Docstoc

Detection Technology for Genetically Modified Crops for .._1_

Document Sample
Detection Technology for Genetically Modified Crops for .._1_ Powered By Docstoc
					     Biotecnología II

Segunda Unidad: Aplicaciones en la
   transformación de Alimentos
           Procesados
2.1 Procesamiento de alimentos a partir de productos
    primarios transgénicos.
   2.1.1 Detección.
      2.1.1.1 Definición de alimentos primarios y secundarios
              transgénicos o genéticamente modificados (GM).
      2.1.1.2 Procedimiento experimental para la detección de
              OGM o moléculas derivadas de ellos, en alimentos.
      2.1.1.3 Métodos para la detección de alimentos GM.
      2.1.1.4 Métodos basados en la detección de proteínas.
      2.1.1.5 Métodos basados en la detección de ADN.
      2.1.1.6 Metodologías aplicables en el futuro
  2.1.1.1 Definición de alimentos primarios y secundarios
          transgénicos o genéticamente modificados (GM).


     ¿Qué es un alimento Transgénico?

- Primario: Es un alimento que contiene al menos un
  gen introducido por el hombre mediante métodos
  biotecnológicos (OGM).

- Secundario: Es un alimento proveniente de al menos
  un OGM.

- El gen introducido puede ser de cualquier origen.
      Cultivos disponibles que han
    sido modificados genéticamente
•   Maíz           •Jitomate         •Alfalfa
•   Soya           •Remolacha        •Tabaco
•   Algodón        •Papaya           •Caña de azúcar
•   Canola         •Papa             •Arroz
•   Coliflor                         •Chiles
                   •Calabaza
       No disponibles aún comercialmente:
    Trigo       Uvas         Piña           Cebolla
    Cebada      Plátanos     Zanahoria      Apio
   La Revolución Biotecnológica
• Las   plantas modificadas genéticamente
  impactaron los campos en el verano de 1996
     • USA, Argentina y Canadá
• Otros países se unieron en 1997:
     • Australia y México
• 1998 - Sudáfrica, España y Francia
• Muchos cultivos GM nuevos han sido
  autorizados para su liberación experimental a
  través de la Unión Europea
     • Por lo tanto se necesita una regulación estricta
La Revolución Biotecnológica
  Área de cultivos GM en Acres




   1        3    4         6
   Distribución mundial de las 10313
liberaciones experimentales de cultivos
2.1.1.2 Procedimiento experimental para la detección de
        OGM o moléculas derivadas de ellos, en alimentos.
    Componentes básicos de
      genes transferidos
-   El ADN transferido por métodos biotecnológicos
    consiste básicamente en tres componentes.

    1. Una secuencia que regula la transcripción del gen
       codificante (promotor).

    2. El gen codificante.

    3. Una secuencia         que   marca   el   fin   de   la
       transcripción.
Las secuencias blanco para la detección por PCR de secuencias de
ADN transgénico en alimentos GM, tienen el siguiente orden de
especificidades:
1 = baja especificidad; 4 = evento específico de la transformación
Determinación de la presencia en alimentos de
     OGM o de sus productos derivados
1. Colecta de las muestras a analizar.
2. Homogeneización de las muestras.
3. Adición de amortiguadores para el aislamiento de ADN, de
   ARN o de proteínas.
4. Detección de ADN, de ARN o de proteínas transgénicas.
    • ADN:
        • Amplificación por PCR de secuencias blanco.
        • Detección por Southern blot de secuencias blanco.
    • ARN:
        • Amplificación por RT-PCR de secuencias blanco.
        • Detección por Northern blot de secuencias blanco.
    • Proteínas:
        • Western Blot
        • ELISA.
5. Identificación y cuantificación de la molécula detectada.
6. Interpretación y reporte de resultados.
Protocolos de Transformación de Plantas
                 • Métodos Físicos de Transformación
                    • Choque osmótico
                    • Electroporación
                    • Microinyección
                    • Filamentos de carbono
                    • Biobalística
                 • Transformación Directa
                    • Escisión Apical
                    • Transformación del Polen
                 • Transformación Biológica
                    • Transferencia mediada por la
                      bacteria Agrobacterium
                      tumefaciens.
                    • Virus (TMV, CMV, ACMV)
          ¿Cómo hacer un cultivo GM?
1   Se necesita un sistema de regeneración de cultivos de tejidos
    vegetales.
2   Regeneración de las células transformadas.

