uiteindelijke versie by 5RtS4h6

VIEWS: 18 PAGES: 8

									Onderzoek: “ De relatie tussen somatic cell count(scc) en
intramammaire infecties bij geiten”
Inleiding
Het celgetal (somatic cell count, scc) bij geiten wordt beïnvloed door verschillende
factoren. Zo varieert het celgetal tussen verschillende leeftijdsgroepen en heeft ook
het lactatiestadium een grote invloed op het celgetal. Ook is uit voorafgaand
onderzoek duidelijk dat het celgetal naarmate een dier langer in de melk is of ouder
wordt zal stijgen (Moroni 2005). Deze factoren maken het dan ook gecompliceerd
om bepaalde celgetalwaarden aan intramammaire infecties te koppelen bij geiten. Bij
koeien zijn er heel duidelijk grenzen ingesteld bij welke waarde van het celgetal we
spreken van een intramammaire infectie. Zo spreken we bij melkkoeien van
(sub)klinische mastitis als ze een celgetal hebben boven de grens van 250000 cellen
per ml. Bij vaarzen spreekt men al van subklinische mastitis als er waarden van boven
de 150000 cellen per ml worden gemeten.(UGCN). Op dit punt is er bij geiten nog
veel ruimte voor onderzoek want duidelijke afkapwaarden zijn er niet, en de opvatting
bestaat dat de scc bij geiten weinig waarde hebben(Schaeren 2006) Bekende
verwekkers van intramammaire infecties bij geiten zijn coagulase negatieve
staphylococcen en Staphylococcus aureus en Corynebacteriën (Min 2007, Schaeren
2006, Bergonier 2003). Uit de literatuur is duidelijk dat een positief bacteriologisch
onderzoek, dus een intramammaire infectie(IMI) vaak gepaard gaan met een hoger
celgetal (Min 2007, Luengo 2004). Het is echter de vraag hoe vaak een IMI de
verklaring is voor hoge celgetallen, en bij welke celgetalwaarden we kunnen spreken
van een intramammaire infectie (Contreras 1997). Dit zal in dit onderzoek de
belangrijkste vraag zijn. Hierbij is het vooral interessant bij welke waarde van het
celgetal we zouden kunnen spreken over een intramammaire infectie. In voorafgaand
onderzoek is het erg onduidelijk, zo niet onmogelijk een afkapwaarde te vinden voor
het celgetal die onderscheid maakt tussen geïnfecteerde en niet- geïnfecteerde
uierhelften (Min 2007, Schaeren 2006). Toch zijn er ook auteurs die wel denken dat er
een verband tussen celgetal en imi ( Contreras 1996), dit geeft aan dat er nog veel
discussie is over dit onderwerp.
Het onderzoeksdoel van deze studie is dan ook om de afkapwaarde van het celgetal te
bepalen waarbij ten opzichte van bacteriologisch onderzoek als gouden standaard de
sensitiviteit en specificiteit van het vaststellen van een intramammaire infectie
optimaal zijn. Hierbij zal een afkapwaarde bepaald worden voor het aantonen van
major pathogenen en voor het aantonen van zowel major als minor pathogenen bij
elkaar.

