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									        Hidrólise Enzimática do Efluente proveniente de
     Frigorífico Avícola utilizando Lipase de Candida rugosa
        Ernandes Benedito Pereira1, Heizir Ferreira de Castro2, Agenor Furigo Junior1
 1
     Universidade Federal de Santa Catarina – Departamento de Engenharia Química e Engenharia de Alimentos-
      Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis-SC, E-mail: ernandes@enq.ufsc.br
               2
                 Faculdade de Engenharia Química de Lorena – Departamento de Engenharia Química
                        Laboratório de Biocatálise, Caixa Postal 116, 12600-970, Lorena/ SP.


Estudos anteriores operando com efluentes gerados em frigoríficos avícolas e lipase
microbiana de Candida rugosa indicaram que porcentagens de hidrólise mais elevadas foram
alcançadas em efluentes tamponados no pH ótimo de atuação dessa preparação enzimática
(solução tampão de fosfato de sódio 0,1M; pH 7,0). Para verificar a influência das variáveis:
concentração de enzima, agente emulsificante e íons cálcio no desempenho da hidrólise dos
lipídeos foi proposto um planejamento fatorial completo 23, considerando como variável
resposta porcentagem de hidrólise após 3 horas de tratamento. Os resultados obtidos indicam
uma influencia significativa da concentração da enzima e do agente emulsificante,
independente da concentração de íons cálcio. A hidrólise foi maximizada (20,87%)
empregando uma concentração de 0,4% m/v de enzima e 3% m/v do agente emulsificante. O
ajuste do pH do efluente pela adição de NaOH ou NaHCO3 em substituição a solução tampão
e após 12 horas de tratamento elevou a porcentagem de hidrólise dos lipídeos para 35%.


                                               INTRODUÇÃO

        Nas duas últimas décadas inúmeros melhoramentos no processo anaeróbio de efluentes
de indústrias alimentícias têm sido realizados, principalmente para tratamento de águas
residuárias da produção de açúcar, amido e cerveja (Hu et. al., 2001). Entretanto, para alguns
efluentes contendo elevados teores de óleos e gorduras, como os provenientes de frigoríficos,
abatedouros, laticínios, enlatados, entre outros, a operação de reatores de digestão anaeróbia
apresenta inúmeros problemas operacionais como formação de escuma pelas camadas de
lipídeos, formação de caminhos preferenciais no leito de lodo e arraste da biomassa, levando a
perda da eficiência e até mesmo ao colapso do reator (Leal, 2000; Hu et al., 2001). Os reatores
anaeróbios situados à jusante de unidades fabris são, portanto, suscetíveis à alimentação de
efluentes com teores de gordura acima dos recomendáveis. No caso específico dos reatores
UASB recomenda-se um teor de gordura no efluente não ultrapasse valores da ordem de 150
mg/L (Leal, 2000).
        Técnicas para melhorar a eficiência dos biodigestores, incluem instalação de caixas de
gordura ou flotadores, tratamentos com adição de álcalis ou enzimas específicas como as
hidrolases, principalmente as lipases (glicerol éster hidrolases, EC 3.1.1.3) cuja função
biológica é a hidrólise de ligações éster carboxílicas presentes em acilgliceróis com
conseqüente liberação de ácidos graxos e glicerol. As lipases apresentam uma importância
particular, pelo fato de hidrolisarem especificamente os óleos e gorduras, o que pode ser de
grande interesse para o tratamento de efluentes com alto teor de lipídeos. Esse tipo de
tratamento apresenta algumas vantagens, tais como a especificidade que permite controlar os
produtos, o que leva a um aumento dos rendimentos pela não-geração de subprodutos tóxicos;
condições moderadas de operação, redução do custo em termos de energia e de equipamentos
tornando este processo atrativo sob o ponto de vista ambiental (Masse et al., 2001).
        Estudos anteriores (Pereira et al., 2002) operando com efluentes gerados em
frigoríficos avícolas e lipase microbiana de Candida rugosa revelaram porcentagens de
hidrólise mais elevadas em meios reacionais ajustados ao pH ótimo de atuação dessa
preparação enzimática, (tampão fosfato 0,1M, pH 7,0). Tomando por base esses resultados e
considerando as inúmeras variáveis envolvidas nesse procedimento, optou-se pelo uso da
ferramenta do planejamento experimental para determinar as condições ótimas na hidrólise
para remoção de gorduras dos resíduos gerados pela indústria de abate de frango pela
preparação comercial de lipase de Candida rugosa.