Los requerimientos de medios de cultivo son difíciles de determinar.
Debe aplicarse un balance de señales hormonales adecuado en el
momento justo para la regeneración de plantas completas.
Pasos de la Transformación de Plantas
        Cuantificación de OGM
• La Unión Europea ha implementado un “nivel umbral
  mínimo” para el marcaje de alimentos GM.

• La “regulación umbral” especifica que los productos
  alimentarios deben ser etiquetados como GM siempre que
  los ingredientes contengan productos derivados de
  organismos GM en una proporción superior al 1%,
  considerados individualmente.

• Deberán implementarse métodos eficientes       para   la
  detección en alimentos altamente procesados.
        Procedimiento Operativo para la detección,
identificación y cuantificación de OGM, de acuerdo con la
     regulación de etiquetación de la Unión Europea
      Aspectos de la Cuantificación
• Muestreo y preparación de la muestra
   – El procedimiento determina la representatividad del resultado.
   – Evaluar el tamaño de la muestra, su homogeneidad y el umbral.


• Deben cumplirse requerimientos estadísticos
   – Las matrices requeridas dependerán del tipo de material
      • Materiales sin procesar, como granos.
      • Ingredientes procesados.
      • Alimentos procesados.
2.1.1.4 Métodos de Análisis basados
    en la detección de proteínas
• Los transgenes codifican proteínas nuevas
• Las técnicas inmunológicas utilizan anticuerpos
  – Ideales para necesidades cualitativas y cuantitativas
  – Detectan proteínas específicas en matrices complejas
     • El analito debe ser conocido.
     • Puede haber interferencia por interacciones no específicas con
       otras proteínas, con sulfactantes (saponinas), con fenoles, con
       ácidos grasos y con fosfatasas.
• Anticuerpos policlonales
  – El reconocimiento es muy sensitivo pero es menos
    específico.
• Anticuerpos monoclonales
  – El reconocimiento es altamente específico, pero es menos
    sensible.
               Western Blot
• Prueba cualitativa altamente específica.
• Puede determinar si hay niveles por debajao o superiores
  del umbral mínimo de OGM.
• Es utilizada principalmente en investigación.
• Usa electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE.
   – Solubiliza y remueve agregados y proteínas adventicias
 • Las proteínas fraccionadas en el gel son
    entonces transferidas a una soporte sólido
    (poliacrilamida o PVDF).
Western Blot, procedimiento
   Ensayo de ELISA en microplaca
• Microplacas cubiertas con anticuerpos
  – Ensayo cuantitativo, altamente sensible, económico,
    permite el manejo de muestras múltiples e ideal para
    análisis de laboratorio
     • Siempre que la proteína esté desnaturalizada
  – Puede detectar 0.25% de OGM en semillas y 1.4% en
    alimentos horneados
       Ensayo de tira de flujo lateral




• Es una variante del método de ELISA, los anticuerpos inmovilizados,
  específicos para las proteínas GM son acoplados a un reactivo colorido e
  incorporados en tiritas de nitrocelulosa.
• Es rápido, económico, portátil y bueno para ensayos iniciales.

                                                                   Ahmed, 2002
  Formato inmunológico-magnético
• Se usan partículas magnéticas como un soporte sólido
   – Están recubiertas del anticuerpo específico y colocadas en un tubo
   – Se separan de la mezcla usando un magneto por fuera del tubo
   – La separación es más rápida y más precisa debido a la alta
     uniformidad de la solución
    2.1.1.5 Métodos basados en el ADN
• Se basa en la complementariedad de las
  hebras del ADN, que hibridan en una
  manera dependiente de la secuencia
• El ADN transgénico posee diversos
  elementos únicos en los cultivos




 •Los elementos típicamente presentes en el ADN transgénico son: una
 secuencia promotora (35S), un gen estructural y una señal de
 terminación de la transcripción (NOS)
                                                  Diagram representative of a
                                                  RoundupReady® sequence
   ADN, preparación de la muestra
Requerimientos para la extracción de ADN
   – La muestra de laboratorio debe ser representativa de la muestra del
     campo o de la muestra alimentaria
   – Tener entre 100 y 350 mg
   – Debe tener una alta calidad
      • El tamaño completo y libre de daños en la secuencia
          – Efectos adversos por el calor, bajo pH, nucleasas, despurinización,
            degradación enzimática, etc.

