Laut Herstellerangaben (Promega-Kit)

 Restriktionsverdau
      2 µl      10x Reaktions-Puffer
      0,5 µl Enzym (10 U/µl)
      17,5 µl Gel-Eluat

 Aufreinigung des Verdaus
      Laut Herstellerangaben (Promega-Kit)

                                           16
 Dephosphorilierung (nur bei Vektor durchführen !!!)
     Zu dem Verdau werden folgende Lösungen zugegeben
     2,3 µl 10x CIAP-Puffer
     1 µl CIAP

 Ligation
      Gesamtvolumen 10 µl
      1 µl         10x T4-Ligase-Puffer
      1 µl         T4-Ligase
      ad 10 µl     1 Teil Vektor und 2 Teile Insert (absolute Mengen!)
      Ligieren bei 14°C / mindestens über Nacht

 Transformation von E .coli
   - Zellen vorsichtig auftauen (dürfen nicht warm werden)
   - DNA dazugeben (z.B. 2µl einer Ligation) und kurz mischen
   - mindestens 30 Minuten auf Eis stehen lassen
   - Zellen für 60 s bei 42°C inkubieren (Zeit sehr genau einhalten !!)
   - anschließend sofort auf Eis und für 1-3 Minuten stehen lassen
   - 1 ml LB Medium (OHNE Antibiotikum) zugeben
   - Zellen für 1 h bei 37°C unter leichtem Schütteln inkubieren
   - Zellen abzentrifugieren (6 000 rpm (Eppendorf) für 5 min)
   - Pellet in ca. 70 µl LB-Medium resuspendieren und auf selektive Agarplatten
   ausplattieren
   - Platten über Nacht bei 37°C inkubieren

            * LB-Medium: 5g/L         Hefeextrakt
                         10 g/L       Bacto-Trypton
                         10 g/L       NaCl
                         (15g/L       Agar)

 Plasmidaufreinigung (Easy-Prep)
    - 2-5 ml einer Über-Nacht-Kultur pelletieren (30 sec. bei höchster Geschwindigkeit)
    - den Überstand verwerfen und das Pellet in 100 µl Lysis-Puffer resuspendieren
    - Inkubation 1-2 min auf Raumtemperatur
    - Inkubation 1 min bei 100°C (Wasserbad), dann 5 min auf Eis
    - 10 min bei höchster Geschwindigkeit zentrifugieren
    - 5 µl für Verdau verwenden (das Pellet ist sehr stabil und kann direkt in dem Eppi
       mit eingefroren werden)

       Lysis-Puffer:   10 mM Tris/HCl pH8
                       1 mM EDTA pH8
                       15% w/v Saccharose
                       2 mg/ml Lysozym
                       0,2 mg/ml RNase
                       0,1 mg/ml BSA


Teil 2: Pflanzentransformation
        Eine positive E. coli Kolonie wird erneut über Nacht angezogen und das Plasmid
mittels Promega-Kit aufgereinigt. Diese DNA wird für die Transformation der kompetenten
Agrobakterien verwendet. Nach der Überprüfung der erfolgreichen Agrobakterien-

                                            17
transformation (mittels PCR) erfolgt die Transformation von Tabak Blattscheiben (leaf disc)
bzw. kompletter A. thaliana Pflanzen (floral dip)

 Aufreinigung des Plasmids (hohe Qualität)
      laut Herstellerangaben (Promega-Kit)

 Transformation von Agrobacterium tumefaciens
   - 5 ml Übernacht-Kultur mit entsprechenden Antibiotika (Rif 50µg/ml; Gen 25µg/ml)
   - 2 ml der Übernachtkultur zu 50 ml LB-Medium mit Antibiotika geben
   - Bakterien bei 28°C und 250 rpm bis OD600 von 0,5-1,0 wachsen lassen
   - Kultur in Eis kühlen
   - Zentrifugieren: 3000g , 5 min, 4°C
   - Pellet in 1 ml steriler und eiskalter 20 mM CaCl2 Lösung resuspendieren
   - Aliquots zu 100µl in Eppis überführen und in flüssigen Stickstoff einfrieren

     Protokoll kann hier unterbrochen werden

     - Zellen auftauen und 1 µg Plasmid-DNA zugeben
     - Ansatz bei 37°C für 5 min inkubieren
     - 1 ml LB Medium (ohne Antibiotikum) zugeben und Zellen für 2-4 h bei leichtem
     Schütteln und 28°C inkubieren
     - Zellen abzentrifugieren (6 000 rpm (Eppendorf) für 5 min) in LB resuspendieren und
     auf LB Platten plus Antibiotika ausstreichen (Rif 50µg/ml; Gen 25µg/ml, Km 50 µg/ml)
     - Platten für 2 Tage bei 28°C inkubieren

 Überprüfung der transformierten Agrobakterien
   - ein Teil einer Kolonie in 20 µl Wasser resuspendieren
   - 5 min kochen und anschließend auf Eis
   - Zentrifugieren: max rpm, 2 min, RT
   - 1 µl des Überstandes für Test-PCR einsetzen