                                2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Materiais
         Todos os experimentos foram realizados com uma preparação de lipase microbiana
(Candida rugosa) disponível comercialmente (tipo VII, Sigma Co, EUA) com atividade
lipolitíca de 1830 U/ mg (Pereira et al., 2002). O efluente foi obtido da indústria frigorífica de
abate de frango (Indústria Macedo Koerich, Florianópolis/ SC) e coletado em um único ponto
antes de ser conduzido à Estação de Tratamento (Entrada do Flotador). O efluente foi
guardado em recipientes de plásticos de 5 L limpo não esterilizado e armazenado em freezer a
0ºC, para conservação das suas características até sua efetiva utilização.

2.2. Métodos Analíticos
        O efluente foi caracterizado segundo normas recomendas por métodos oficiais
(Standard Methods, 1995). O teor de óleos e graxas foi determinado por extração em Soxhlet
com hexano como solvente. A concentração de ácido graxo livre foi determinada por titulação
de alíquotas dissolvidas em 10 mL de etanol p.a, empregando-se solução alcoólica de KOH
0,02N. A demanda química de oxigênio (DQO) foi medida pelo Método Colorimétrico de
Refluxo Fechado (Hach). A alcalinidade foi medida sem uma separação dos sólidos em
suspensão, titulando-se a amostra com ácido sulfúrico 0,02 N até pH = 3,7. A acidez foi
determinada por via titulométrica, utilizando-se solução de NaOH 0,1 N, necessários para
neutralizar os ácidos livres de uma grama da amostra. O resultado foi expresso em
porcentagem de ácido graxo livre. O índice de saponificação foi calculado a partir da
composição em ácidos graxos, em função da definição do índice, que corresponde ao número
de miligramas de hidróxido de potássio necessário para neutralizar os ácidos graxos
resultantes da hidrólise de 1 g da amostra, e é inversamente proporcional ao peso molecular
dos ácidos graxos dos glicerídeos presentes (Moretto et al., 1998).

2.3. Delineamento Experimental
        Para verificar a influência das variáveis: concentração de enzima (x1), do agente
emulsificante (x2) e íons cálcio (x3) na porcentagem de hidrólise enzimática do efluente foi
adotada a metodologia do planejamento experimental empregando uma matriz 23. Foram
realizados ensaios adicionais no ponto central para estimar o erro experimental. A variável
resposta considerada foi a porcentagem de hidrólise. Os níveis utilizados na matriz foram
selecionados com base nos resultados obtidos anteriormente (Pereira et al., 2002), conforme
mostrado na Tabela 1. A análise estatística dos resultados foi realizada utilizando-se o
programa STATISTICA versão 6.0.




                                                                                                2
Tabela 1. Níveis das variáveis utilizados no planejamento fatorial completo 23
Variáveis                                                             Níveis
                                                        Mínimo        Médio        Máximo
                                                          (-)          (0)           (+)
Concentração de lipase [E] (% m/v)                       0,1          0,25           0,4
Concentração de agente emulsificante [AE] (% m/v)          0           1,5            3
Concentração de CaCl2 (M)                                  0          0,01          0,02

       As hidrólises foram realizadas em frascos de 250 mL contendo 100 gramas de
efluente, 40 mL de solução tampão de fosfato de sódio (0,1M, pH 7,0) e quantidades
apropriadas de enzima, agente emulsificante (goma arábica) e cloreto de cálcio. Os frascos
foram incubados por um período máximo de 6 horas numa temperatura de 40C, com agitação
magnética (200 rpm). Periodicamente foram retiradas amostras e quantificados os teores de
ácido graxo por titulação com KOH 0,02N usando fenolftaleína como indicador. A
porcentagem de hidrólise foi calculada pela determinação da concentração de ácidos graxos
formado durante a reação de hidrólise dos triglicerídeos presente no substrato, de acordo com
a equação 1 (Rooney et al., 2001).
                                    V * N KOH  MM
                    % Hidrólise  KOH                  *100             (1)
                                         m* f
onde: VKOH = volume de KOH da amostra (mL); NKOH= normalidade do KOH (0,02 N);
MM= massa molecular média dos ácidos graxos no efluente (318,3); m= massa da amostra; f
= fração de óleo e graxas (48,3 g/L).