Onderzoeksmethode

Ongeveer 90% van alle Nederlandse geitenhouders is schriftelijk uitgenodigd deel te
nemen aan dit onderzoek. Uit de 30 veehouders die hebben gereageerd, zijn vijf
boeren geselecteerd om deel te nemen aan de proef.
De belangrijkste selectiecriteria waren een juist aantal dieren in het juiste stadium van
lactatie en coöperativiteit van deze boeren.
Bij elke boer zijn 100 dieren gemarkeerd d.m.v. pootbandjes. Het betrof hier ongeveer
30 dieren van de 1e pariteit, 30 dieren van de 2e pariteit en de overige 60 dieren
hebben een hogere pariteit. Alleen de dieren die minder dan een maand in de melk
waren ten tijde van de 1e monstername zijn geselecteerd.
De melkmonsters werden als volgt verkregen, ten eerste werden er per uierhelft 3
stralen weg gemolken, vervolgens wert de speenpunt en het slotgat grondig ontsmet
met behulp van een watje met 70% alcohol ketonatus waarna het eerste melkmonster
werd afgenomen. Daarna werd dezelfde speen nogmaals ontsmet met behulp van
watten en alcohol waarna het tweede monster wordt afgenomen. Dit werd herhaald bij
de andere uierhelft. Per geit werden dus in totaal 4 melkmonsters genomen.
Vervolgens werden de monsters gekoeld vervoerd naar het melkcontrolecentrum
Vlaanderen. Hier wordt een celgetalbepaling gedaan en wordt er bacteriologisch
onderzoek verricht.( Dit wordt gedaan volgens NMC procedures). De melkmonsters
werden op de volgende verwekkers onderzocht: Staphylococcus aureus,
Staphylococcus spp., Staphylococcus hyicus, Esculine-positieve kokken, Streptococcus
agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, gramnegatieven, Arcanobacterium pyogenes,
Bacillus spp., Corynebacterium bovis, schimmels, gisten, prototheca spp..
De melk werd altijd binnen 12 uur na de monstername ingezet en onderzocht. Hierbij
kregen de monsters verschillende gradaties van één tot en met drie plusjes. Één plusje
staat voor 1 tot 5 kolonies per entoog. Twee plusjes voor 6 tot 10 kolonies per entoog.
En meer dan 10 kolonies per entoog wordt aangeduid met drie plussen.
Er is voor gekozen een uierhelft positief te noemen wanneer 1 van de 2 monsters die
per helft werden afgenomen een verwekker bevatte. Er is besloten om op basis van
celgetal de verwekkers in te delen in de groep major pathogenen of in de groep minor
pathogenen. Als afkapwaarde is 1000.000 cellen/ml gekozen. Op basis hiervan
rekenen we Staphylococcus aureus, Esculine-positieve kokken, Streptococcus
dysgalactiae en Arcanobacterium pyogenes tot de major pathogenen. De verwekkers
Staphylococcus spp., Staphylococcus hyicus, Streptococcus agalactiae,
gramnegatieven, Bacillus spp, Corynebacterium bovis, schimmels, gisten en
prototheca spp. rekenen we tot de minor pathogenen.

Er zijn verschillende berekeningen gebruikt om tot de resultaten te komen. Zo is de
volgende tabel gebruikt om de sensitiviteit, specificiteit, positief voorspellende
waarde (PPV) en negatief voorspellende waarde (NPV).


                        test positief test negatief
conditie aanwezig             A               C
        conditie
                              B               D
        afwezig


Figuur1: Hierbij zit bij de A de groep die volgens de afkapwaarde positief is en waarbij een verwekker
aangetoond kan worden. B is de groep die volgens de afkapwaarde positief is maar waarbij je geen
verwekker kunt aantonen. C is de groep die volgens de afkapwaarde negatief is maar waarbij er wel
een verwekker aangetoond kan worden. Bij D is de test negatief en is er ook geen verwekker aanwezig.

Afgaande op het bovenstaande kan men dan de volgende formules gebruiken:

        sensitiviteit = A / (A + C)
        specificiteit = D / (B + D)

Door de resultaten van de bewerkingen te vermenigvuldigen met 100 levert een
uitdrukking van deze maten in procenten op. De PVW wordt berekend aan de hand
van de formule: A /( A + B) en de NVW met de formule: D / (C + D). Wederom
moeten deze waarden vermenigvuldigd worden met 100% om tot procenten te komen.

