Get documents about "Metode analitice performante aplicate in cercetarea farmaceutica
Document Sample
1
Metode optice de analiză
Aceste metode utilizează proprietăţile optice ale substanţelor.
Metodele spectrale de analiză se bazează pe utilizarea fenomenelor de emisie
sau de interacţiune a radiaţiei electromagnetice cu atomii sau moleculele substanţei de
analizat (absorbţie).
Emisia sau absorbţia radiaţiilor electromagnetice de către sistemul cercetat duce
la apariţia unui semnal analitic ce dă informaţii despre compoziţia calitativă şi
cantitativă a substanţei analizate.
Intensitatea semnalului analitic este proporţională cu numărul de particule care
au cauzat acest semnal, deci cu concentraţia componentului ce se determină.
În cazul metodelor spectrale de absorbţie, semnalul analitic este absorbanţa.
Spectrofotometria prin absorbţia luminii (metode
absorbţiometrice)
Spectrofotometria se bazează pe proprietatea substanţelor de a absorbi selectiv
radiaţiile electromagnetice şi este folosită pentru identificarea şi determinarea
cantitativă a acestora.
Spectrele de absorbţie se obţin la trecerea unui fascicol de radiaţii continue prin
substanţa de analizat care poate absorbi o parte din energia acestuia. Cantitatea de
energie absorbită este în funcţie de structura şi de numărul moleculelor sau al atomilor
substanţei cu care interacţionează fascicolul de radiaţii.
Radiaţia electromagnetică ce constituie lumina este caracterizată (ca de altfel
toate radiaţiile electromagnetice) prin lungime de undă (), frecvenţă (), respectiv
energie (Є) corelate prin expresia: Є = h, în care:
= distanţa în linie dreaptă cuprinsă între două maxime consecutive ale unei
unde);
= frecvenţa radiaţiei (numărul de oscilaţii pe secundă); = 1/T;
T = perioada, ce reprezintă intervalul de timp dintre două maxime consecutive.
c = viteza luminii = 3.1010 cm/s.
Numărul de unde cuprinse într-un cm se numeşte număr de undă: = 1/ (cm).
Fiecare radiaţie luminoasă poartă o energie - cuantă de energie - ce este
proporţională cu frecvenţa acesteia:
Є = h. = h.c/
h = constanta lui Planck = 6,62.10-27 erg.s
2
se măsoară în:
- microni () 1=10-6 m = 10-3 mm
- milimicroni (m) 1m = 10-9 m = 10-6 mm
- nanometri (nm) 1nm = 10-9 m = 10-3 .
1 nm = 10-9 m = 10-7 cm = 10Å; 1Å = 10-8 cm = 10-1 nm = 10-10 m;
1mm = 10-6 m = 10-4 cm = 103 nm.
Funcţie de lungimea de undă a radiaţiilor electromagnetice, domeniile spectrale
sunt cele indicate în tabelul 1.
Tabelul 1. Domeniile spectrale funcţie de lungimea de undă
După cum se poate observa şi din relaţia Є – , aceste mărimi sunt invers
proporţionale, deci la lungimi de undă mari, energiile sunt mici şi invers.
O cuantă luminoasă (un foton) poate fi absorbită de un atom sau moleculă, dacă
prin aceasta atomul sau molecula trec la unul din nivelele de energie superioare ce
diferă de starea de plecare prin energia fotonului.
Energia moleculei (Є) este dată de suma energiilor electronice, de vibraţie şi de
rotaţie:
Є = Є electronice + Є vibraţie + Є rotaţie
Există două tipuri de salturi de energie moleculară obţinute în mod diferit:
- prin excitaţii electronice, ce corespund energiilor radiaţiilor cu cuprins între
200 şi 800 nm, implicând saltul electronilor pe nivele energetice superioare - un orbital
de antilegătură - acestea determină spectrele de absorbţie în UV şi VIS (spectre
electronice);
3
- prin excitaţiile moleculare determinate de radiaţiile IR ( = 2,0 - 25 m,
domeniul cel mai utilizat) rezultă spectrele moleculare (de rotaţie vibraţie sau spectrele
IR)
- de rotaţie 100 - 15000 m;
- de vibraţie 1,5 - 100 m.
Absorbţia radiaţiei electromagnetice de o anumită lungime de undă este
dependentă de caracteristicile structurale ale moleculei şi dă o indicaţie asupra
prezenţei acesteia, figura 1.
Figura 1. Absorbţia radiaţiei electromagnetice
Trecând printr-o probă un fascicol luminos cu diverse lungimi de undă se
constată că, la anumite valori ale lui , radiaţia electromagnetică este absorbită .
O înregistrare a cantităţii de lumină absorbită de o probă funcţie de lungimea de
undă se numeşte spectru de absorbţie, figura 2.
Figura 2. Spectrul de absorbţie
Aceste spectre de absorbţie sunt produse de diferite tipuri de tranziţii pe care le
pot suferi electronii din atomi sau molecule: tranziţie electronică (spectre UV-VIS);
tranziţie de vibraţie (spectre IR) în care nucleele dintr-o moleculă se mişcă faţă de altul
de-a lungul unei axe care le uneşte; tranziţie de rotaţie (spectre de microunde) în care
moleculele prezintă o mişcare de rotaţie în jurul unei axe ce trece prin centrul de
greutate al moleculei, fiind perpendiculară pe dreapta ce uneşte cele două nuclee (dacă
este o moleculă diatomică)
Pentru a se obţine spectre electronice este nevoie de o energie mai mare decât în
cazul spectrelor de absorbţie în IR , tabelul 2.
Tabelul 2. Energia şi lungimea de undă corespunzătoare energiei interne
Tipul de energie internă Domeniul, eV corespunzătoare energiei
4
Rotaţie 1,24.10-2 - 1,24. 10-4 100 - 10 m
Vibraţie 0,828 - 0,0124 1,5 - 100 m
Electronică 8,28 - 0,828 150 – 1500 nm
Absorbţia energiei luminoase în domeniul UV-VIS poate produce următoarele
fenomene:
- trecerea electronilor dintr-un orbital de legătură s sau p, ocupat de electroni în
stare fundamentală, în orbitali de antilegătură s* sau p*, neocupaţi în stare
fundamentală, dar posibil de a fi ocupaţi în stare excitată;
- trecerea din orbitali de non legătură n (electroni neparticipanţi) în orbitali s*
sau p*, figura 3.
Figura 3. Tranziţii electronice posibile
Tranziţiile s–s* sunt date de substanţele ce conţin numai legături simple - -;
acestea necesită o energie foarte mare, iar informaţiile obţinute sunt prea puţin
importante pentru a da indicaţii asupra structurii substanţelor.
Tranziţiile electronice produc benzile de absorbţie prezente în spectrul unei
substanţe, benzi caracteristice anumitor grupări de atomi. Aceste benzi pot fi deplasate
sub influenţa unor factori structurali sau a unor factori de mediu (de exemplu solventul
etc.). Deplasarea poate fi:
- batocromă: maximum se deplasează spre lungimi de undă mai mari (spre
roşu). Deplasarea batocromică produsă la trecerea unei substanţe covalente în
combinaţia ionică este numită halocromie (are loc o extindere a sistemului cromofor).
- hipocromă: maximum de absorbţie se deplasează spre lungimi de undă mai
mici (violet) şi intensitatea maximă de absorbţie este influenţată de factori structurali şi
de mediu.
Creşterea intensităţii absorbţiei se numeşte efect hipercromic, scăderea
intensităţii absorbţiei se numeşte efect hipocromic.
5
În figura 4 sunt prezentate şi alte fenomene ce apar în cazul absorbţiei luminii
de către moleculele substanţelor.
S
1
T
1
S VR 1
0
1C ISC
1
ISC
2 VR 3
A F P
VR VR
2 4
A - Absorbţie ; F - Fluorescenţă; P - Fosforescenţă; VR - Vibraţie de
relaxare; IC - Conversie internă; ISC - Încrucişare intersisteme.
Figura 4. Fenomene posibile ce apar la absorbţia radiaţiei luminoase de către
atomi sau molecule
Măsurătorile spectrofotometrice cantitative se bazează pe legea de absorbţie
Bouguet–Lambert–Beer: descreşterea intensităţii fascisolului după ce a străbătut un
strat absorbant este proporţională cu grosimea stratului şi concentraţia acestuia.
I / Io = 10-cl ; I = Io.10-cl
unde: I = intensitatea luminii transmise (ce părăseşte proba);
Io = intensitatea luminii incidente (ce pătrunde în probă);
= coeficient molar de extincţie sau absorbtivitate molară;
c = concentraţia soluţiei ce absoarbe (în mol/L);
l = grosimea stratului absorbant (cm).
I / Io = T = transmitanţă sau transmisie - este deci raportul dintre intensitatea
luminii transmise I şi intensitatea luminii incidente Io.
Aplicând logaritmul pentru Io / I rezultă:
6
log (Io / I) = log (1 / T) = cl = A = E = D = absorbanţă (A), extincţie (E) sau
densitate optică (D).
Deci, legea care stă la baza spectrofotometriei se exprimă simplu:
A = .c .l
Legea de bază a spectrofotometriei spune că absorbanţa (extincţia) este
proporţională cu concentraţia şi cu grosimea stratului absorbant.
O altă mărime utilizată în spectrofotometrie rezultă tot din relaţia de mai sus.
Raportul A / c.l = a = absorbtivitate sau coeficient de extincţie (k), în care c este
concentraţia (în g / L) (altă unitate de concentraţie decât molaritatea) şi l este grosimea
stratului absorbant (în cm).
Dacă în relaţia de mai sus, l = 1 cm, c = 1 mol/L, relaţia devine:
A=
se numeşte în acest caz absorbtivitate molară (absorbanţă molară sau
coeficient molar de extincţie). Această mărime este o caracteristică a moleculei şi
variază numai cu lungimea de undă. Deci, prin absorbtivitate molară se înţelege
absorbanţa unei soluţii cu concentraţia de 1 mol / L şi grosimea stratului absorbant de
1 cm, la o anumită lungime de undă.
O altă mărime utilizată este absorbanţa specifică (coeficient de extincţie
specifică sau simplu extincţie specifică).
Se notează A1% (FR X) sau E1% şi reprezintă absorbanţa unui strat de soluţie
1cm 1cm
cu concentraţia 1% (m/v) şi grosimea de 1 cm, la o anumită lungime de undă. Este de
asemenea o constantă ce caracterizează fiecare substanţă.
Sensibilitatea unei metode se poate vedea după valoarea lui şi A.