   – ADN de alta pureza
      • Se afecta por contaminación de las matrices alimentarias
          – Polisacáridos, lípidos, polifenoles y químicos de la extracción del ADN
     Requerimientos para la extracción
                 de ADN

• Ruptura de las paredes celulares
   – Con hielo seco o con nitrógeno líquido
• Desintegración de las membranas celulares
   – Con detergentes como el CTAB o el SDS
• Inactivación de nucleasas
   – Adicionar EDTA (une Mg2+) y proteasas
• Separación de polisacáridos inhibitorios
• Separación de componentes celulares hidrofóbicos
   – E.g.. Lípido y polifenoles
• Separación del ADN del detergente, por medio de
  precipitación con alcohol
                      Southern Blot
• Comienza con el corte del ADN GM por
  medio de enzimas de restricción.
• Fraccionar el ADN en gel de agarosa.
• Transferir a un soporte sólido.
• Hibridar el soporte con una sonda.
• Autorradiografía.
            Principios de la PCR
• Permite la amplificación exponencial de una
  secuencia blanco de ADN.
• La ADN polimerasa hace copias exactas del
  templado.                                       Cycles
                                                     1
                                                           DNA molecules formed
                                                                          -
                                                     2                    1
• Se requieren cebadores sintéticos que:             3                    2
                                                     4                    4
   – Se localizan en los bordes de la secuencia      5                    8
     deseada.                                        6
                                                     7
                                                                         16
                                                                         32
   – Son complementarios a la secuencia del          8
                                                     9
                                                                         64
                                                                        128
     ADN transgénico.                               10                  256
                                                    11                  512
• El número de copias de la secuencia blanco        12
                                                    13
                                                                      1,024
                                                                      2,048
  crece exponencialmente.                           14                4,096
                                                    15                8,192
   – En teoría…                                     16               16,384
                                                    17               32,768
                                                    18               65,536
Confirmación de la identidad del
 ADN que se ha sintetizado por
        medio de PCR
• Verificación del tamaño por electroforesis en gel de agarosa.
• Verificación del tamaño por medio de ensayos de Southern Blot.
• Verificación del tamaño por medio de PCR anidado, con un 2°
  par de cebadores.
• Secuenciación. Es el único método que no da lugar a dudas.
   PCR en tiempo real (Cuantitativo)
• La amplificación exponencial por PCR se incrementa hasta
  que se alcanza una meseta, esto ocurre entre 30 y 40 ciclos.
   – Porque se limitan los componentes de la reacción.
   – En esas etapas hay una pérdida de la precisión en la cuantificación.



• Los   ensayos      de    RT-PCR      (para    detectar     ARN)     son
  proporcionales al número de ciclos.
   – Durante la fase exponencial del PCR.
   – Se determina el número de ciclos en donde el producto sea igual en
     cantidad al producto de la muestra OGM.
        Métodos basados en el ARN:
                          RT-PCR
• El ARN es transcrito a ADN complementario por
  medio de una transcriptasa reversa aislada o
  clonada de un virus como el del SIDA.
• Se cuantifica por la presencia de pigmentos, por
  medio de sondas fluorescentes y por la hidrólisis de
  sondas
  – Permite diferenciar los artefactos y los productos
    verdaderos.
• Se requiere de una cantidad mínima de ARN como
  sustrato (200 ng para detectar < 0.1% en maíz).
  – Es independiente del tamaño del genoma y del número de
    copias del gen
     • Se necesitan al menos 36 copias para detectar un transgen en una
       muestra GM.                                 Brodman et al., 2002
         Espectroscopía de absorción en el infrarrojo cercano
            Near-Infrared Absorption Spectroscopy (NIR)
La espectroscopía NIR es la medición de la intensidad y la absorción de
radiación de luz infrarroja cercana por una muestra. La luz infrarroja
cercana cubre un rango de 800 a 2.5 µm (12,500 - 4000 cm-1) y es
suficientemente energética para excitar los overtones y diferentes
combinaciones de vibraciones moleculares, hasta niveles energéticos
superiores. La espectroscopía NIR es usada típicamente para medir grupos
funcionales orgánicos, especialmente los grupos alcohol (-OH), amino (-NH3)
y carboxilo (-C=O). Los límites de la detección son generalmente del 0.1% y
entre sus aplicaciones se incluyen las farmacéuticas, las agrícolas, en la
ciencia de los polímeros y en análisis clínicos.
            Resumen de los Métodos de
        detección de moléculas transgénicas
             en productos alimentarios
                                    Proteína                                         ADN                            ARN


