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Formblatt GA by S9AJ32J8

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                ANGABEN ZU DEN VORGESEHENEN
                     GENTECHNISCHEN ARBEITEN

1.   Titel:
     Untersuchung der funktionellen Bedeutung von Adipositas-assoziierten
     Kandidantengenen in humanen Prä- und Adipozyten.




2.   Beschreibung der vorgesehenen gentechnischen Arbeiten
     (Zweck und Zielsetzung, Arbeitsschritte, maximal zu verwendendes Kulturvolumen;
     ggf. Fließschema beifügen)


     In genomweiten Assoziationsstudien (Frayling et al. 2007 Science, Dina et al. 2007
     Nat Genet, Thorleifsson et al. 2009 Nat Genet) konnte ein Zusammenhang
     zwischen verschiedenen Genvarianten und Adipositas hergestellt werden. Ziel der
     beantragten Arbeiten ist es, die Bedeutung dieser Gene auf die Physiologie von
     humanen Fettzellen zu untersuchen. Deshalb sollen verschiedene humane Prä-
     und Adipozyten hergestellt werden, in denen diese Kandidatengene reprimiert bzw.
     überexprimiert werden. Als Modellsystem wird die humane Präadipozytenzelllinie
     SGBS (SGBS = Simpson-Golabi-Behmel Syndrom) (Wabitsch et al. 2000 Int J
     Obes) verwendet. Die Zelllinie zeichnet sich dadurch aus, dass SGBS
     Präadipzoyten in vitro durch Inkubation in einem Hormonmix in reife Adipozyten mit
     Lipideinlagerungen differenziert werden können.


     Mittels der siRNA-Technik (stabile Expression von siRNA) sollen die Adipositas-
     assoziierten Kandidatengene fto (fat mass and obesity associated), rpgrip1l (rpgr
     interacting protein 1-like) und tmem18 (transmembrane protein 18) ausgeschaltet
     werden. Darüber hinaus sollen die Gene in SGBS-Zellen stabil überexprimiert
     werden.




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    Begründung:


        1. Die Differenzierung von Präadipozyten in Adipozyten dauert 2 Wochen. Eine
           transiente Transfektion von siRNAs Oligonukleotiden würde den Zeitraum nicht
           überdauern.
        2. Reife Adipozyten sind sehr fragil, können aufgrund des hohen Lipidgehalts nicht
           pelletiert werden, es empfiehlt sich also die Transfektion von Präadipozyten.
        3. Adipozyten sind terminal differenziert, proliferieren also nicht mehr; zur
           Transfektion von nicht-proliferierenden Zellen bietet sich ein lentivirales System
           an.


        Es soll das „ViraPowerTM Lentiviral Expression System“ der Firma Invitrogen
        verwendet werden. Dabei wird zuerst das jeweils für den speziellen RNA-'knock-
        out' optimierte, korrespondierende doppelsträngige DNA-Fragment in den Vektor
        pENTR/U6 eingefügt. Dieser Vektor gehört zur Klasse der von der gleichen Firma
        vertriebenen Gateway-Vektoren. Diese Klasse von Vektoren erlaubt die Integration
        von Fremd-DNA nicht durch die übliche Kombination Restriktionsendonuklease/
        Ligase, sondern durch Verwendung des Rekombinationssystems des Phagen
        Lambda. Das Schlüsselenzym für die Rekombination stellt die 'Gateway' LR
        Clonase dar. Mittels des Gateway-Systems kann nun leicht die Kassette mit der
        RNAi bwz. der zu überexprimierenden Gene in den lentiviralen Vektor pLenti6/V5-
        DEST Gateway eingefügt werden. Für die Propagation von Plasmiden mit 'inverted
        repeats' stellt Invitrogen den E. coli K12 Stamm StbI3 zur Verfügung. Der
        rekombinante, lentivirale Vektor mit Zeozin-Resistenz wird anschließend mit dem
        sogenannten ViraPower-Extrakt in 293FT Zellen transformiert (Lipofectamin).
        Alle für die Verpackung und Replikation des Lentivirus erforderlichen Gene sind in
        dem Vektor pLenti6/V5-DEST Gateway deletiert; es sind nur die terminalen
        Rekombinationssequenzen und das Verpackungssignal vorhanden. ViraPower
        enthält Expressionsplasmide für die Gene gag/pol und rev und das VSV-G
        Hüllprotein. Diese Proteine sind erforderlich für die Replikation und Verpackung des
        Virus. Die Zelllinie 293FT enthält kein Verpackungssignal. Das VSV-G Hüllprotein
        gewährleistet die Produktion von replikationsdefizienten, rekombinanten Lentiviren
        mit einem sehr breiten Infektionsspektrum für Säugerzellen. Aus dem Überstand
        der 293FT-Transfektion werden gereinigte rekombinante Viren gewonnen. Diese


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        Viren werden nun zur Transfektion der Adipozyten verwendet. Die rekombinanten
        Lentiviren werden stabil im zellulären Genom integriert. Anschließend erfolgt die
        biochemische Analyse physiologischer Parameter.