Prin urmare, sub numele de absorbţiometrie sau spectrofotometrie prin
absorbţie a luminii se înţeleg toate metodele ce au la bază următorul principiu: un
fascicol luminos, de o anumită lungime de undă, străbate proba de analizat şi după
proporţia în care este absorbită radiaţia luminoasă, se determină cantitatea de substanţă
absorbantă.
Metoda se numeşte absorbţiometrie fotometrică sau spectrofotometrie prin
absorbţie sau încă spectrocolorimetrie; denumirea de colorimetrie este improprie,
acesta definind în realitate metodele de analiză pentru specificarea şi descrierea
culorilor.
Metodele absorbţiometrice au cunoscut o evoluţie considerabilă şi datorită
tehnicilor moderne de lucru şi aparaturii folosite.
Domenii de aplicare şi avantaje
Datorită perfecţionării aparaturii şi metodelor de lucru, spectrofotometria UV-
VIS a devenit o metodă performantă, cu o eroare mică = 0,25 - 0,5%, comparabilă cu a
7
metodelor titrimetrice. (la început mai ales în cazul analizei urmelor precizia lăsa de
dorit.
Principalele avantaje:
- se pot aplica pentru dozarea majorităţii substanţelor. În cazul în care compusul
nu absoarbe lumina, poate fi transformat printr-o reacţie chimică adecvată într-un
compus colorat ce absoarbe lumina.
- folosirea reactivilor organici a condus la realizarea unor metode de
determinare a urmelor de substanţă.
- sunt metode rapide, prin măsurarea directă, fără a fi necesară adăugarea de
soluţie titrată. În multe cazuri se poate evita separarea altor componente, iar prin
folosirea unor reactivi specifici şi prin controlul strict al reacţiei se poate elimina
interferenţa ionilor străini (controlul pH-ului, lungime de undă convenabil aleasă,
utilizarea solvenţilor organici pentru extragerea complecşilor coloraţi, utilizarea unor
reacţii redox etc.).
- prin metodele spectrofotometrice se poate pune în evidenţă punctul de
echivalenţă într-o metodă titrimetrică (titrare spectrofotometrică).
Schema bloc a unui spectrofotometru de absorbţie în UV şi vizibil este
următoarea:
Sursa de radiaţii este în mod obişnuit o lampă de incandescenţă (cu filament de
wolfram) pentru domeniul vizibil, iar pentru domeniul ultraviolet o lampă cu hidrogen
sau deuteriu etc.
Cuvele şi monocromatorul pentru domeniul vizibil sunt confecţionate din sticlă
iar pentru ultraviolet din cuarţ.
În prezent pentru selectarea radiaţiei monocromatice se folosesc mai puţin
prismele şi mai mult reţelele de difracţie.
Solventul folosit pentru realizarea soluţiilor, mai ales pentru determinări în UV,
trebuie să nu absoarbă în domeniul cu maximul de absorbţie pentru probă, tabelul 3.
Tabelul 3. Domeniul de absorbţie în UV pentru unii solvenţi
Domeniul în care Domeniul în care
Solventul Solventul
absoarbe (nm) absoarbe (nm)
Apa până la 190 Diclormetan 200 – 230
n-Hexan până la 195 1,2-Dicloretan 200 – 233
Metanol 200 – 210 Cloroform 200 – 250
Etanol 200 – 210 Acetat de etil 200 – 260
Ciclohexan 200 – 210 Tetraclorură de carbon 200 – 265
8
Eter etilic 200 – 210 Dimetilformamidă 200 – 270
Acetonitril 200 – 212 Benzen 200 – 280
1,4-Dioxan 200 – 220 Toluen 200 – 285
Izooctan 200 – 220 Piridină 200 – 305
Glicerină 200 – 230 Acetonă 200 - 330
Metode de dozare
Metode directe
In cazul substanţelor la care se cunoaşte valoarea absorbanţei specifice sau
molare determinarea se face astfel:
Se măsoară absorbanţa (densitatea optică - D, A, E) a soluţiei de analizat si
folosind relaţia A = .c.l se determină concentraţia cunoscând valoarea lui şi l,
(l reprezintă grosimea cuvei şi de regulă este de 1 cm = 10 mm).
Dacă pentru o substanţă se cunoaşte valoarea absorbanţei specifice, se poate
calcula concentraţia în substanţa de analizat pe baza relaţiei:
A
c => c în g% (m/v)
A1%
1cm
Calculul se face în modul următor:
A1% ..................................1 g/100 ml
1cm
A ................................. c g/100 ml
Se poate folosi şi metoda curbei de etalonare (calibrare) ţinând cont de faptul că
A = f(c), vezi figura 5.
În acest scop se prepară o serie de soluţii etalon cărora li se determină
absorbanţa la lungimea de undă caracteristică analitului (λ max). Se reprezintă grafic
variaţia absorbanţei în funcţie de concentraţia, obţinându-se curba de etalonare.
Folosind absorbanţa probei prelucrată în acelaşi mod cu soluţiile etalon, prin
interpolare, se află din curba de calibrare cioncentraţia analitului.
9
Figura 5. Curba de calibrare în spectrofotometria de absorbţie
Pentru a avea o bună precizie, concentraţiile soluţiilor se aleg astfel încât
valorile absorbanţelor să fie cuprinse în domeniul 0,20 - 0,80.
Metode indirecte
La soluţia de analizat se adaugă un reactiv ce determină scăderea absorbanţei
(de exemplu prin formarea unui complex). Curba de etalonare va avea forma
următoare, figura 6:
Figura 6. Curba de calibrare în cazul în care reactivul determină scăderea absorbanţei
Prin determinarea absorbanţei se află concentraţia.
Metoda diferenţială
Este o tehnică spectrofotometrică în care soluţia de referinţă (martorul) conţine
componentul major din probă iar spectrul înregistrat reprezentă diferenţa dintre
absorbanţa probei şi a soluţiei de referinţă.
10
Deosebirea faţă de metodele clasice constă în înlocuirea martorului clasic cu
această soluţie de referinţă.
De exemplu, la determinarea liganzilor pentru anumite enzime, soluţia de
referinţă este constituită din enzima şi solvent iar proba conţine enzimă şi ligandul în
acelaşi solvent.
Titrimetrie spectrofotometrică
Se determină punctul de echivalenţă într-o titrare prin măsurarea variaţiei
absorbanţei funcţie de volumul de soluţie adăugată. Se reprezintă grafic această
variaţie. Punctul de inflexiune reprezintă volumul de echivalenţă. Curbele de titrare
pot avea formele (1) in cazul in care solutia titrata este colorata si la titrare culoarea
dispare, sau (2) cazul in care produsul de reactie este colorat, figura 7.
Figura 7. Stabilirea punctului de echivalenţă spectrofotometric
Spectre derivate
Spectrul de absorbţie este reprezentarea grafică a absorbanţei funcţie de
lungimea de undă, A f ( ) - spectru de ordin 0. În scopul analitic acest spectru
poate fi derivat, obţinându-se spectrele derivate:
- de ordinul întâi:
dA
f ' ()
d
- de ordinul doi:
d2A
f " ()
d2
- de ordinul n:
11
dnA
f n ( )
dn
În figura 8 sunt prezentate efectele derivării unui spectru cu un singur maxim de
absorbţie.
Derivata I-a se obţine prin reprezentarea vitezei de variaţie a absorbanţei în
funcţie de lungimea de undă, spectrul începe şi se termină la valoarea zero, trecând
prin zero la aceeaşi valoare a lungimii de undă corespunzătoare maximului de
absorbţie.
Figura 8. Spectre derivate
Principala caracteristica a derivatei de ordin doi este un minim la aceeaşi
lungime de undă ca şi maximul din spectrul de ordin zero.
Derivata a patra prezintă o bandă pozitivă cu un maxim la aceeaşi lungime de
undă ca şi maximul din spectrul de ordin zero.
Prin transformarea spectrului UV–VIS în derivate de ordin I sau II se obţine de
regulă un profil mult mai complex decât în cazul spectrului de ordin zero.
12
Spectrul derivat accentuează diferenţele dintre benzile spectrului, poate rezolva
suprapunerea benzilor şi, cel mai important, poate a reduce efectul interferenţelor.
Spectrele derivate pot fi utilizate la confirmarea identităţii unui compus prin
compararea cu spectrele unor compuşi de referinţă. Dacă spectrele sunt similare
compuşii sunt identici.
Un efect nedorit al procesului de derivare este scăderea raportului semnal /
zgomot odată cu creşterea gradului de derivare.
Aplicaţii
Efectuarea unei determinări cantitative (dozări) spectrofotometrice sau
elaborarea unei noi metode de dozare cuprinde următoarele etape de lucru:
a) Studiul reacţiei chimice ce stă la baza determinării (reacţie de culoare)
implicând:
- alegerea reactivului de culoare,
- a solventului, stoechiometria reacţiei,
- viteza de apariţie a culorii,
- stabilitatea în timp a speciei colorate,
- influenţa diferiţilor factori asupra reacţiei de culoare (pH, temperatură, ordinea
adăugării reactivilor, prezenţa speciilor străine, interferenţi),
- sensibilitatea reacţiei de culoare,
- domeniul optim de concentraţie.
b) Studiul aspectului fizic al determinării: alegerea lungimii de undă la care
compusul colorat prezintă absorbanţă maximă şi a metodei de măsurare.
c) Verificarea valabilităţii legii Lambert-Beer.
d) Construirea curbei de etalonare.
e) Măsurarea absorbanţei probei de analizat (prelucrată în aceleaşi condiţii cu
etalonul) şi deducerea valorii concentraţiei de pe curba de etalonare.
Sensibilitatea metodei spectrofotometrice depinde de doi factori: sensibilitatea
reacţiei de culoare şi sensibilitatea înregistrării (observării) diferenţelor mici de
absorbanţă.
Sensibilitatea reacţiei de culoare este proporţională cu coeficientul molar de
extincţie al substanţei ce absoarbe.
Pe baza unor considerente teoretice se poate prevedea că valoarea maximă a lui
este de ordinul 105 (100000).
Sandell afirma că: sensibilitatea (S) unei reacţii de culoare este dată de
cantitatea de substanţă (g) dintr-un strat de soluţie cu secţiunea de 1 cm2 ce produce o
absorbanţă egală cu 0,001 (de exemplu, sensibilitatea reacţiei Fe2+ cu o-fenantrolină
este 0,05g/cm2; iar pentru Mn2+ după oxidare la MnO - este 0,1g/cm2).
4
13
Prin analogie cu legea Bouguet–Lambert–Beer:
Acest coeficient S, este definit de Kortűm ca fiind cantitatea de substanţă
exprimată în mg conţinută într-un litru de solvent ce determină o absorbanţă egală cu
0,001 pentru o grosime a stratului absorbant de 1 cm.