 Leaf disc Transformation (Tabak)
    YEP-Medium wird mit einer Agrobakterien-Vorkultur angeimpft und über Nacht bei
    28°C geschüttelt.
    Die dicht gewachsene Bakterienkultur wird in der Kühlzentrifuge sedimentiert (5000g, 15
    min) und nach Dekantieren des Überstands mit MS-Flüssigmedium plus Acetosyringon
    und Silwet (Detergens) resuspendiert und auf die OD546 von 1 eingestellt.
    Blätter von steril angezogenem Tabak werden unter der Sterilbank in ca. 1 cm2 große
    Stücke geschnitten. Die Stücke werden in die Agrobakteriensuspension überführt und dort
    30 min bei RT inkubiert (Cokultur). Ggf. kann kurz Vakuum angelegt werden. Danach
    werden die Stücke auf MS-Medium ausgelegt. Kontrollansatz: Blätter ohne
    Bakteriencokultur auf MS auslegen.
    Nach 2 Tagen werden die Blattstücke mit flüssigem MS-Medium plus Cefotaxim
    gewaschen, auf festes MS-Medium mit Cefotaxim und Kanamycin ausgelegt und am
    Fluoreszenzbinokular die transiente Expression überprüft und mit dem Kontrollansatz
    verglichen. Die Petrischalen werden zunächst im Schwachlicht (2 Tage) und danach im
    Normallicht bei 25°C kultiviert. Nach wenigen Tagen kann man die erste Kallusbildung
    beobachten, nach einigen Wochen die ersten transgenen, über Organogenese entstandenen
    Sprosse.



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               * YEP-Medium: 10 g/L       Pepton
                             10 g/L       Hefeextrakt
                             5 g/L        NaCl
 Floral dip
    - mit einer Übernachtkultur (2 ml) eine 25 ml Vorkultur (YEP plus Antibiotika [Rif
    50µg/ml; Gen 25µg/ml, Km 50 µg/ml]) animpfen
    - am Ende des Tages mit der Vorkultur die Hauptkultur (400 ml YEP plus Antibiotika)
    animpfen und über Nacht bei 28°C inkubieren
    - Zellen abzentrifugieren (4000 rpm, 15 min, RT) und in 5% (w/v) Saccharose
    resuspendieren
    - Lösung mit 0,2 % (v/v) Silwett-77 versetzen und Pflanzen mit dem Blütenstand in
    Agrobakteriensuspension tauchen.
    - Pflanzen abtropfen lass und über Nacht in Dunkelheit halten
    - am nächsten Tag Pflanzen bis zur Samen Reife unter Langtagbedingungen wachsen
    lassen



Teil 3: Nachweis von Transgenen in Lebens- bzw. Futtermitteln
      Da man im Lebensmittelhandel meist noch keine deklarierten Produkte kaufen kann,
werden hier im Versuch Sojaschrot und –Mehl aus dem Futtermittelhandel untersucht.

 DNA-Isolierung (CTAB-Methode)
   - eine Spatelspitze Sojaschrot oder –Mehl (ca. 30 mg) nach Zugabe von 200 µl H2O und
   guter Durchmischung (keine trockenen Stellen mehr) bei 65°C 15 min quellen lassen
   - 500 µl Extraktionspuffer dazugeben und mischen
   - 30 min bei 65°C inkubieren, dazwischen mischen
   - 10 min zentrifugieren, Tischzentrifuge, 14.000 min-1, Überstand in neues RG
   - mit 200 µl Chloroform versetzen und 30 s mischen
   - 10 min zentrifugieren (s.o.)
   - obere Phase in neues RG, doppeltes Volumen CTAB-Präzipitationslösung dazu,
   mischen, 60 min inkubieren
   - 5 min zentrifugieren (s.o.)
   - Niederschlag in 350 µl 1,2 M NaCl-Lösung lösen (Vorsicht, Niederschlag wird glasig
   und löst sich manchmal schlecht! Evtl. bei 65°C lösen)
   - Chloroformieren (350 µl), zentrifugieren, s.o.
   - Überstand in neues RG, mit 0,6-fachem Volumen an Isopropanol fällen
   - 10 min zentrifugieren, s.o. – Vorsicht, Niederschlag rutscht leicht raus!
   -Niederschlag mit 500 µl 70%igem EtOH waschen, kurz zentrifugieren
   - Überstand verwerfen, DNA lufttrocknen (10 min), in 50 µl sterilem Wasser lösen,
   Konzentration und Reinheit mit dem Nanophotometer bestimmen (E260 = 1 entspricht 50
   mg/l DNA, Verhältnis 260/280 zur Abschätzung der Reinheit), 5 µg davon zur
   Qualitätskontrolle auf ein Gel geben (0,8% (w/v)).

          *Extraktionspuffer:   20 g/l      CTAB
                                1,4 M       NaCl
                                0,1 M       Tris-HCl, pH 8
                                20 mM       Na2-EDTA

          *CTAB-Präzipitationslösung:     5 g/l CTAB
                                          40 mM NaCl

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 Real-Time-PCR
    Gesamtvolumen 25 µl
        2,5 µl Puffer
        2 µl   dNTP-Lösung
        1 µl   Fw-Primer (0,75 µM)
        1 µl   Rev-Primer (0,75 µM)
        1 µl   Taq-Man-Sonde (0,2 µM)
        1 µl   Hot-Start Taq-Polymerase
        5 µl   DNA-Template (1 ng/µl)
        12,5   µl Wasser,


      * Für folgende Proben werden Ansätze benötigt:

        1) Amplifikation des Lectin-Gens LE1 (single-copy) (102 bp)
        2) Amplifikation des Fremdgenabschnitts (85 bp)
        3) Leerprobe für Beide

       *Programm:
             94°C, 5 min
             94°C, 15 s
             60°C, 30 s 40 Zyklen

 Gelelektrophorese
    Gel mit 1,5% (w/v) Agarose vorbereiten und je 10 µl des PCR Ansatzes plus Ladepuffer
    auftragen. Marker 20 bp




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