Ook is er voor het vergelijken van de celgetallen onderling gebruik gemaakt van een
geometrisch gemiddelde, dit is een gecorrigeerd gemiddelde waarbij van het
daadwerkelijke gemiddelde de log wordt genomen, 10 tot de macht deze log levert
vervolgens het geometrisch gemiddelde.
Verder is er een ROC-curve gemaakt. Het ROC opp. is een maat voor het
onderscheidende vermogen van de test, onafhankelijk van een gekozen afkappunt. Het
geeft de mate aan waarin de test gemiddeld in staat is de positieve dieren van de niet-
positieven te onderscheiden. Hoe groter het ROC-opp. van een test, des te meer de
curve ervan in de linker-bovenhoek ligt, des te beter de test is.
Ook is er voor het onderzoek gebruik gemaakt van de Youden index. De Youden
index laat toe om de waarde (d.w.z. de waarde waarbij je de hoogste mogelijke
combinatie van sensitiviteit en specificiteit wordt bereikt )van een diagnostische test
te beoordelen. Men gebruikt de formule Y= sensitiviteit + specificiteit – 1, waarbij
Y=1 overeenkomt met een perfecte test. Een test met Y=0 daarentegen heeft geen
diagnostische waarde. Echter voor dit onderzoek zegt deze youden- index wel iets
maar zou je toch liever een hogere specificiteit hebben die dan wel ten koste gaat van
de sensitiviteit. Een hoge specificiteit geeft namelijk aan dat je weinig vals positieven
hebt, je gebruikt de formule: aantal true negative) / (aantal true negative + false
positive). Een hoge specificiteit geeft dus aan dat wanneer je een dier positief test je
een goede kans hebt dat het dier ook daadwerkelijk positief is. Echter de
daadwerkelijke kans dat deze positief geteste dieren ook positief zijn, wordt niet
uitgedrukt door de specificiteit, maar door de positief voorspellende waarde. Hierin is
namelijk ook de prevalentie meegenomen. Als iets weinig voorkomt, moet de test heel
specifiek zijn om een acceptabele PPV te hebben. Het probleem van de lage
sensitiviteit is dat er dieren niet gevonden worden met de celgetal test, die in
werkelijkheid wel een imi hadden.
Deze PPV is dan ook een belangrijke parameter waar naar gekeken is om een
acceptabel afkappunt te krijgen.


Resultaten

In tabel 1 zijn de verschillende verwekkers met de daarbij behorende percentages en
celgetallen weergegeven. Streptococcus agalactiae is niet gevonden en zodoende niet
in de tabel 1 weergegeven. Hetzelfde geldt voor de schimmels, gisten en prototheca
spp.. Onderaan de tabel is een extra groep toegevoegd met CBO en STA omdat deze
pathogenen in een aantal van de monsters samen voorkwam.
De twee grootste groepen bestaan uit STA en CBO. In vervolg onderzoek zal er nog
worden gekeken naar de verschillende verwekkers waaruit de groep STA bestaat.
Verder dient opgemerkt te worden dat de CBO bijna allemaal bij één boer gevonden
zijn.
Je ziet in de tabel ook dat een aantal pathogenen maar 1 keer gevonden is. Bij deze
groepen staat dan ook het bijhorende geometrisch gemiddelde van die ene bevinding
vermeld.
Hieronder zal eerst worden ingegaan op bruikbare statistische grafieken vervolgens
zal uitgelegd worden hoe we tot de uiteindelijk afkapwaarde van de test zijn gekomen.
                                          perc.      logscc      Geometrisch gem.
Pathogeen                           N
Arcanobacterium pyogenes              1      0,1%      7,256          18 046 000
Streptococcus dysgalactiae            1      0,1%      7,124          13 295 500
Esculine-positieve kokken             1      0,1%      6,971           9 361 500
Staphylococcus aureus                17      1,7%      6,549           3 539 973
Corynebacterium bovis               176     17,9%      5,832             679 204
Bacillus spp                         26      2,6%      5,82              660 693
Corynebacterium bovis+               52      5,3%      5,808             642 688
Staphylococcus spp.
Staphylococcus spp.                 169    17,2%       5,661             458 142
negatief                            520    52,9%       5,153             142 233
gramnegatieven                        2      0,2%      5,142             138 676
Staphylococcus hyicus                 1      0,1%       5,079            120 000
Mengmonsters                         17      1,7%      5,034             108 143
totaal                              983 100,0%
Tabel 1:. Verschillende pathogenen met hun prevalentie en celgetal genomen van 983 uierhelften over
vijf verschillende bedrijven.
.

Op basis van de gegevens van alle uierhelften is er een ROC-curve gemaakt.
Hieronder is de ROC-curve afgebeeld wanneer 1 van de duplo’s positief is. Het valt
hierbij op dat het onderscheidend vermogen van de test schijnbaar beter is voor de
major-pathogenen alleen als groep. Dan wanneer je de minor-pathogenen ook mee
neemt. Verder zou een test die een diagonale lijn door de punten (0,00;0,00) en
(1,00;1,00) laat zien een waardeloze test zijn. Bij deze grafiek zie je dat er sprake is
van ongeveer 0,25 oppervlakte boven deze diagonale lijn, wat betekend dat er sprake
is van een nuttige test.
                                       ROC curve; 1 of the duplos positive => infected

                  1,00
                  0,90
                  0,80

                  0,70
   sensitivity




                  0,60
                                                                                                            MAJOR
                  0,50
                                                                                                            MAJOR+MINOR
                  0,40

                  0,30
                  0,20

                  0,10
                  0,00
                      0,00   0,10    0,20   0,30    0,40     0,50   0,60       0,70   0,80    0,90   1,00
                                                      (1-specificity)

Figuur 2: Deze figuur laat de ROC curve zien, je ziet dat er sprake is van een groter oppervlak boven
de denkbeeldige diagonale lijn voor de major pathogenen als voor de major en minor groep.