S-au elaborat un număr foarte mare de metode de dozare atât pe compuşi
anorganici cât şi organici. Practic, orice substanţă poate fi dozată şi printr-o metodă
spectrofotometrică, dacă se utilizează o reacţie de culoare adecvată pentru VIS sau
UV. Contribuţii în domeniu: Sandell, Charlot, Babko etc.
Vom prezenta în continuare câteva exemple de dozări, cu referire la substanţe
de interes farmaceutic.
Dozarea alcaloizilor
Determinarea spectrofotometrică a alcaloizilor se bazează pe proprietatea
acestora de a forma compuşi coloraţi cu o serie întreagă de reactivi atât din categoria
reactivilor generali ai alcaloizilor cât şi reactivi specifici unei anumite structuri
chimice.
Alcaloizi ca stricnina, chinina, cinconina etc. reacţionează cu acidul picric
formând precipitate colorate care după separare şi dizolvare în amoniac se determină
spectrofotometric (sarea de amoniu a acidului picric este colorată în galben).
Se mai poate aplica extracţia picratului respectiv într-un solvent organic
convenabil ales şi măsurarea absorbanţei soluţiei obţinute.
Sarea Reinecke (tetratiocianodiaminocrom III) NH4[Cr(SCN)4(NH3)2] formează
cu alcaloizii precipitate colorate ce se separă, se spală, se dizolvă în acetonă şi se
măsoară absorbanţa.
Heteropoliacizii precipită alcaloizii din mediu acid, precipitatele obţinute fiind
reduse după separare şi purificare, cu TiCl2, SnCl2, SO32- etc. la albastru de molibden
sau de wolfram funcţie de heteropoliacidul utilizat la precipitare (metoda albastrului de
wolfram şi de molibden).
Alcaloizi cum ar fi codeina, vincamina, alcaloizi din Solanacee etc. precipită cu
reactivul Wasiky (p-dimetilaminobenzaldehida).
Derivaţii barbiturici
Derivaţii barbiturici pot fi determinaţi atât în UV cât şi în VIS. Determinările în
UV se fac la max = 220 nm în mediu acid şi 240-245 nm în mediu bazic.
De exemplu barbitalul (veronalul) la pH = 10 absoarbe la 240 nm prezentând
1% % %
A1cm = 538, ciclobarbitalul A1cm = 423 iar fenobarbitalul A1cm = 431.
1 1
14
Pentru determinarea în vizibil se utilizează reactivi de culoare: de exemplu
pentru fenobarbital acetatul de cobalt şi izopropilamină. (max = 560 nm).
Acidul ascorbic
Spectrul de absorbţie în UV trasat în soluţie de HCl 0,01N prezintă max = 245
nm şi A1% =695, iar în tampon fosfat de pH = 6,4 max = 265 nm, A1% = 945.
1cm 1cm
Pentru domeniul vizibil se utilizează o serie întreagă de reacţii de culoare cum ar fi
reacţia produsului de oxidare (acidul dehidroascorbic) cu hidrazine => hidrazone
colorate.
În reacţia cu diclorfenilindofenol se obţine o curbă descendentă (decolorare).
Sulfamide
Metodele de dozare ale sulfamidelor sunt prezentate în tabelul 4.
Tabelul 4. Absorbanţa specifică pentru câteva sulfamide
Sulfamida max (UV) A 1%
1cm
Sulfapiridina 240 620 (apă)
Sulfapiridina 261 680
Sulfapiridina 270 857
Sulfadiazina 270 844 (etanol)
Tolbutamidă 228 500 (etanol)
Pentru compuşi ce nu absorb în UV se aplică reacţii chimice ce conduc la
produşi cu absorbţie în UV.
De exemplu, alcaloizii formează cu clorura de p-nitrozobenzoil un ester (esterul
p-nitrozobenzoic) cu max = 253 nm.
Aminele primare şi secundare
Aminele primare şi secundare reacţionează cu anhidrida cinamică în acetonitril
formând amida cinamică ce prezintă absorbanţă maximă la 305 nm (acidul cinamic
C6H5_CH=CH_COOH).
Aminoacizii (ca şi aminele de fapt) formează cu clorura de anisil
dimetilaminoftaleina, respectiv sulfonamide cu max = 284-290 nm şi 320-350 nm.
Cationi metalici
Câţiva dintre reactivii folosiţi pentru determinarea spectrofotometrică a
cationilor sunt consemnaţi în tabelul 5.
15
Tabelul 5. Reactivi folosiţi pentru determinarea spectrofotometrică a unor cationi.
Ionul ce se
Reactivul
determină
max max
Alizarina Zr 525 5,3.103
Acidul cromotropic Ti 460 1,7.104
Difeniltiocarbazona Pb 520 6,6.104
8-hidroxichinoleina Al 386 6,6.103
Nitrozo-R (sare de Na) Co 500 1,5.104
1,10-fenetrolina Fe (II) 508 1,1.104
Piridilazonaftol Zn 515 2,3.104
Ditiocarbamat de Na Cu 436 1,3.105
Bis - baze Schiff Mn 460 9,8.104
Hormonii corticosteroizi
Hormonii corticosteroizi (hidrocortizon, flumetazona, fluocinolona,
prednisolona etc.) prezintă maxim de absorbţie la max = 240 nm, A1cm = 400.
1%
Pentru dozări în vizibil, reacţia cu albastru de tetrazoliu max = 525 nm.
Acidul salicilic şi derivaţii săi
Acidul salicilic şi derivaţii săi se determină prin reacţia cu Fe3+ în mediu neutru,
obţinându-se compuşi cu max = 525 nm.
Determinarea concentraţiei a două substanţe în amestec,
având maximum de absorbţie la lungimi de undă apropiate
Se poate rezolva determinarea spectrofotometrică a unor amestecuri ce conţin
două componente chiar dacă spectrele lor se suprapun parţial, prin măsurarea
absorbanţei probei la două lungimi de undă corespunzătoare maximelor de absorbţie
ale celor două componente. Această determinare se poate realiza datorită faptului că
absorbanţele sunt aditive.
S-a constatat că spectrul de absorbţie a unui amestec de doi componenţi (x şi y)
este echivalent cu rezultatul însumării spectrelor caracteristice celor 2 componenţi x şi
y, figura 9.
16
Figura 9. Spectrul de absorbţie a doi compuşi x şi y (separat) şi în amestec.
Prin urmare, dacă se determină absorbanţa probelor la lungimile de undă 1 ,2
caracteristice componenţilor x şi y (este vorba de max) se pot scrie următoarele ecuaţii:
A 1 AX 1 AY 1 A1%1 b cx AY 1 b c y ; A 2 AX 2 AY 2 A1%2 b cx AY 2 b c y
X
1%
X
1%
În aceste ecuaţii s-a ţinut seama de faptul că absorbanţa totală la cele două
lungimi de undă este determinată de suma componentelor x şi y (conform spectrului de
absorbţie)
Prin rezolvarea sistemului de ecuaţii, rezultă:
1 1
A1 AY%2 A 2 AY%1
A 2 A1% 2 b c x
X
cx ; cy
1 1
b(A1%1 AY%2 A1% 2 AY%1)
X X
1%
AY 2 b
unde:
cx = concentraţia componentului x în probă (% m/v);
cy = concentraţia componentului y în probă;
A1 = absorbanţa probei la lungimea de undă 1;
A2 = absorbanţa probei la lungimea de undă 2;
A1% =
x 1
absorbanţa specifică a componentei x la lungimea de undă 1;
A1% =
x 2
absorbanţa specifică a componentei x la lungimea de undă 2;
A1% =
y 1
absorbanţa specifică a componentei y la lungimea de undă 1;
A1%2 =
y
absorbanţa specifică a componentei y la lungimea de undă 2;
b = grosimea stratului absorbant (cm), (în general b = 1 cm).
17
Pentru a calcula absorbanţa specifică a celor două componente la cele două
lungimi de undă (dacă nu se cunoaşte) se folosesc soluţii etalon de concentraţie 1%
(m/v).
Se poate determina concentraţia şi folosind coeficientul molar de extincţie
(A = .c.b), sistemul de ecuaţii fiind asemănător. Se va deduce în acest caz
concentraţia soluţiei de analizat în moli/L.
Coeficientul molar de extincţie, dacă nu este cunoscut, se determină
experimental prin măsurarea absorbanţei soluţiei etalon la cele două lungimi de undă.
De exemplu: A = 0,750; c = 4,63.10-4 M; b = 1 cm.
= A/(c.b) = 0,750 / 4,63.10-4 = 1577 cm-1. M-1
18
Spectrometria I.R.
Radiaţiile IR constituie partea spectrului electromagnetic cu lungimea de undă
superioară radiaţiilor vizibile şi inferioare undelor radio.
Spectrul electromagnetic
Radiaţiile IR sunt constituite din:
- IR apropiat 750 - 2500 nm (0,75 - 2,5 m);
- IR mijlociu 2500 - 50000 nm (2,5 - 50 m);
- IR îndepărtat 50000 - 1000000 nm (50 - 1000 m).
(1 nm = 10-9 m = 10-7 cm)
De obicei, pentru radiaţiile IR, se exprimă în m sau număr de unde
(1m = 10-4 cm = 10-6 m = 103 nm = 104Å)
= număr de unde = 1/; (se exprimă în cm-1).
Legătura între şi am văzut-o deja:
= 1/ (cm) = 104/ (m) deoarece 1 m = 10-4 cm.
Exemplu: = 2,5 m = 2500 nm = 2,5.10-4 cm
= (1/2,5). 104 = 4000 cm-1
Domeniul ce prezintă cel mai mare interes pentru analiza organică este foarte
limitat şi cuprinde vibraţiile cu între 2,5 - 25 m, respectiv 4000 - 400 cm-1.
Energia acestor radiaţii este prea mică pentru a produce modificări în structura
electronică a moleculelor sau atomilor absorbanţi, dar este suficientă pentru a produce
modificări în energia lor de vibraţie sau rotaţie.
Prin analogie cu spectrele UV-VIS, spectrul IR este reprezentarea grafică a
procentului de energie absorbită (absorbanţa sau transmisia) funcţie de lungimea de
undă exprimată în m sau frecvenţă exprimată în cm-1 (număr de unde).
Radiaţiile IR a căror lungime de undă depăşeşte 100 m sunt absorbite de
moleculele substanţelor, modificându-le energia de rotaţie. Această absorbţie este
19
cantitativă, motiv pentru care un spectru de rotaţie moleculară prezintă un ansamblu de
linii fine.
În schimb, radiaţiile cu lungime de undă mai mică (1 - 100 m), deci cu energii
mai mari, sunt capabile, atunci când sunt absorbite, să producă modificări - tranziţii -
în energiile de vibraţie moleculară. Aceste tranziţii sunt cuantificate şi ele, dar
spectrele de vibraţie nu vor mai prezenta linii ci benzi mai mult sau mai puţin late,
datorită faptului că fiecărei tranziţii de energie de vibraţie i se pot asocia tranziţii de
energie de rotaţie.
