Produits et mat�riels utilis�s

							UTILISATION DU SEQUENCEUR D’ADN 16 CAPILLAIRES
       Les échantillons devront être présentés sur des microplaques PCR Applied
Biosystems dont la référence est : N8010560
       Le nombre d’échantillons devra dans la mesure du possible être un multiple de 16
       En sachant que l’appareil peut passer deux plaques de 96 ou 384 puits
       (pour un nombre restreint de séquence ou multiples incomplets, me contacter)
       Lors de la réservation n’oublier pas de me préciser si ces échantillons sont :
                        -des séquences, alors préciser la longueur attendue et le kit de
                        séquençage utilisé
                        -des analyses de fragments, alors préciser les marqueurs utilisés et le
                        standard

NB :Pour une gestion simple et économique du séquenceur il est souhaitable que je
connaisse plusieurs jours à l’avance (une semaine serait idéale) votre nombre approximatif de
séquences à passer.
     Préparation des échantillons :
             Vous pouvez garder votre protocole habituel jusqu’à la réaction de séquence
             comprise. Cependant, j’attire votre attention sur la qualité des purifications
             des réactions de PCR. C’est un élément important pour une séquence de
             qualité. (le choix d’une purification sur colonne est la meilleure méthode,
             malheureusement la plus onéreuse, sauf avec le gel P 100 fine de Biorad à
             utiliser avec les microplaques multiscreen de Millipore)
             Par contre la purification des réactions de séquences devra être plus
             soignée.


             Je vous présente un protocole avec microplaque que j’utilise
             personnellement




     Protocole de purification des réactions de séquences
             (éliminations des fluorochromes libres)
   1-sur microplaques :

            Produits et matériels utilisés :


    -Séphadex G50 superfine (Amersham, ref : 17-0041-01). Faire une solution à 50g dans
          1L d’eau milliQ et stocker à 4°C (bien agiter avant emploi)
    -Microplaques de filtration multiscreen 0,45µM(millipore, ref :MAHVN45-10)
    -Joint d’assemblage (millipore, ref : MACF 096-04)
    -microplaque de récupération (Dutscher, ref 3798)
    -Microplaque type PCR (AplliedBiosystems, ref :N8010560) 96 puits
    -Microplaque 384 puits (AppliedBiosystems, ref : 4316472


          En pratique :


-Adapter une microplaque multiscreen sur une microplaque de récupération à l’aide du
      joint d’assemblage
-ajouter 250 µL de solution de G50 dans autant de puits que d’échantillons
-centrifuger 3 mn à 1500 g
-jeter l’éluat et repositionner la plaque comme précédemment
-ajouter à nouveau 250 µL de solution de G50
-recentrifuger 3 mn à 1500 g
-positionner la multiscreen chargée, sur une autre microplaque de récupération
-déposer votre réaction de séquence (il est préférable que le volume final soit de 20 µL,
      donc compléter de 10 µL d’eau sur les réactions de séquences faites sur 10 µL).
      Attention de bien déposer au centre de la colonne et sans violence pour éviter que la
      solution vienne sur la paroi et passer sur le coté de la résine et non à travers.
-centrifuger 5 mn à 1100 g
-diluer au 1/20 dans de l’eau pour obtenir un volume final situé entre 20 et 40 µL. Ce
      dernier volume est préférable pour éviter une évaporation de la solution aqueuse lors
      de runs programmés d’une journée (dans le cas d’une programmation sur un
      week-end, l’utilisation de formamide ultra pure est préférable, l’évaporation de la
      formamide étant bien plus lente que l’eau).Généralement 38 µL d’eau + 2 µL de
      réaction purifiée Ce mélange peut être réalisé directement sur une microplaque
      AppliedBiosystems qui s’installera directement dans le séquenceur.
-Je pense qu’il est possible de garder ces dilutions congelées jusqu’au passage sur le
      séquenceur, si celui-ci s’avérait saturé.


NB : Les quantités d’ADN à utiliser pour la réaction de séquences étant difficiles à
      estimer, je vous invite à réaliser des essais de concentrations. Cela peut paraître une
      perte de temps, mais en fait cette technique permet de bien dominer ce domaine si
      délicat.Une fois bien défini, il est souvent inutile de revérifier sur gel une estimation
      de la concentration après purification des produits de PCR ou des minipreps Penser
      aussi à utiliser le contrôle du kit, en particulier si les séquences sont négatives




    2- dans des microtubes 0,5 mL :
          -Produits utilisés :
    -Ethanol 95% (Attention à cette concentration. Lors d’une ouverture d’un flacon
          d’éthanol à 99-100 %, celui-ci avide d’eau devient rapidement à une
          concentration à 95 %, voire moindre. Il est préférable de mettre cette solution
          tout de suite à 95 %, forme qui reste stable)
    -Ethanol 70%
    -Acétate de sodium 3M, pH 4,6 (ref Applied : 400320)
            -En pratique :
          -Ajouter dans un microtube, ou une microplaque, 2 µL d’acétate de sodium et
           50 µL d’éthanol 95 % (Attention à l’utilisation de l’acétate de sodium, qui doit
          être parfaitement éliminé pour ne pas créer des pics parasites sur les séquences)
          -Ajouter votre réaction de séquence
          -vortexer et laisser 10 mn à température ambiante (pour V3) ou à 0° C (pour V2)
-Centrifuger 20 à 30 mn à >12000 g en orientant tous les tubes de la même
manière dans la centrifugeuse
-Sans attendre enlever le surnageant à l’aide d’une pompe à vide en prenant soin
de ne pas aspirer le culot d’ADN (non visible)
-Ajouter 500 µL d’éthanol 70 % pour le lavage du culot d’ADN. Celui-ci peut
être réalisé deux fois afin de bien éliminer les sels
-Centrifuger dans les mêmes conditions que précédemment mais seulement 5 à
10 mn. et aspirer le surnageant
-recentrifuger brièvement, pour bien éliminer le surnageant restant sur les parois
-réaspirer le surnageant
-évaporer 1 mn à 94°C. Laisser refroidir et fermer les tubes
-Garder les tubes au congélateur (jusqu’à 10 jours)