    3. Eigene Risikobewertung und Einschätzung der Sicherheitsstufe
        (differenziert nach verwendeten Spenderorganismen, zu übertragender DNA,
        Empfängerorganismen, Vektoren, biologischen Sicherheitsmaßnahmen und allen
        entstehenden GVO).
        Für den Fall, dass Organismen oder Vektoren aus der Liste der Geschäftsstelle der
        ZKBS oder bereits eingestufte und bekannte GVO verwendet werden, bitte
        Organismen bzw. Vektoren bezeichnen. In diesem Fall entfällt das Ausfüllen der
        entsprechenden Formblätter GS, GE oder GV.




    3.1 Risikogruppen der Spenderorganismen

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    a) Homo sapiens
         genomische Sequenzen codierend für folgende Proteine

              fat mass and obesity related protein (Fto)
                Genvarianten von FTO sind in mehreren genomweiten
               Assoziationsstudien als mit Adipositas assoziiert beschrieben. Molekular
               fungiert das Protein als 2-Oxoglutarat-abhängige Demethylase (Gerken et
               al. Science, 2007. 318(5855)).

              RPGR-interacting protein 1-like (Rpgrip1l)
               RPGRIP1l ist ein Strukturprotein im Basalkörper von zellulären Cilien.
               Defekte in diesem Protein sind ursächlich für das Joubert-Syndrom Typ 7
               (Devuyst Nephrol Dial Transplant 2008; 23)

              Transmembranprotein 18 (Tmem18)
               TMEM18 ist ein Transmembranprotein und agiert als Faktor für die
               Zellmigration (Jurvansu et al. Cancer Res 2008; 68(12).
                                                                   Risikogruppe 1

    b) Humanes Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1)
         subgenomische Sequenzen                                   Risikogruppe 3**

    c) Vesikuläres Stomatitis Virus                                Risikogruppe 2
         (VSV-G-Glykoprotein)


    3.2 Risikogruppen der Empfängerorganismen

    a) E. coli K12 One Shot TOP10 (Invitrogen)
           mit
       dem Vektor pENTR™/H1/T0 (Klonierungssystem Gateway® (Invitrogen))

        „Entry-Vektor“ mit pUC-Origin, H1/T0-Promotor, SV40 früher Promotor und SV40
        Origin, SV40 Polyadenylierungs-Signal, EM7 Promotor, T1- und T2 Terminator,
        Polymerase III-Transkriptionsterminator, M13 reverse priming site,
        Rekombinationsstellen attL1 und attL2 und den Kanamycin- und Zeocin™-
        Resistenzgenen.

           Oder mit
        dem Vektor pENTR™/D-TOPO (Klonierungssystem Gateway® (Invitrogen))

                                                                   Risikogruppe 1

        „Entry-Vektor“ mit pUC-Origin, T7-Promotor, T1- und T2 Terminator,
        Rekombinationsstellen attL1 und attL2 und dem Kanamycin-Resistenzgen

        b) E. coli K12 One Shot Stbl3™ (Invitrogen)
        mit
        pLenti6/V5-DEST™ (Invitrogen)


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        HIV-basierender lentiviraler Expressionsvektor mit pUC-Origin, RSV-
        Enhancer/Promotor, HIV-1 5’LTR, HIV-1-Verpackungssignal Ψ, HIV-1-rev
        responsive element (RRE), CMV-Promotor, Rekombinationsstellen attR1 und
        attR2, V5-Epitop, SV40 früher Promotor und SV40 Origin, EM7-Promotor
        (synthetischer prokaryotischer Promotor), ΔU3/HIV-1 3’LTR, SV40-
        Polyadenylierungssignal, Blasticidin-, Chloramphenicol- und Ampicillin-
        Resistenzgen sowie dem ccdB-Gen.