                            3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1. Caracterização Química do Efluente
        A composição química de um determinado efluente pode variar de acordo com a hora
da coleta, estação do ano, lavagem, entre outros. Em efluentes provenientes de frigoríficos de
abate de frangos, além de lipídeos, vários outros componentes, provenientes do processo
industrial de escaldagem e depenagem, da lavagem do frango, das vísceras, dos equipamentos,
dos pisos e outros, podem estar presentes, tais como amônia e fosfato.
        Na Tabela 2 encontram-se alguns dos compostos presentes no efluente usado nesse
estudo. Os valores encontrados para os diversos componentes analisados, indicam que a
composição química está dentro dos limites de variação esperada. O valor encontrado para o
índice de saponificação (IS = 188,60 mg KOH/g) é similar aos valores normalmente
encontrados nos óleos origem animal (160-193). O índice de saponificação comprova a
presença de composto insaturado, sendo de extrema importância no cálculo da massa
molecular média dos ácidos graxos do efluente. A massa molecular do efluente determinada
foi de MM=318,3 g/mol. O índice de acidez de 3% está acima do valor esperado dos óleos em
geral, os quais devem apresentar valores máximos de acidez de 1,5%. Observa-se ainda que o
efluente apresenta uma alta carga orgânica expressa em termos de demanda química de
oxigênio (39296 ppm), fato normalmente verificado em efluentes com elevados teores de
gorduras.




                                                                                            3
Tabela 2. Composição química do efluente

                Análise                       Resultado
pH                                                6,2
Acidez (%)                                        3,0
Alcalinidade (mg CaCO3/L)                        75,1
DQO (mg/L)                                      3.930
Amônia (mg/L)                                    17,4
Fósforo total (mg/L)                             7,30
Fosfato total (mg/L)                            80,70
Índice de saponificação (mg KOH/g)              188,6
Massa molecular (aproximada) (g/mol)            318,3
Óleos e graxas (g/L)                             48,3
Massa específica (g/mL)                          0,92
Ácidos graxos livres (%)                         53,6
Ácido oléico (%)                                 14,4


3.2. Hidrólise Enzimática
        Na Tabela 3 encontram-se os resultados obtidos nos ensaios realizados com base no
planejamento fatorial 23, para avaliação das variáveis: concentração de lipase (x1), agente
emulsificante (x2) e íons cálcio (x3) na formação de ácidos graxos (mM) e porcentagem de
hidrólise alcançada após 3 h de tratamento enzimático.

Tabela 3 – Matriz do planejamento fatorial completo 23 para a lipase de Candida rugosa

    Ensaio                    Valores reais                             Resposta
                     [E]          [AE]          [CaCl2]        Hidrólise     Ácidos graxos
                      %             %             M              (%)        formados (mM)
       1              0,1           0              0              8,1            10,0
       2              0,4           0              0             16,1            20,0
       3              0,1           3              0             13,7            17,0
       4              0,4           3              0             19,4            21,0
       5              0,1           0            0,02             7,3             9,0
       6              0,4           0            0,02            10,5            13,0
       7              0,1           3            0,02            16,1            15,0
       8              0,4           3            0,02            22,6            28,0
       9             0,25          1,5           0,01            12,9            16,0
      10             0,25          1,5           0,01            14,5            18,0
      11             0,25          1,5           0,01            11,3            14,0

        A liberação de ácidos graxos variou entre 10 mM a 28 mM, correspondendo a
porcentagens de hidrólise entre 8,1 a 22,6%. Verifica-se que a formação de ácidos graxos foi
dependente da concentração de lipase e do agente emulsificante. A suplementação de íons
cálcio no meio reacional não apresentou efeito significativo, provavelmente devido à presença
de cálcio na goma arábica, tornando desnecessário o uso de CaCl2. De uma maneira geral, a




                                                                                           4
reação de hidrólise foi favorecida para meios reacionais emulsificados com goma arábica e
concentração de lipase nos níveis máximos.
         Na Tabela 4 reúne os dados da análise dos efeitos, erros-padrão e do teste t de
Student’s. Verifica-se que apenas a variável concentração de íons cálcio (x3) não foi
estatisticamente significativa num nível de 95% de confiança (p=0.88). Tanto o efeito da
variável x1 como x2 apresentaram valores similares (5,85 e 7,45) e significativos ao nível de
99% de confiança, sendo selecionados para estimativa do modelo matemático que descreve o
processo de hidrólise na região experimental estudada.