Intensităţile bezilor de absorbţie sunt indicate fie prin transmisie T, fie prin
absorbanţă A (D,E).
Transmisia = energia fascicolului IR după trecerea prin probă / energia
fascicolului IR la intrarea în probă;
T = I/I0.
A = log (1/T) = log(I0/I)
T% = (I/I0).100
T% = transmitan]a substanţei de analizat (în procente);
I = intensitatea luminii transmise;
I0 = intensitatea luminii incidente.
Există două tipuri de vibraţii moleculare:
- vibraţii de alungire (stretching) şi
- vibraţii de deformare (bending)
O vibraţie de alungire este cea în cursul căreia doi atomi se apropie şi se
depărtează periodic de-a lungul axei lor comune (se modifică continuu distanţa
interatomică).
Într-o vibraţie de deformare, sunt modificate şi unghiurile dintre legături, iar în
spectrul IR vor fi observate numai cele care antrenează variaţii periodice ale
mementului de dipol al moleculelor. Sunt perturbări ce survin în repartiţia sarcinilor
electrice în interiorul moleculei din cauza diverselor vibraţii care sunt responsabile de
interacţiunea ce se produce între moleculă şi câmpul electromagnetic oscilant al
radiaţiei IR. Vibraţiile de deformare sunt de patru tipuri: forfecare, legănare, răsucire,
basculare.
Considerând un grup de atomi aşezaţi neliniar de forma AX2, acesta va cuprinde
3 vibraţii: alungire, deformare în plan şi deformare în afara planului. În general, pentru
o moleculă ce cuprinde n atomi, se vor înregistra 3n-6 (33-6 = 3 pentru AX2) tipuri de
vibraţii fundamentale (figura 1).
20
Figura 1. Tipuri de vibraţii fundamentale pentru o moleculă tip AX2
Acest număr teoretic al tipurilor de vibraţii (şi de frecvenţe de absorbţie) nu
corespunde numărului de benzi de absorbţie din spectru. Se pot observa benzi
suplimentare ce corespund frecvenţelor armonice ale frecvenţei fundamentale sau
benzilor de combinaţie a căror frecvenţă este egală cu suma frecvenţelor celor două
vibraţii fundamentale.
Deasemenea, anumite benzi, previzibile teoretic, pot să nu apară din diferite
motive:
- frecvenţa fundamentală este în afara domeniului 2,5-15 m;
- banda fundamentală are o intensitate prea mică pentru a fi vizibilă în spectru;
- două frecvenţe fundamentale sunt foarte apropiate şi se confundă etc.
Calculul frecvenţei ce corespunde vibraţiei de alungire a unei legături, poate să
se facă apelând la legea lui Hooke.
Aceasta se bazează pe un model mecanic al vibraţiei de alungire pentru o
moleculă diatomică, considerată a fi formată din două mase reunite printr-un resort
(oscilator armonic)
Mx My
x y
1 f
Se obţine relaţia: 2c Mx My
Mx My
în care: = frecvenţa în cm-1 (număr de unde);
c = viteza luminii (cm.s-1);
f = constanta de forţă a legăturii (în dyne.cm-1);
Mx şi My = masele atomilor x şi y (în grame).
21
În general, constanta de forţă a legăturii este de ordinul a 5.105 dyn/cm pentru
legături simple, respectiv de 2 sau de 3 ori mai mare pentru legături duble respectiv
triple.
Prin aplicarea formulei în cazul legăturii C-H, considerând masele celor doi
atomi 19,8.10-24 g respectiv 1,64.10-24 g (M1 = 12 g.mol-1/6.1023 atomi.mol-1 =
19,8.1024; M2 = 1 g.mol-1/6.1023 atomi.mol-1 = 1,66.10-24), frecvenţa de vibraţie a
acestei legături va fi 3040 cm-1 (3,3 m).
În realitate, frecvenţa pentru legăturile C-H din grupările metil şi metilen apare
la 2960 şi 2850 cm-1.
Imprecizia calculului se explică prin aceea că nu s-a ţinut cont şi de influenţa
atomilor vecini legăturii C-H. Înlocuind H cu deuteriu frecvenţa de vibraţie a legăturii
C-D apare la valori mai mari ale lui ca la C-H, fapt ce serveşte la atribuirea
frecvenţelor de vibraţie C-H diverselor grupări prezente în moleculă.
Calcule asemănătoare celui de mai sus permit să se prevadă următoarele
domenii de frecvenţă pentru:
1300-800 cm-1
C C C O C H
(7,7-12,5m)
1900-1500 cm-1
C C C O C N NO
(5,3-6,7m)
C C C N 2300-2000 cm-1
(4,4-5,0m)
Pentru a aduce mai multă precizie în calculul frecvenţelor de vibraţie prin
relaţia lui Hooke, este necesar să se ţină seama simultan de masa atomilor şi de
energiile de legătură. Creşterea constantei de forţă joacă un rol mai important decât
creşterea masei atomilor.
Astfel, legătura F-H va absorbi la o frecvenţă mai ridicată decât legătura C-H
(4138 cm-1 faţă de 2862 cm-1).
Energia utilizată pentru o vibraţie de deformare este în general mai slabă decât
energia unei vibraţii de alungire şi benzile caracteristice din spectrul IR apar spre
frecvenţe mai mici decât cele corespunzătoare vibraţiilor de alungire.
Domeniile atribuite diverselor frecvenţe de alungire şi de deformare sunt
indicate în tabelele ce cuprind frecvenţele sau lungimile de undă caracteristice câtorva
grupe de atomi.
Influenţa legăturii de hidrogen asupra frecvenţei de vibraţie trebuie luată în
seamă deoarece micşorează frecvenţele de alungire şi măreşte frecvenţele de
deformare.
22
Aparatura
Un spectrofotometru cu dublu fascicol, comportă cinci părţi principale:
1 2 3 4 5
1. Sursa de radiaţii IR
Radiaţiile IR se obţin la temperatura de 1000-1800C. Sursa este constituită fie
dintr-un filament Nernst (oxizi de zirconiu, thoriu şi ceriu fixaţi pe un liant), fie
baghetă Globar (carbură de siliciu). Ambele sunt aduse la temperatura de lucru prin
trecerea unui curent electric.
Energia emisă de o sursă Globar este maximă în regiunea 5500-5000 cm-1 şi
descreşte spre numere de undă mai mici (la 600 cm-1 descreşte de 600 ori). Filamentul
Nernst emite maximum de energie spre 7100 cm-1 şi scade de 1000 ori spre frecvenţe
mai coborâte.
Radiaţia ce pleacă de la sursă este împărţită în două fascicole: unul traversează
proba, celălalt substanţa de referinţă.
2. Compartimentul pentru probe
Compartimentul pentru probe cuprinde loca[ul cuvelor pentru proba de analizat
şi de referinţă. Celulele (cuvele) sunt foarte diferite funcţie de substanţa de analizat.
3. Fotometrul
Fotometrul este dispozitivul care realizează măsurarea intensităţii fascicolului
ce străbate proba comparativ cu a celui de referinţă.
Fascicolul de referinţă reflectat de un sistem de oglinzi, cade pe o oglindă
turnantă ce realizează un fascicol intermitent cu o frecvenţă între 8 şi 13 cicluri pe
secundă, după care trece printr-o fantă şi cade pe fotocelulă.
Concomitent, fascicolul ce străbate proba cade printr-un sistem de oglinzi pe
aceeaşi oglină turnantă şi apoi prin aceeaşi fantă, pe detector.
Se poate spune că cele două radiaţii au fost combinate într-un singur fascicol
modelat cu o frecvenţă ce depinde de viteza de rotaţie a oglinzii turnante. Cele două
fascicole pot fi echilibrate cu ajutorul unui dispozitiv de atenuare, piptene, ce absoarbe
mai mult sau mai puţin fascicolul de referinţă. Cu ajutorul unui servomecanism
atenuatorul echilibrează cele două fascicole; mişcarea acestuia este apoi înregistrată
funcţie de lungimea de undă, realizându-se spectrul IR de absorbţie.
4. Monocromatorul
23
Monocromatorul realizează separarea unei radiaţii monocromatice folosind
prisme speciale, transparente la IR.
Astfel, o prismă din NaCl este utilizabilă satisfăcător în domeniul 4000-650 cm-1,
cele din CaF2 numai în domeniul 4200-1300 cm-1, iar cele din KBr şi CsBr sunt mai
indicate pentru domeniul 1100-385 cm-1.
În prezent, utilizarea reţelelor de difracţie este din ce în ce mai acceptatî,
datorită numeroaselor avantaje.
Se spune că un aparat are o putere de rezoluţie cu atât mai mare cu cât separă un
domeniu de lungimi de undă mai îngust. Cu cât fanta prin care trece fascicolul este mai
mică, rezoluţia este mai mare. Nu se poate lucra însă cu fante foarte mici (înguste)
deoarece intensitatea radiaţiei emise de sursă scade, mai ales la lungimi de undă mari.
La aparatele moderne, lărgimea fantei este reglată astfel încât intensitatea
fascicolului să rămână prectic constantă.
5. Detectorul – înregistratorul
Detectorul - înregistratorul (receptorul) este un dispozitiv ce furnizează datele
privind intensitatea fascicolului ce străbate proba. În general, se utilizează trei
tipuri de detectori: detectori termici, piroelectrici şi fotoconductori. Se mai foloseşte
celula pneumatică sau celula Golay - bazată pe energia totală care acţionează asupra
detectorului, flexibilă şi foarte sensibilă, utilă în domeniul 0,8-1000 m.
Detectorii termici folosesc efectul caloric al fascicolului de lumină. Se
utilizează termocuplul şi bolometrul.
În cazul termocuplului, energia fascicolului încălzeşte lucul de sudură a două
lame bimetalice, forţa electromotoare ce ia naştere fiind funcţie de energia incidentă.
În cazul bolometrului, încălzirea are ca efect modificarea valorii unei rezistenţe,
modificare ce este dependentă de energia incidentă.
Deci, orice modificare a intensităţii fascicolului probei, comparativ cu cel de
referinţă, se traduce printr-un semnal electric care se înregistrează.
Atât termocuplul cât şi bolometrul sunt utilizate pentru domeniul 0,8-400 m,
dar nu au sensibilitate prea mare.
Detectorii piroelectrici sunt confecţionaţi din materiale dielectrice cu proprietăţi
termice şi electrice speciale. Cel mai utilizat material este triglicin-sulfatul deuterat.