Parameter           Western blot     ELISA       Lateral flow strip Southern blot Qualitative PCR   QC-PCR          RT-PCR
Ease of use            Difficult    moderate          Simple          Difficult       Difficult       Difficult     Difficult
Special equipment        Yes          Yes               No             Yes              Yes             Yes           Yes
needed
Sensitivity             High          High             High          Moderate        Very High         High           High
Duration                 2d        30 - 90 min        10 min            6h             1.5d             2d             1d
Cost/sample              150            5               2               150             250             350           450
Quantitative             No           Yes               No              No              No              Yes           Yes
Field application        No           Yes              Yes              No              No              No             No
Where applied       Academic lab Test facility     Field Testing   Academic lab     Test facility   Test facility Test facility

   Nota: la espectroscopía NIR detecta cambios estructurales (no DNA ni
   proteína), toma un minuto y no es cara.                    Ahmed, 2002
       Ejemplos de Métodos publicados para detectar OGM con base en su especificidad.
                                          Secuencia blanco                                                             Referencia(s)
                                                   Métodos para detectar DNA derivado de plantas
Intrón del gen del tRNALeu (trnL) cloroplástico                                                       Taberlet et al., 1991
                                                        Métodos para detectar plantas específicas
Gen unicopia de la invertasa de maíz                                                                  Ehlers et al., 1997
Gen unicopia de la lectina de soya                                                                    Meyer et al., 1996
Gen unicopia de la polugalacturonasa de jitomate                                                      Busch et al., 1999
                                                           Métodos de tamizado (categoría 1)
Promotor del virus del mosaico de la Coliflor (P-35S)                                                 Pietsch et al., 1997
Terminador de la Nopalina sintasa (T-Nos)                                                             Pietsch et al., 1997
                                                    Métodos para genes específicos (categoría 2)
Gen bar (fosfinotricina acetiltransferasa) gene                                                       Ehlers et al., 1997
Gen CryIA(b) (sintético)                                                                              Ehlers et al., 1997; Vaïtilingom et al., 1999
                                          Métodos específicos de la construcción transgénica (categoría 3)
Maíz Bt11: unión del intrón 1S IVS6 (enhancer) de la alcohol deshidrogenasa – Gen CryIA(b)            Matsuoka et al., 2001
Maíz Bt176: unión del promotor de la CDPK (calcium dependent protein-kinase) – Gen sintético
                                                                                                      Hupfer et al., 1998
CryIA(b)
Maíz GA21: OTP (enhancer) – Gen epsps (Tolerancia “RoundupReady”)                                     Matsuoka et al., 2001
Maíz Mon810: unión P-35S – intron I de la proteína “heat shock” (hsp) 70 (enhancer)                   Zimmermann et al., 1998
Maíz Mon810: unión hsp 70 intron – Gen CryIA(b)                                                       Matsuoka et al., 2001
RoundupReady®: unión P-35S – CTP (chloroplast transit peptide) de Petunia hybrida                     Wurz & Willmund, 1997
Maize T25 : unión Gen pat (phospinotricin acetyltransferase) - T-35S                                  Matsuoka et al., 2001
Jitomate Zeneca: Unión T-Nos – Gen truncado de la poligalacturonasa de jitomate                       Busch et al., 1999
                                              Métodos específicos del evento de inserción (categoría 4)
Maíz Bt11: unión del genoma vegetal – DNA recombinante integrado                                      Zimmermann et al., 2000
                                                                                                      Berdal & Holst-Jensen, in press; Taverniers et
Soya RoundupReady®: unión del genoma vegetal hospedero – DNA recombinante integrado
                                                                                                      al., in press; Terry & Harris, in press.

				
DOCUMENT INFO
Shared By:
Categories:
Tags:
Stats:
views:51
posted:6/3/2012
language:Spanish
pages:44