Tabela 4. Estimativas dos efeitos, erros padrão e teste t de Student´s para a porcentagem de
hidrólise do efluente, de acordo com o planejamento fatorial completo 2 3.
      Variáveis        Efeitos        Erro-padrão        Valores de t       Valores de p
 Média                  13,86             0,54             25,63
 Enzima (x1)             5,85            1,27*             4,61*              0,001*
 Goma (x2)               7,45            1,27*             5,87*              0,004*
 CaCl2 (x3)             -0,20             1,27             -0,16               0,88
 x 1x 2                  0,25             1,27              0,19               0,85
 x 1x 3                 -1,00             1,27             -0,79               0,47
 x 2x 3                  3,00             1,27              2,36               0,08
*p< 0,01

      Os efeitos principais foram ajustados por análise de regressão múltipla para um
modelo linear e a melhor função linearizada, pode ser demonstrada pela equação 2.

                             y = 14,22 + 2,92 x1 + 3,73 x2    (2)

onde: y é a variável resposta, x1 e x2 representam os valores codificados para concentração de
enzima e concentração de agente emulsificante.

         A significância estatística do modelo matemático foi avaliada pelo teste F (Tabela 5),
demonstrando que a regressão é altamente significativa a 99% de nível de confiança e
apresenta um bom coeficiente de determinação (R2=0,94), deste modo, justificando 94% a
variação total da resposta. Segundo Barros Neto et al. (1995), para a regressão não ser apenas
estatisticamente significativa, mas também útil para fins preditivos, o valor de F calculado
deve ser no mínimo 4 vezes maior que o F tabelado. Desta forma, o modelo estatístico
determinado para a porcentagem de hidrólise foi também preditivo.

Tabela 5. Análise de Variância para o modelo fatorial selecionado
    Efeitos         Soma         Graus de       Média                F             p
                  quadrática     liberdade    quadrática
Modelo              179,45            2         89,73            21,48           0,0010
Curvatura             3,83            1          3,83             0,92            0,37
Resíduos             29,25            7          4,18
Falta de ajuste      24,13            5          4,83               1,88          0,38
Erro Puro             5,12            2          2,56
Total               212,53           10




                                                                                             5
3.2. Ajuste do pH com bicarbonato de sódio e hidróxido de sódio
        Empregando as condições estabelecidas anteriormente foi verificada a influência da
substituição da solução tampão de fosfato de sódio por soluções de bicarbonato de sódio e
hidróxido de sódio para ajustar o pH do meio para 7,0. Na presença de bicarbonato de sódio
ou hidróxido de sódio observou-se um aumento na porcentagem de hidrólise estimado em
torno de 35%, caracterizado pela formação de ácidos graxos e glicerol, conforme mostrado na
Tabela 6.

Tabela 6: Parâmetros de caracterização do efluente tratado com Candida rugosa

 Ajuste de            Glicerol                Ácidos Graxos               Demanda Química
    pH                 (%)                      (mM/mL)                       de Oxigênio
                                                                                (mg/L)
                  0h          12 h           0h            12 h            0h           12 h
 Tampão          0,34         0,50          0,25           0,41             -             -
 NaHCO3          0,18         0,28          0,06           0,68           20914        21857
  NaOH           0,25         0,35          0,10           0,65           22557        26646

        Não foi verificada redução da matéria orgânica em termos de DQO. De fato, houve um
pequeno aumento da DQO em 15% após a hidrólise enzimática, provavelmente devido ao teor
de lipídeos no efluente tratado (48,30 g/L). Esses resultados são similares aos descritos por
Jung et al. (2002), nos tratamentos efetuados em efluentes contendo teores de gorduras da
ordem de 800 mg/L. Apesar disso, o tratamento enzimático foi bastante satisfatório,
promovendo a hidrólise parcial dos lipídeos presentes no efluente.


                                         4. CONCLUSÕES

        Neste trabalho foi verificado o efeito de diferentes condições operacionais na
porcentagem de hidrólise dos lipídeos presentes no efluente de abate de frangos. O
monitoramento da hidrólise foi realizado por meio da quantificação dos ácidos graxos livres
em função do tempo de reação. O uso do planejamento fatorial mostrou ser uma ferramenta
importante para otimizar as condições de hidrólise desse efluente pela lipase de Candida
rugosa. De acordo com o modelo matemático proposto, porcentagens de hidrólises mais
elevadas (20,87%), podem ser obtidas empregando uma concentração de enzima de 0,4%
(m/v) em presença de agente emulsificante (3% m/v). A substituição da solução do tampão
fosfato por solução de NaHCO3 ou NaOH, elevou o grau de hidrólise para 35%.


Agradecimentos: A FAPESP e CNPq pelo suporte financeiro.


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