Uit de Figuur 2 kan men heel makkelijk aflezen dat een geschikte afkapwaarde voor
onze test bij de major+minor pathogenen rond het celgetal van 250.000 cellen/ml
moet liggen. Voor de major pathogenen ligt dit getal veel hoger namelijk rond de
3000.000 cellen/ml. Dit zou dus voor specificiteit en sensitiviteit de beste test zijn.

                                     Youden index; 1 of the duplos positive => infected

                  1,00

                  0,90
                  0,80

                  0,70
   Youden index




                  0,60
                                                                                                            MAJOR
                  0,50
                                                                                                            MAJOR+MINOR
                  0,40
                  0,30
                  0,20

                  0,10
                  0,00
                         0     500      1000       1500      2000       2500      3000       3500    4000
                                                          SCC (x1000)

Figuur 3 : Youden index geeft het meest geschikte afkappunt aan wanneer je sensitiviteit en
specificiteit samen zo optimaal mogelijk wilt hebben.

Om tot een geschikt afkappunt te komen is er met behulp van formules in excell een
invultabel gecreëerd waar je een celgetal kunt invullen en waarmee we tot de waarden
in figuur 3 en figuur 4 kwamen.
 MAJOR
 Afkap
 x10^3      SE           SP          YI         PPV         NPV        PREV
      100          1,00       0,32       0,32        0,02        1,00      0,02
      500          0,93       0,65       0,59        0,04        1,00      0,02
     1000          0,93       0,79       0,72        0,06        1,00      0,02
    10000          0,60       0,99       0,59        0,43        0,99      0,02
Figuur 3. Testeigenschappen bij de major pathogenen voor een bepaald celgetal. SE= sensitiviteit,
SP=specificiteit, YI= Youden index, PPV= positief voorspellende waarde, NPV= negatief
voorspellende waarde en PREV= prevalentie

Hierboven staan de testeigenschappen voor verschillende afkapwaarden van het
celgetal, de PPV is echter heel erg laag. Dit is dan ook geen criterium om de
afkapwaarde aan af te leiden. De oorzaak van deze lage PPV is dat de prevalentie heel
laag is, hierdoor zal de PPV nooit hoog kunnen worden. Bij een afkapwaarde van
1000 zie je echter een SE van 0,93 en een specificiteit van 0,79 wat acceptabele
waarden zijn.
Toch is het veel interessanter om een afkapwaarde te vinden voor de Major+ Minor
groep. Omdat er bij een major pathogeen vaak klinische verschijnselen zullen
optreden en het juist handig is om een test te hebben wanneer een dier subklinisch is.

         MAJ+MIN
Afkap    SE       SP      YI                     PPV          NPV          PREV
     100     0,94    0,47                 0,41         0,52         0,92      0,38
     200     0,85    0,63                 0,48         0,58         0,87      0,38
     300     0,73    0,71                 0,44         0,61         0,81      0,38
     350     0,71    0,74                 0,45         0,63         0,80      0,38
     400     0,66    0,76                 0,42         0,63         0,78      0,38
     500     0,60    0,80                 0,40         0,64         0,76      0,38
    1000     0,39    0,88                 0,27         0,67         0,70      0,38
   10000     0,04    0,99                 0,03         0,76         0,63      0,38

Figuur 4: Testeigenschappen bij de major+minor pathogenen voor een bepaald celgetal.

Bekende testeigenschappen voor koeien bij een celgetal van 250000 cellen/ml zijn
voor de T-poll test een specificiteit van 53% en een sensitiviteit van 62%. Voor de
DCC zijn dat een specificiteit van 61% en een sensitiviteit van 67%( onderzoekstage
Twan van Bussel). Hierop afgaande lijkt deze test over prima testeigenschappen te
beschikken. Omdat we meer waarde hechten aan een hoge specificiteit zoals
hierboven uitgelegd en we ook een bruikbare afkapwaarde willen hebben lijkt een
afkapwaarde van 500000 cellen per ml een goede afkapwaarde. Bij deze waarde horen
zoals je hierboven ziet een sensitiviteit van 0,60 en een specificiteit van 0,80, de PPV
is 0,64 wat acceptabel is.