        Die Deletion der 3’LTR-Region (ΔU3) führt nach der Infektion der Zielzellen zu
        einer Selbstinaktivierung.
                                                               Risikogruppe 1

        c) Zellen der Verpackungszelllinie 293FT                   Risikogruppe 1

        Derivat der etablierten Zelllinie 293; stabil transfiziert mit dem großen T-Antigen
        aus SV40 unter Kontrolle eines CMV-Promotors. Die Zellen exprimieren zudem
        zudem das Neomycin-Resistenzgen unter Kontrolle eines frühen SV40
        Enhancers/Promotors.

        mit

        dem Lentiviralen Expressionssystem ViraPower™ (Invitrogen), bestehend aus
        den pUC-abgeleiteten Vektoren:

        pLP1 (liefert Proteine Gag, Pol)

        Verpackungsplasmid mit pUC-Origin, HIV-1 gag/pol Sequenzen unter der
        Kontrolle des CMV-Promotors, HIV-1-REV responsive element (RRE) erlaubt
        Rev-abhängige Expression der gag und pol-Gene,´
        Ampicillin-Resistenzgen

        pLP2 (liefert Regulatorgen Rev)
        Verpackungsplasmid mit pUC-Origin und Ampicillinresistenzgen; pLP2 kodiert für
        HIV-1 Rev-Protein unter Kontrolle eines RSV-Promotors. Das Rev-Protein
        interagiert in den Verpackungszellen mit dem RRE-Element aud pPL1 und
        induziert die Expression von gag und pol; zudem unterstützt es den nukleären
        Export ungespleißter viraler RNAs zur Verpackung in Viruspartikel.

        pLP/VSVG

        Verpackungsplasmid mit pUC-Origin und Apicillin-Resistenzgen; kodiert für VSV-
        G Glykoprotein unter Kontrolle eines CMV-Promotors, ersetzt die HIV-1
        Hüllproteine und ermöglicht ein breites Wirtsspektrum.

        pLenti6/V5-DEST™ (Invitrogen)

        HIV-basierender lentiviraler Expressionsvektor mit pUC-Origin, RSV-
        Enhancer/Promotor, HIV-1 5’LTR, HIV-1-Verpackungssignal Ψ, HIV-1-rev
        responsive element (RRE), CMV-Promotor, Rekombinationsstellen attR1 und
        attR2, V5-Epitop, SV40 früher Promotor und SV40 Origin, EM7-Promotor
        (synthetischer prokaryotischer Promotor), ΔU3/HIV-1 3’LTR, SV40-


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        Polyadenylierungssignal, Blasticidin-, Chloramphenicol- und Ampicillin-
        Resistenzgen sowie dem ccdB-Gen.

        Die Deletion der 3’LTR-Region (ΔU3) führt nach der Infektion der Zielzellen zu
        einer Selbstinaktivierung.
                                                           Risikogruppe 1

        d)     Zellen der Präadipozyten-Zelllinie SGBS

             Humane Präadipozytenzelllinie (SGBS = Simpson-Golabi-Behmel Syndrom)
             (Wabitsch et al. 2000 Int J Obes), die sich durch Inkubation mit einem Hormonmix
             in reife Adipozyten mit Lipideinlagerungen differenzieren lässt. Die Zelllinie ist der
             Risikogruppe 1 zuzuordnen: sie gibt keine Organismen einer höheren
             Sicherheitsstufe ab und ist routinemäßig auf die Abwesenheit von HBV, HCV und
             HIV virologisch überprüft.
                                                                 Risikogruppe 1

        3.3 Risikogruppen der gentechnisch veränderten Organismen

        a)     E. coli K12 One Shot TOP10 (kompetente Zellen, Invitrogen)

        mit den unter 2 genannten Vektoren

        mit synthetisch hergestellten Oligonukleotiden, korrespondierend zur siRNA von
        Adipositas-assoziierten Targetgenen (fto, rpgrip1l, tmem18) bzw. genomischen
        Sequenzen der genannten Gene.
                                                              Risikogruppe 1


        b)     E. coli K12 One Shot Stbl3™ (kompetente Zellen, Invitrogen)

        mit den unter 2 genannten Vektoren

        mit synthetisch hergestellten Oligonukleotiden, korrespondierend zur siRNA von
        Adipositas-assoziierten Targetgenen (fto, rpgrip1l, tmem18) bzw. genomischen
        Sequenzen der genannten Gene, nach gerichteter Rekombination aus dem
        Eingangsvektor pENTR™/H1/T0 bzw. pENTR™/D-TOPO in den lentiviralen
        Destinationsvektor pLenti6/V5-DEST™ (Invitrogen)
                                                              Risikogruppe 1

        c)     Zellen der Verpackungszelllinie 293FT

        transfiziert mit den unter 2 beschriebenen Vektoren des lentiviralen
        Expressionssystems