Celula fotoconductivă - semiconductor din PbS sau PbSe utilizată pentru
domeniul 0,7-3,3 m.
Starea fizicǎ a probei
Spectrele IR se pot înregistra pentru toate substanţele, idiferent de starea de
agregare.
1. Gazele şi lichidele cu punct de fierbere scăzut sunt examinate în celule
speciale, în prealabil vidate. În acestea şi lichidele cu punctul de fierbere scăzut se
24
volatilizează şi se realizează de fapt spectrul vaporilor. Pentru cele cu punctul de
fierbere mai ridicat, pentru a avea loc volatilizarea, celulele pot fi încălzite. În cazul
gazelor drumul optic poate atinge şi 40 m.
2. Lichidele pot fi examinate în stare pură sau în soluţie, folosind cuve speciale
cu grosimea între 0,005 mm şi 0,1 mm, cantitatea de produs variind între 1 şi 10 mg.
Dacă se folosesc soluţii, acestea se introduc în cuve cu grosimea de 0,1-1,00 mm;
concentraţiile soluţiilor pot fi de 0,05-10% (1-15 mg substanţă). Celula cu proba
martor conţine solventul; are grosimea fixă sau variabilă şi se plasează pe traiectoria
fascicolului de referinţă, fiind confecţionată din acelaşi material şi având aceeaşi
grosime cu cuva pentru probă. Materialul din care sunt confecţionate cuvele trebuie să
fie transparent pentru lumina infraroşie (clorură de sodiu, bromură de potasiu, fluorură
de litiu).
Soluţiile şi lichidele mai pot fi examinate şi sub forma uni film între două
ferestre.
Spectrul înregistrat în cazul soluţiilor cuprinde atât benzile de absorbţie ale
substanţei dizolvate cât şi benzile caracteristice solventului. Din acest motiv, solvenţii
utilizaţi pentru analiza IR trebuie să fie anhidri, transparenţi în domeniul de lungimi de
undă explorat şi să nu formeze legături de hidrogen cu substanţa de cercetat
În tabelul 5 sunt prezentaţi câţiva dintre solvenţii mai utilizaţi cu indicarea
regiunilor transparente.
Tabelul 1. Solvenţii utilizaţi pentru analiza IR
Solventul Regiuni transparente
CS2 860-880, 1450-1650, 2200-2400
CCl4 700-860, 960-1010, 1350-1400, 1490-1600
Perclorbutadienă 800-980 ; 1050 - 1080 ; 1500 - 1550
Nujol 1390-1500, 2700-3000
Fluorolube tot domeniul
3. Solidele se pot examina în IR prin trei procedee: suspensie într-un lichid
vâscos, dispersie solidă sub formă de pastilă obţinută prin comprimare, film (peliculă)
depus pe o lamă transparentă la IR.
Suspensiile se obţin prin amestecarea a 2-5 mg probă solidă cu o picătură de
nujol (ulei de parafină cu punct de fierbere ridicat), fluorolube (amestec de
hidrocarburi fluorurate) sau hexaclorbutadienă. Suspensia astfel obţinută este
examinată sub forma unui film subţire plasat între două plăci din sare transparentă la
25
IR, folosind pentru compensare solventul fixat între plăci din acelaşi material şi
aceeaşi grosime.
Pastilele sunt obţinute prin comprimarea puternică a unui amestec omogen
obţinut din 1 mg substanţă de analizat şi 100 - 400 mg KBr anhidră, de puritate
spectrală; amestecul se introduce într-o matriţă specială şi se comprimă la o presiune
de câteva sute kg/cm2. Se înregistrează spectrul IR faţă de un comprimat preparat în
aceleaşi condiţii însă fără substanţa de analizat.
Filmele depuse pe o placă se utilizează mai rar şi numai pentru substanţele care
pot fi topite şi solidificate sau pentru cele care se dizolvă într-un solvent nepolar, uşor
volatil.
Indiferent de maniera în care se pregăteşte proba de analizat, aceasta trebuie să
fie anhidră.
Interpretarea spectrelor. Aplicaţii
Pentru a se putea realiza o interpretare corectă a spectrelor IR care să conducă
la rezultate concludente, trebuie îndeplinite următoarele condiţii:
- spectrofotometrul IR să aibă o bună rezoluţie;
- substanţa studiată să fie bine purificată;
- aparatul folosit să fie corect etalonat.
Etalonarea aparatului se face înregistrând spectrul unui film din polistiren
pentru care se cunosc în mod riguros poziţiile benzilor de absorbţie caracteristice.
Deasemenea, trebuie avut în vedere faptul că nu se pot stabili complet diversele
moduri de vibraţie a unei molecule şi din acest motiv, interpretarea unui spectru IR se
face prin compararea empirică a mai multor spectre.
Cea mai mare parte a frecvenţelor de vibraţie a unui grup de atomi variază
destul de mult de la o moleculă la alta, datorită vibraţiilor foarte complexe ce pot
exista în aceasta. Totuşi, anumite frecvenţe, cum ar fi cele care rezultă din alungirea
legăturilor C-H şi C=O, variază foarte puţin de la o moleculă la alta ceea ce ajută la
stabilirea structurii studiate, tabelul 2.
Tabelul 2. Frecvenţele de vibraţie pentru unele grupări.
Tipul de legătură Domeniul (cm-1)
C-H 2840-3000
CH – aromatic 3000-3100
CH – alchine 3300
C=C olefine 1640-1680
C=C – alchine 2150-2260
C=C aromatic 1450-1600
C-O alcool, eter, acizi, esteri 1080-1300
C=O aldehide, cetone, acizi, esteri 1690-1760
O-H alcool, fenol 3590-3640
26
CN vinil 2210-2260
C-Cl 600-800
Orice concluzie la care s-a ajuns, prin reperarea unei benzi a spectrului trebuie
confirmată prin examinarea acestei regiuni din spectru. De exemplu, dacă constatăm
existenţa unei benzi caracteristice - vibraţie de alungire - pentru gruparea C=O din
funcţia aldehidă ( =1690 cm-1), trebuie să ne asigurăm că există în spectru şi banda
caracteristică de alungire a legăturii C-H din grupul CHO la 2750 cm-1 (3,63). La fel
atribuirea unei benzi carbonil dintr-un ester ( CO =1750 cm-1) trebuie să fie
confirmată prin observarea unei benzi intense situată între 1310 şi 1100 cm-1 (7,6 - 9,1
m) corespunzătoare alungirii legăturii C-O a grupării ester.
În foarte multe cazuri benzile sunt deplasate datorită formării legăturii de
hidrogen.
Regiunile mai importante pentru un examen preliminar sunt cele situate peste
1350 cm-1 (până la 2000 cm-1) şi cele cuprinse între 900 şi 650 cm-1. Benzile
corespunzătoare regiunilor intermediare sunt complexe.
Pentru a confirma structura unei substanţe, pe lângă spectrele IR, se folosesc şi
spectrele de masă, UV, RMN etc.
Moleculele cu un număr mare de atomi admit şi un foarte mare număr de
vibraţii normale, ceea ce face ca interpretarea spectrelor să fie dificilă.
Pornind de la un număr foarte mare de spectre ale substanţelor cunoscute, s-au
tras concluzii general valabile, spectrometria IR empirică fiind foarte utilă.
Nu există doi compuşi organici cu spectrul IR identic şi din acest motiv spectrul
IR a devenit un criteriu de identificare a fiecărei substanţe organice, asemănător cu
amprentele digitale la oameni. Domeniul de frecvenţă sub 1500 cm-1, fiind caracteristic
fiecărei substanţe, a primit denumirea de regiune a amprentei digitale. Coincidenţa
acestei regiuni în spectrele a două substanţe este o dovadă a identităţii lor.
Spectrele IR pot constitui şi o dovadă a purităţii unei substanţe. Apariţia unor
benzi suplimentare faţă de spectrul substanţei pure dovedeşte prezenţa unor impurităţi.
Desigur, va fi ma uşor decelată o singură impuritate decât mai multe însumând aceeaşi
concentraţie.
Unele reacţii chimice în care reactantul şi produsul de reacţie prezintă benzi
caracteristice individuale se pot urmări comod şi sigur cu ajutorul spectrelor IR
(dispare banda reactantului şi apare cea a produsului de reacţie).
În cazul cromatografiei pe coloană a unui amestec de produşi, identificarea
diferitelor fracţiuni se poate face şi prin spectroscopie IR, mai ales dacă produşii sunt
incolori.
Toate tipurile de molecule, organice şi anorganice, cu foarte mici excepţii,
absorb în domeniul IR. Din acest motiv, spectrofotometria IR oferă posibilităţi de
determinare pentru un număr mare de substanţe. Mai mult, datorită unicităţii spectrului
IR, specificitatea acestei metode va fi atinsă sau depăşită de un numărm relativ mic de
alte metode analitice.
27
Specificitatea şi-a găsit aplicaţii mai ales în analiza amestecurilor de compuşi
organici foarte înrudiţi.
Analiza unui amestec de hidrocarburi
O aplicaţie tipică a spectroscopiei cantitative IR este analiza unui amestec de
izomeri C8H10 ce conţin o-xilen, m-xilen, p-xilen şi etilbenzen.
Spectrele pentru aceşti compuşi în domeniul 12 - 15 m, în ciclohexan prezintă
benzi maxime (peak-uri) caracteristice individuale la 13,47 m, 13,01 m, 12,58 m şi
14,36 m. Totuşi, datorită suprapunerii benzilor de absorbţie, absorbanţa unui amestec
la oricare din aceste lungimi de undă, nu este în întregime determinată de concentraţia
unui singur component. De aceea se determină absorbanţele molare pentru fiecare din
aceşti patru compuşi la cele patru lungimi de undă. Cu acestea pot fi scrise patru
ecuaţii care permit calcularea concentraţiei fiecărei specii, prin măsurarea absorbanţei
amestecului la cele patru lungimi de undă (vezi UV-VIS).
Determinarea poluanţilor din aer
Determinarea poluanţilor din aer necesită metode sensibile, rapide şi foarte
specifice pentru o mare varietate de compuşi chimici. Spectrofotometria IR
îndeplineşte aceste cerinţe mai mult chiar decât alte metode analitice.
Proba de aer ce conţine cinci specii chimice în concentraţii cunoscute, a fost
analizată cu un instrument computerizat, utilizând o celulă gazoasă de 20 m. Datele au
fost imprimate în 1 - 2 minute de la injectarea probei.
Spectrometre IR cu transformare Fourier
Spectrometrele în infraroşu cu transformare Fourier oferă avantajele unei
neobişnuit de mari sensibilităţi, rezoluţie şi viteză de achiziţie a datelor (tot spectrul
este achiziţionat în mai puţin de o secundă). Din păcate, aceste instrumente sunt mult
mai scumpe şi mai complexe.
Spectrometrele cu transformare Fourier nu conţin elemente dispersive, toate
lungimile de undă fiind detectate şi măsurate simultan. Pentru a separa lungimile de
undă este necesară modularea semnalului sursei în aşa fel încât să poată fi decodat prin
transformare Fourier, o operaţie matematică ce necesită utilizarea unui calculator de
mare viteză.
Spectrometrele IR tradiţionale sunt cunoscute ca instrumente dispersive. Odată
cu apariţia instrumentelor pe bază de calculator şi microprocesor, aceste instrumente
clasice au fost înlocuite în mare parte de spectrometre în infraroşu cu transformare
Fourier (FTIR), care prezintă mai multe avantaje. În loc de un monocromator tip reţea
de difracţie, un instrument FTIR foloseşte un interferometru pentru a obţine spectrul.
Schema de bază a unui instrument cu interferometru este următoarea, figura 2.
28
Radiaţia de la o sursă IR convenţională este împărţită în două raze, una care pleacă
spre o oglindă cu poziţie fixă şi alta care pleacă spre o oglindă în mişcare. Atunci când
razele sunt reflectate, una este deplasată puţin (defazată) faţă de cealaltă. Înainte de a
trece prin probă, se produce interferenţa tuturor radiaţiilor monocromatice din rază.
Astfel, prin probă trec simultan toate lungimile de undă, iar interferenţa se modifică în
timp prin deplasarea oglinzii cu o viteză liniară. Rezultatul absorbţiei radiaţiei de către
probă este un spectru obţinut în timp, numit interferogramă, ce reprezintă intensitatea
absorbţiei ca funcţie de diferenţa de drum optic dintre cele două raze. Folosind un
microprocesor, aceasta este convertită în domeniu de frecvenţe, cu ajutorul unei
operaţii matematice numite transformare Fourier (de unde şi numele de spectrometru
IR cu transformare Fourier); în urma acestui proces se obţine un spectru infraroşu
convenţional.
Avantajul principal al unui instrument cu interferometru este faptul că se
procesează mai multe date simultan. Prin probă trec toate radiaţiile odată, faţă de
instrumentele clasice în care proba era expusă succesiv câte unui domeniu îngust.
Oglindă fixă
Oglindă mobilă
S
Sursă infraroşu
Probă
Detector
Figura 2. Schema de bază a unui instrument cu interferometru
Acest proces conduce la creşterea raportului semnal-zgomot şi la obţinerea în
câteva secunde a unui spectru cu o rezoluţie comparabilă sau chiar mai bună decât la
folosirea unei reţele de difracţie.
Principiile interferometrului şi a transformării Fourier sunt cunoscute de peste
un secol, dar aplicaţiile practice au trebuit să aştepte apariţia tehnicilor digitale de
calcul cu ajutorul calculatorului.
29
Spectrometria de masă
Spectrometria de masă este o metodă instrumentală de analiză a compuşilor
organici având la bază fragmentarea moleculelor în ioni de masă diferită cu sarcină
pozitivă şi separarea lor în fascicule de ioni cu aceeaşi masă folosind concomitent
interacţiunea acestora cu un câmp electric şi magnetic.
În principiu, are loc bombardarea substanţei de cercetat cu un fascicul de
electroni, urmată de accelerarea ionilor formaţi şi separarea lor funcţie de masă prin
acţiunea concomitentă a unui câmp electric şi magnetic.
Un spetrometru de masă cuprinde:
- un compartiment de producere a ionilor sub acţiunea unui fascicul de
electroni (1);
- un compartiment de accelerare a ionilor în câmp electric longitudinal (2);
- un compartiment de separare în câmp magnetic transversal funcţie de
raportul m/e (3);
- un compartiment de detectare a ionilor (4)
1. Ionizarea 2. Accelerarea ionilor 3. Separarea ionilor 4. Detectarea
moleculelor `n câmp electric `n câmp magnetic ionilor separa]i
Când detectorul (4) este o placă fotografică, care este impresionată mai mult
sau mai puţin funcţie de numărul ionilor, aparatul se numeşte spectrograf.
Aparatele moderne înregistrează curentul ionic (proporţional cu numărul de
ioni) sub formă de spectru, funcţie de masa ionilor şi de abundenţa lor; asemenea
aparate se numesc spectrometre de masă.
Majoritatea spectrometrelor de masă realizează separarea ionilor pozitivi,
deoarece la bombardarea moleculelor de cercetat (cel mai adesea organice) cu un
fascicul de electroni se expulzează un electron din moleculă formându-se un ion
pozitiv.
Diferenţa esenţială a spectrometriei de masă de celelalte metode spectrale
constă în aceea că după înregistrarea spectrului substanţei cercetate, aceasta nu mai
poate fi recuperată, fiind transformată în ioni, pe când în celelalte metode au loc numai
modificări în starea fizică a substanţei.
Schema unui spectrometru de masă cu focalizare magnetică este redată în
figura 1:
30
Figura 1. Schema unui spectrometru de masă
- Proba este introdusă în spectrometru şi vaporizată;
- Ionii de sarcină z (un multiplu al sarcinii electronului) sunt produşi prin
bombardarea probei cu un flux de electroni în camera de ionizare; energia electronilor
trebuie să fie mai mare de 70 eV (1eV = 96,5 KJ.mol-1; 70 eV = 6750 KJ.mol-1)
- Ionii rezultaţi sunt acceleraţi într-un câmp electric căpătând o energie cinetică
similară câmpului;
- Ionii de masă m sunt deviaţi în câmp magnetic funcţie de raportul m/z pe
diferite traiectorii circulare;
- Variind tăria câmpului magnetic se pot focaliza pe detector ionii de o anumită
masă m (m/z) ;
- Ionii focalizaţi sunt detectaţi şi se înregistrează spectrul de masă.
Spaţiul interior al spectrometrului de masă este puternic vidat.
Fiecărui raport m/z îi corespunde o traiectorie de o anumită rază:
m 2U A
r2
e H2
În câmp electric energia de accelerare este egală cu energia cinetică:
mv 2
e UA (1) unde:
2
m - masa (Kg); e - sarcina ionului; v - viteza ionului (m/s); UA - tensiunea de
accelerare (V).
În câmp magnetic forţa magnetodinamică este egală cu forţa centrifugă:
mv 2 mv
Hev (2) sau He (3)
r r
unde:
H - intensitatea câmpului magnetic (T - tesla); r - raza traiectoriei ionului (m).
31
Rezultă că viteza are expresia:
Her
v (4)
m
Înlocuind în relaţia (1) valoarea lui v din expresia (4) obţinem:
m H2 e2 r 2
e UA (5) sau 2 m U A H 2 e r 2 (6)
2 m2
de unde rezultă că:
m 2U m H2 m r 2 H2
r 2A (7) şi
2
r
2
(8) sau (9)
e H e 2 UA z 2 UA
Spectrul de masă: ionii rezultaţi prin bombardarea compusului organic sunt
instabili şi se fragmentează aproape instantaneu. Spectrul de masă al unui compus
organic constituie reprezentarea abundenţei relative a fragmentelor de scindare,
purtătoare de sarcini pozitive, în funcţie de raportul m/e al acestor particule.
Drept etalon al abundenţei se consideră, de regulă, cel mai intens maxim din
spectru - picul de bază - base peak. Atribuind acestuia valoarea 100% se pot determina
cu uşurinţă abundenţele relative ale tuturor ionilor. Întrucât abundenţele sunt foarte
diferite ca valoare, uneori picurile cele mai importante prezintă în spectru intensităţi
extrem de mici (abundenţe foarte reduse). De regulă, spectrul de masă se dă sub formă
grafică (figura 2).
Abundance CAFEINA 194
2000000
1600000
1200000 109
800000
55 67 82
400000
3842 80 94 165
122 137 150 164 179
124 196
0
M/Z -> 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Figura 2. Spectrul de masă al cafeinei
În cazul analizelor cantitative, se înregistrează cantitatea totală de ioni (curentul
ionic total); înălţimea unui pic redă ponderea procentuală a acelui maxim din cantitatea
totală a ionilor. În acest caz se impune o însumare riguroasă a intensităţilor tuturor
ionilor din spectru până la M (masa moleculară).
32
Aplicaţii
Spectrometria de masă se poate folosi atât în analiza calitativă cât şi în cea
cantitativă.
Spectrometrele de masă se folosesc mult cuplate cu un gaz cromatograf pentru
detectarea şi înregistrarea componentelor separate prin gaz cromatografie.
Tehnica mixtă gaz – cromatografie pe coloane capilare - spectrometrie de masă
(GC-MSD) cât si cromatografia de lichide de inalta performanta cu detector
spectrometru de masa a putut fi realizată practic datorită faptului că metodele necesită
cantităţi mici de probă şi de acelaşi ordin de mărime (de la miligrame la nanograme).
Spectrometria de masă foloseşte şi la determinări de mase moleculare şi
structuri ale substanţelor organice necunoscute prin:
- furnizarea masei moleculare exacte;
- posibilitatea stabilirii unei formule brute;
- prin aducerea unei dovezi asupra existenţei posibile a unor elemente
structural caracteristice (alături de alte metode: RMN, IR etc.).
Aplicaţii în chimia organică
Procesul de ionizare a unei molecule poate avea loc în două moduri:
- cu formare de ioni negativi prin înglobarea electronului (mai rar):
_
M + e > M-
fenomen cunoscut sub numele de "absorbţie de rezonanţă".
- cu formarea unui ion pozitiv (cel mai frecvent) prin expulzarea unui electron
din moleculă:
_
M + e– > 2e– + M+
Dacă energia electronilor este mică (5 - 10 eV), se formează aşa numitul "ion
molecular" având aceeaşi masă ca a moleculei. Ionul molecular format este destul de
instabil şi se descompune rapid desfăcându-se într-un număr mare de fragmente, de
regulă cu formarea unui radical şi a unui ion:
_
M+ > R + I+
Radicalul fiind neutru din punct de vedere electric nu va fi observat cu
spectrometrul de masă. Procesul poate avea loc în mai multe etape.
Fragmentările moleculelor în spectrometrul de masă răspund la următoarele trei
tendinţe:
- formarea de ioni cât mai stabili;
- formarea de radicali cât mai stabili;
- eliminarea de particule neutre stabile (N2, CO2, H2O etc.).
Dintre picurile unui spectru prezintă interes deosebit:
- picul molecular;
33
- picul de bază care reprezintă etalonul de măsurare a intensităţii;
- picurile datorate contribuţiilor izotopice.
De exemplu, în cazul hidrocarburilor saturate:
- ionii moleculari sunt instabili şi prin pierderea unui ion de hidrogen se
formează ioni de carboniu primari cu formula generală: [CnH2n+1]+ .