        mit synthetisch hergestellten Oligonukeotiden, korrespondierend zur siRNA von
        Adipositas–assoziierten Kandidatengenen (fto, rpgrip1l, tmem18) bzw.
        genomischen Sequenzen der genannten Gene
                                                         Risikogruppe 2

        d)     rekombinante, replikationsdefiziente Lentiviren

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        abgegeben von den unter 4 genannten GVO
                                                          Risikogruppe 2


        e)   Zellen der Präadipozyten-Zelllinie SGBS

        infiziert mit den unter 4 genannten rekombinanten, replikationsdefizienten
        Lentiviren
                                                        Risikogruppe 2

        Wenn sichergestellt ist, dass die infizierten Zellen nicht mehr mit den zur Infektion
        verwendeten Viren kontaminiert sind und keine Viren abgeben
                                                           Risikogruppe 1

        Begründung:

        zu 3.3 a) und b)
        Es werden subgenomische Nukleinsäureabschnitte aus Spenderorganismen der
        Risikogruppe 1 bzw. charakterisierte synthetische Nukleinsäurefragmente in E.
        coli K12 eingeführt. Die aus den Spenderorganismen überführten Nukleinsäuren
        sind ohne pathogenes Potential. Dem Empfängerorganismus wird kein
        pathogenes Potenzial verliehen.

        zu 3.3 c) und d):
        In Zellen der Zelllinie 293FT werden subgenomische Nukleinsäureabschnitte aus
        Spenderorganismen der Risikogruppe 2 und 3 bzw. charakterisierte
        synthetische Nukleinsäurefragmente in E. coli K12 eingeführt. Die aus den
        Spenderorganismen überführten Nukleinsäuren sind ohne pathogenes Potential,
        besitzen aber z.T. regulatorische Funktionen. Die in den Zellen gebildeten und
        von diesen abgegebenen Viruspartikel sind für menschliche Zellen infektiös und
        daher der Risikogruppe 2 zuzuordnen.

        zu 3.3. e):
        Charakterisierte, subgenomische Nukleinsäureabschnitte ohne pathogenes
        Potential, aber z.T. mit regulatorischer Funktion, werden mit Hilfe rekombinanter,
        replikationsdefekter, pseudotypisierter Lentiviren der Risikogruppe 2 in Zellen
        der Risikogruppe 1 übertragen. Der Replikationsdefekt wird von den Zellen nicht
        komplementiert. Die eingeführten Nukleinsäuren werden ins Wirtsgenom
        integriert.

        Wenn nach einer hinreichenden Zahl von Passagen sichergestellt ist, dass die
        infizierten Zellen nicht mehr mit den zur Infektion verwendeten Viren kontaminiert
        sind und keine Viren abgeben, können sie der Risikogruppe 1 zugeordnet
        werden.


        3.4 Einschätzung der gentechnischen Sicherheitsstufe

        a)        zu 3.3 a) und b)
                                                                  Sicherheitsstufe 1

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        b)        zu 3.3 c) und d)
                                                                   Sicherheitsstufe 2

        Begründung:
        Die Empfängerorganismen sind Organismen der Risikogruppe 1.

        Vektoren und die aus den Spenderorganismen überführten Nukleinsäuren sind
        soweit charakterisiert, dass die gentechnisch veränderten Organismen das
        Gefährdungspotential von Organismen der Risikogruppe 2 nicht überschreiten
        und keine Organismen höherer Risikogruppen abgeben.
        Die gentechnisch veränderten Organismen geben Viren der Risikogruppe 2 ab.

        c)        zu 3.3 e)
                                                                   Sicherheitsstufe 2 und
        1

        Begründung:
        Die Empfängerorganismen sind Zellen der Risikogruppe 1.

        Diese wurden mit gentechnisch veränderten Organismen (replikationsdefekten,
        pseudotypisierten Lentiviren) der Risikogruppe 2 infiziert. Die übertragenen
        Nukleinsäuren sind soweit charakterisiert, dass die gentechnisch veränderten
        Organismen nach einer vorläufigen Risikobewertung Organismen der
        Risikogruppe 2 nicht überschreiten und keine Organismen höherer
        Risikogruppen abgeben.

        Wenn sichergestellt ist, dass die infizierten Zellen nicht mehr mit den zur Infektion
        verwendeten Viren kontaminiert sind und keine Viren abgeben, können die
        Arbeiten mit diesen Organismen unter Sicherheitsmaßnahmen der Stufe 1
        durchgeführt werden.




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