O reacţie importantă de scindare a acestora este pierderea unei molecule de
etilenă, dar se pot scinda radicali liberi alchil sau atomi de hidrogen.
+
R CH 2 CH 2 + CH 2 CH 2
+ . . +
R CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 R CH 2 CH 2 + CH 2 CH 2
. . +
H + R CH 2 CH 2 CH CH 2
Ionii cu sarcină electrică se stabilizează prin mezomerie iar ionii carboniu trec
în ioni mai stabili.
Ionizarea moleculelor de analizat se poate face folosind ca reactiv un gaz
(metan, metilpropan sau amoniac) care introduşi în camera de ionizare, în urma
bombardării cu electroni, produc ioni moleculari, care, reacţionează apoi cu
moleculele probei cu apariţia ionilor de tip MH+ ; au loc reacţiile:
Reactia primară:
·
CH4 + e- CH4+ + e- + e-
electron ion electronul din electronul (ionizare)
rapid molecular reactivul gaz încetinit
Reacţiile secundare:
·
CH4+ CH3 + H·
· ·
CH4+ + CH4 CH5+ + CH3 (Autoprotonare)
ionul
reactant
CH3 + CH4 C2H5 + H2
+ +
Coliziune cu molecula din proba M :
M + CH5+ MH+ + CH4 (ionul M+1)
molecula molecula
din probă protonată
M + C 2 H5 +
MC2H5+ (ionul lui M+29)
Daca M este de tipul RH:
RH + CH5+ R+ + CH4 + H2 (ionul M-1)
Astfel de ionizare se numeşte ionizare chimică (IC).
În spectrul de masă obţinut prin ionizare chimică picul ionului molecular
predomină. Avantajul acestui tip de ionizare este creşterea sensibilităţii detecţiei la
valori de ordinul femtogramelor (10-15g).
34
Spectroscopia de rezonanţă magnetică
nucleară(RMN)
Spectroscopia RMN este o metodă instrumentală de analiză având la bază
măsurarea absorbţiei de către proba, aşezată într-un câmp magnetic exterior, a radiaţiei
electromagnetice (de rezonanţă) în regiunea frecvenţelor radio.
În comparaţie cu spectrometria UV, VIS şi IR unde erau implicaţi în absorbţia
radiaţiei electromagnetice electronii, în RMN sunt implicate nucleele atomilor.
Bazele teoretice ale spectroscopiei RMN au fost puse de W. Pauli în 1924 care
a prevăzut în mod cert prezenţa spinului magnetic. Verificarea experimentală s-a făcut
în 1946 independent de către F. Bloch, Stanford şi E. Purcell. În 1952 Bloch şi Purcell
au primit premiul Nobel pentru aceste realizări.
În 1953 apare primul spectrometru RMN de înaltă rezoluţie ce a fost folosit şi
pentru studii privind structura chimică a substanţelor. În prezent spectroscopia RMN a
căpătat o extindere deosebită în chimia organică, anorganică, biochimie, medicină etc.
Teoria rezonanţei magnetice nucleare
Unele nuclee, asemănător electronilor, prezintă un moment magnetic de spin ce
se poate orienta într-un câmp magnetic exterior efectuând o mişcare de precesie cu o
anumită frecvenţă şi care poate intra în rezonanţă cu o radiaţie electromagnetică
externă (din domeniul radio).
Deoarece energia nucleelor este mult mai mare ca a electronilor, va necesita
pentru orientarea spinului un câmp magnetic mai intens.
Nucleele unor atomi (H1, C13, N15, F19, P31 etc.) având numărul cuantic de spin
I =1/2, execută ca şi electronii o mişcare de rotaţie în jurul propriei axe - mişcare de
spin. Momentul mecanic de spin al nucleului este cuantificat conform relaţiei:
h
PI I(I 1)
2
unde:
I - număr cuantic de spin.
Ca şi în cazul electronului, nucleul în rotaţie, fiind încărcat, va reprezenta un
curent electric, care va crea un câmp magnetic (magnet elementar) a cărui axă coincide
cu cea a spinului.
Comparând protonul cu electronul vom constata că viteza de rotaţie a
protonului este mult mai mică decât a electronului deoarece protonul are momentul de
inerţie mult mai mare. Aceasta echivalează cu un curent elementar mult mai slab şi
deci un moment magnetic mult mai mic. Unitatea de moment magnetic este
"magnetonul nuclear" - n - dată de relaţia:
35
5 10 24 gauss cm3
h e0
n
4 m pc
în care: eo = sarcina; mp = masa protonului; h = constanta lui Planck.
Valoarea magnetonului nuclear este de aproximativ 2000 ori mai mică decât
magnetonul electronului care are masa de aproximativ de 2000 ori mai mică.
Ca şi electronul nucleul când este supus acţiunii unui câmp magnetic exterior se
va comporta ca un giroscop, axa sa de rotaţie efectuând o mişcare circulară (de
precesie) "precesia Larmour" în jurul axei câmpului magnetic exterior (figura 1).
Figura 1. Precesia Larmour
Pentru orice nucleu în câmp magnetic exterior sunt posibile numai orientările
pentru care proiecţiile momentului magnetic pe axa acestui câmp sunt date de
produsul: gn.nI.n unde:
gn - factor giromagnetic nuclear (pentru proton g = 5,585);
nI - numărul cuantic magnetic nuclear (poate lua 2I + 1 valori, de la -I la +I);
n - magnetonul nuclear.
1
Pentru proton care are I = 1/2 există doar două orientări ( 2 1 ) a căror
2
înclinare faţă de axa câmpului este de aproximativ 54.
Orientarea în sensul câmpului magnetic este mai stabilă (energie mai mică),
decât cea în contra câmpului (energie mai mare).
Diferenţa de energie între cele două orientări este dependentă de câmpul
magnetic exterior (H).
E = n.gn.H, unde:
gn - factor giromagnetic nuclear; n - magnetonul nuclear;
H - câmpul magnetic exterior (Tesla, 1T = 10000 gauss).
Pentru ca protonul să interacţioneze cu o cuantă de radiaţie electromagnetică
este necesar ca aceasta să aibă exact energia E. Numai în acest caz cuanta de energie
36
electromagnetică va putea fi absorbită de proton şi prin urmare îşi va inversa spinul şi
va trece din starea de energie joasă în starea de energie înaltă (figura 2).
Figura 2. Interacţiunea protonului cu o cuantă de radiaţie electromagnetică
Condiţia de rezonanţă va fi dată de relaţia: E = h. = n.gn.H, şi deci,
mărimea frecvenţei de rezonanţă - - este:
= E/h = (n.gn.H) / h
sau
= 2. = 2.(n.gn.H) / h = H , = H / 2
E = hH / 2
unde:
- frecvenţa Larmor
- raportul giromagnetic
Frecvenţa de rezonanţă poate fi calculată şi cu relaţia:
= µn H / h I, unde:
I = numărul cuantic de spin
Ţinând cont că precesia Larmor se face cu o frecvenţă egală cu a cuantelor de
radiaţie electromagnetică absorbită, va reprezenta în acelaşi timp viteza unghiulară a
precesiei.
Diferenţa de energie între cele două orientări este foarte mică în cazul
protonului (comparativ cu electronul). De exemplu, în câmp magnetic de 14000 Gauss,
frecvenţa de rezonanţă corespunde la 60 MHz, unde cu frecvenţe în domeniul radio.
În general, la introducerea unei probe în câmpul magnetic exterior, tendinţa
tuturor nucleelor este de a se aranja în acelaşi sens cu câmpul. În momentul rezonanţei,
protonii cu orientare paralelă trec, ca urmare a absorbţiei de energie, în orientare
antiparalelă.
37
Cedarea energiei absorbite pentru restabilirea echilibrului iniţial are loc prin
fenomene de relaxare: relaxare spin-reţea _ energia este cedată reţelei (probei) sub
formă de căldură _ şi relaxare spin-spin _ energia este cedată pentru modificarea
spinului.
Spectrul RMN, reprezintă curba absorbţiei de energie electromagnetică de către
compusul studiat în funcţie de câmpul magnetic aplicat (sau frecvenţă).
Spectrul RMN se realizează folosind un spectrometru RMN cu schema
prezentată în figura 3:
Figura 3. Schema de principiu a unui spectrometru RMN
Câmpul magnetic, H, pe care îl manifestă cu adevărat un nucleu nu este câmpul
exterior, H0, aplicat ci câmpul magnetic exterior modificat de vecinătăţile locale ale
nucleului, electrice şi magnetice. Câmplu exterior, H0, este modificat de ecranarea
magnetică manifestată de electronii legăturilor înconjurătoare. Deci, valoarea
observată a lui H este dependentă de vecinătăţile moleculare ale protonului ce dau
semnalul (absoarbe sau emite unde de radiofrecvenţă).
În spectrometrul RMN proba este plasată într-un tub în centrul câmpului
magnetic, H0, şi este iradiată cu unde de radiofrecvenţă . Unul din cei doi factori H0
sau se pot modifica . Deoarece câmpul H este proporţional cu frecvenţa, proba de
analizat este supusă fie unui câmp magnetic constant H0 şi variind frecvenţa, fie
invers.
Deoarece fiecare proton primeşte un anumit câmp aplicat şi o frecvenţă
corespunzătoare cu cea de rezonanţă funcţie de vecinătăţile sale, va fi emis un semnal
de o anumită frecvenţă ce poate fi captat de o bobină receptoare (aşezată perpendicular
pe bobina oscilatorului de radiofrecvenţă ), pentru a nu capta frecvenţa generatorului.
Spectroscopia RMN prezintă importanţă majoră pentru chimia organică,
ajutând la elucidarea structurii moleculelor, deoarece factorul giromagnetic _ g _ şi
n
38
deci frecvenţa de rezonanţă, depind în mare măsură de vecinătatea atomică a nucleului
respectiv.
Rezonanţa magnetică a protonului cu spinul 1/2 (I = 1/2) prezintă importanţă
deosebită pentru studiul compuşilor organici, deoarece majoritatea acestora prezintă în
moleculă şi atomi de hidrogen. Faptul că izotopul C12, O16 şi O18 nu au moment
magnetic de spin şi deci nu dau fenomene de rezonanţă magnetică nucleară, prezintă
un avantaj, uşurând interpretarea spectrelor RMN - protonice.
În prezent se execută spectroscopie RMN pentru F19, C13, P13 şi N15 (toate cu
I = 1/2).
Deplasarea chimică
Protonul, în orice combinaţie, se găseşte înconjurat de un nor electronic ce
manifestă o ecranare faţă de câmpul magnetic exterior H0 datorită câmpului magnetic
He asociat curentului electric produs de electronul în mişcare.
Drept urmare asupra protonului nu acţionează întregul câmp magnetic aplicat,
cu alte cuvinte la o frecvenţă dată a oscilatorului (undelor radio) semnalele de
rezonanţă a diferitelor categorii de protoni apar la câmpuri exterioare mai intense decât
cel corespunzător unui proton liber. La fel se întâmplă într-un câmp magnetic constant,
rezonanţa are loc la frecvenţe mai mici ale oscilatorului (unde radio).
Gradul de ecranare a protonului diferă după modul în care este legat protonul în
moleculă. Spre exemplu, în molecula de etanol, protonul cel mai puţin ecranat este cel
din gruparea OH, cel legat de oxigen; mai ecranaţi sunt cei din gruparea CH2 şi mai
ecranaţi cei din gruparea CH3.
La frecvenţă constantă a oscilatorului, variind intensitatea câmpului magnetic
apare un semnal de rezonanţă mai întâi pentru protonul din OH, apoi la o valoare mai
mare a câmpului pentru CH2 şi în sfârşit la o valoare şi mai mare pentru CH3 ,
figura 4.
Figura 4. Semnalul de rezonanţă pentru proton funcţie de gradul de ecranare
Diferenţa dintre intensitatea câmpului magnetic de rezonanţă (sau frecvenţa de
rezonanţă - Hz) şi cea pentru protonul liber se numeşte deplasare chimică şi se
consideră faţă de o linie arbitrară.
39
Diferenţele de ecranare ale diferitelor categorii de protoni, funcţie de modul de
legare în moleculă sunt foarte mici.
Se exprimă în ppm şi se notează cu .
= (Hstandard - Hproton) / Hstandard; ppm = (Hs - Hp).106/Hs
= (standard - proton) / standard; ppm = (s - p).106/s
Pentru tipurile uzuale de protoni, deplasările chimice au valori ale lui cuprinse
între 1 şi 10.
După cum am văzut punctul de zero nu poate fi corect fixat şi din acest motiv
distanţa între diferitele semnale RMN se măsoară faţă de poziţia unui compus standard
(standard extern când este introdus în prealabil în aparat sau standard intern când este
dizolvat în probă).
Standardul dă un singur semnal intens şi îngust la una din extremităţile scalei.
Cel mai utilizat este tetrametilsilanul - TMS - (CH3)4Si lichid cu pf = 27C, formând
un semnal corespunzător celor 12 protoni echivalenţi şi puternic ecranaţi.
Valoarea deplasării chimice este aceeaşi indiferent dacă se lucrează cu un
aparat de 40, 60 sau 100 MHz (frecvenţa radio a oscilatorului), precum şi dacă se
exprimă funcţie de câmp sau frecvenţă.
Este preferabil să se lucreze la frecvenţe mai mari, 60 sau 100 MHz (chiar mai
mult - 220 MHz) pentru care corespunde un câmp mai intens şi se realizează o
extincţie mai mare, cu alte cuvinte un raport semnal/zgomot mai mare, spre deosebire
de alte ramuri ale spectrometriei, unde coeficienţii de extincţie depind foarte mult de
structură.
De exemplu, gruparea carbonil în IR nu are aceeaşi valoare în aldehide, cetone
sau esteri, pe când în RMN, intensitatea semnalului unui proton este aceeaşi indiferent
de gradul de protonare.
Intensitatea benzilor de absorbţie RMN este proporţională cu numărul
protonilor responsabili de absorbţie.
Majoritatea spectrometrelor RMN trasează pe spectru şi curbele integrale. Se
compară valorile relative ale integralelor diferitelor semnale ele fiind în acelaşi raport
ca şi numărul diferitelor categorii de protoni.
Dăm un exemplu de spectru RMN în figura 5.
40
Figura 5. Spectru RMN (lA / lB = nr. protoni A / nr. protoni B).
Deplasările chimice ale câtorva tipuri reprezentative de protoni sunt redate în
tabelul 1.
Tabelul 1. Deplasările chimice pentru grupările metil, metilen şi metin
din diverse combinaţii.
, ppm
Structura
M = CH3 M = CH2 M = CH
Alifatici substituiţi
M-Cl 3,0 3,5 4,0
M-Br 2,7 3,4 4,1
M-NO2 4,3 4,4 4,6
M-OH (sau OR) 3,2 3,4 3,6
M-O- 3,8 4,0 4,6
M-OC(=O)R 3,6 4,1 5,0
M-C=C 1,6 1,9 -
M C C 1,7 2,2 2,8
M-C(=O)H 2,2 2,4 -
M-C(=O)R 2,1 2,4 2,6
M-C(=O) 2,4 2,7 3,4
M-C(=O)OR 2,2 2,2 2,5
M- 2,2 2,6 2,8
Alifatici substituiţi
M-C-Cl 1,5 1,8 2,0
M-C-Br 1,8 1,8 1,9
M-C-NO2 1,6 2,1 2,5
M-C-OH (sau OR) 1,2 1,5 1,8
M-C-OC(=O)R 1,3 1,6 1,8
M-C-C(=O)H 1,1 1,7 -
M-C-C(=O)R 1,1 1,6 2,0
M-C-C(=O)OR 1,1 1,7 1,9
M-C- 1,1 1,6 1,8
41
Aplicaţiile RMN
Una din aplicaţiile RMN a fost şi este identificarea grupelor funcţionale cum ar
fi OH în alcooli şi fenoli, acizi carboxilici, protonii (hidrogenul) din olefine,
hidrogenul acetilenic, din amine, amide.
Deci, prin spectroscopia RMN a protonilor se poate realiza identificarea şi
elucidarea structurii unor molecule organice, metal-organice şi biochimice.
Un spectru RMN, ca şi un spectru IR adesea este suficient pentru identificarea
unui compus organic.
Pentru o identificarea sigură şi pentru a stabili o structură este necesar a se
corobora spectrele RMN cu alte determinări: spectre IR, UV, analiza elementală C, H,
N, spectre de masă etc.
În prezent pe lângă spectroscopia RMN a protonilor se foloseşte şi cea pentru
F 19 (identificarea acestui element în compuşi cu fluor), C13 şi N13.
În analiza cantitativă spectrosopia RMN poate fi folosită pentru faptul că există
o proporţionalitate între aria picurilor şi numărul de nuclee responsabile pentru pic.
Dacă, spre exemplu, se cunoaşte aria semnalului pe proton, aria unui pic poate
fi folosită pentru a stabili concentraţia speciei respective.
Practic se foloseşte un standard intern, comparându-se aria picului standard sau
a compuşilor de analizat, cu condiţia ca aria picului standard să nu depăşească nici
unul dintre picurile probei.
Pentru calibrare se folosesc cel mai mult derivaţi organici de silan, având
picurile protonilor cu localizare înaltă.
Dezavantajul principal al analizei cantitative RMN este costul ridicat al
aparaturii şi dificultatea analizei probelor complexe care se rezolvă mai uşor prin alte
tehnici.
Rezonanţa magnetică nucleară este în mod obişnuit folosită pentru determinarea
structurii substanțelor, dar există şi multe alte aplicaţii importante ale sale.
Spectroscopia RMN de relaxare poate fi folosită pentru a evalua proporţia
dintre faza solidă şi cea lichidă din produse alimentare ce conţin multe lipide, cum ar fi
margarinele. Metoda se bazează pe faptul că timpul de relaxare spin-spin al protonilor
din faza lichidă este mai mare decât al celor din faza solidă. Dacă se înregistrează
variaţia intensităţii semnalului protonilor în timp, se obţin două curbe, corespunzătoare
celor două faze. Prin extrapolarea acestor curbe se obţin intensităţi ale semnalului care
sunt proporţionale cu cantitatea relativă de protoni din faza lichidă şi solidă.
Aplicaţiile RMN în medicină devin tot mai comune, de la simple studii
dinamice la diagnosticarea anormalităţii ţesuturilor.
Studiul prin RMN-13P al sângelui şi al fluidelor celulare permite monitorizarea
în timp real a pH-ului sanguin, tehnică necesară în cazul diabeticilor. Absenţa insulinei
poate conduce la nivele toxice ale acidităţii intracelulare, caz în care o perfuzie cu
hidrogenocarbonat de sodiu poate ajuta la restabilirea pH-ului intracelular normal.
Monitorizarea are loc prin măsurarea deplasării chimice între semnalele fosforului
42
organic şi a celui anorganic. Acest lucru este posibil deoarece semnalul RMN al
fosforului anorganic depinde mult de pH şi se poate deplasa cu până la 1 ppm pentru o
unitate de pH. Aria fiecărui pic se poate utiliza pentru a calcula concentraţia relativă a
fiecărui compus organic (de exemplu ATP), şi în consecinţă se poate evalua starea
metabolică a ţesuturilor.
Folosirea RMN-1H pentru scanarea corpului uman a devenit un fapt obişnuit.
Intensitatea semnalelor RMN-1H depinde atât de densitatea protonică cât şi de timpul
de relaxare al acestora. În consecinţă, protonii din apă, proteine, lipide, carbohidraţi şi
alte substanţe ar trebui să prezinte semnale diferite. Totuşi, principalele specii care au
densităţi de protoni suficient de mari pentru a da un semnal apreciabil sunt apa şi
lipidele. Vecinătăţile nucleelor care intră în rezonanţă dau acestora timpi de relaxare
diferiţi, şi deci semnale diferite. În consecinţă se pot diferenţia diferitele organe ale
corpului.
Imaginile obţinute se numesc imagini de rezonanţă magnetică (s-a renunţat la
termenul „nuclear” pentru a evita asocierea cu radiaţiile nucleare) şi arată asemănător
cu imaginile obținute cu ajutorul razelor X. Imaginile de rezonanţă magnetică se pot
achiziţiona pentru un singur organ sau pentru tot corpul. Imaginile ţesuturilor moi se
pot realiza în orice plan, obţinându-se date complementare cu cele obţinute prin raze X
pentru ţesuturile tari. Scanarea durează aproximativ 20 min, şi de aceea subiectul
trebuie să păstreze nemişcată zona ce va fi scanată în interiorul unui magnet cu
diametru mare.
Nu se cunosc efecte secundare asociate cu această tehnică, ceea ce înseamnă că
o persoană (incluzând indivizii tineri şi cei sensibili) poate fi scanată în mod regulat
pentru a monitoriza evoluţia anumitor stări patologice cum ar fi cancerul sau scleroza
multiplă.
Related docs
Other docs by I559m7B9
CHECKLIST ACDP 10 76 ERECTION OF A 900MM HIGH PRECAST WALL AT TURFLOOP FISH BREEDING STATION
Views: 12 | Downloads: 0