Discussie

Tijdens het onderzoek zijn er veel keuzes gemaakt en aannames gedaan.
Dat leverde dan ook direct discussiepunten op, is een geit daadwerkelijk positief
wanneer je haar uierhelft eenmalig positief test of wanneer je twee keer een positief
monster vindt. Deze aanname is gedaan op basis van het nemen van melkmonsters bij
koeien waar ook maar eenmalig getest wordt. Het is hierbij de vraag of je dan niet alle
tweede genomen monster zou moeten negeren. Hier is niet voor gekozen omdat de
onderzoeksvraag zich richt op het verband tussen imi en het celgetal waarbij dus elk
positief getest monster interessant is om met het bijhorende celgetal te vergelijken.
Echter andere onderzoekers rekenen een monster pas positief als je twee maal
hetzelfde pathogeen aantoont in een uierhelft (Contreras 1997),dit leidt wel tot een
grotere betrouwbaarheid.
De pathogenen die wij als major hebben bestempeld zie je in dit tabelletje ook terug
als de pathogenen met de hoogste celgetallen. Verder is het opvallend dat je in de
helft van de monsters een pathogeen vindt en dat er maar een heel klein deel uit
mengmonsters bestaat namelijk maar 1,7%. In de helft van de monsters vinden we dus
een pathogeen maar dit is natuurlijk niet direct een imi, echter deze dieren zijn we
allemaal positief gerekend wat leidt tot een te hoge fractie dieren die uit de test komen
als positief. Ook was het opvallend dat we bij één boer heel veel Corynebacterium
bovis vonden, over de oorzaak hiervan is niet veel te zeggen echter het is wel bekend
dat Corynebacterium ook een beschermende rol kan invullen tegen bacteriële infecties
( Lam 1997)
Een zwak punt aan dit onderzoek blijft dat al mijn bevindingen gebaseerd zijn op één
punt in de lactatie, dus je weet niet of de afkapwaarden ook bruikbaar zijn als je een
willekeurige geit in lactatie monstert. Verder is het ook erg interessant om te kijken
hoe het celgetal zich ontwikkelt en hoe bacteriologisch onderzoek verandert tijdens de
gehele lactatie wat met eenmalige monstername ook niet mogelijk is. Andere
onderzoekers hebben aangetoond dat intramammaire infecties hoger zijn tijdens het
begin en aan het eind van de lactatie (Min 2007). Er zal echter ook bij dit onderzoek
een vervolgonderzoek plaatsvinden waarin de ontwikkeling van celgetal en
bacteriologisch onderzoek duidelijk worden.
Een sterk punt van dit onderzoek is dat er nu een duidelijke afkapwaarde is waar een
boer wel wat mee kan afgaande op een PPV van 0,64 mits het dier minimaal een week
en maximaal 4 weken in lactatie is. Ook lijken de sensitiviteit en specificiteit van deze
test heel acceptabel als je kijkt met welke waarden ze genoegen nemen voor testen bij
koeien ( onderzoekstage Twan van Bussel 2006). Geitenboeren kunnen via hun
melkcontrole dan de dieren nalopen die een celgetal van boven de 500.000 cellen/ml
hebben en deze dieren dan bemonsteren waardoor men een duidelijk beeld kan krijgen
van welke kiemen een rol spelen op een bedrijf.
Dat het celgetal bij geiten een beperkte waarde zou hebben (Schaeren 2006) kun je in
twijfel trekken omdat je een afkapwaarde kunt vinden met een acceptabele PPV.
De onderzoeksvraag lijkt dan ook beantwoordt want er is een duidelijke afkapwaarde
te vinden en er is zeker sprake van een verband tussen celgetal en imi.

Bronnen:
   1) Risk factors for intramammary infections and relationship with somatic-cell
      counts in Italian dairy goats. Moroni P, Pisoni G, Ruffo G, Boettcher PJ.Prev
      Vet Med. 2005 Jul 12;69(3-4)163-73. Epub 2005 Mar 19.
   2) UGCN ( uiergezondheid centrum Nederland)
   3) Prevalence of subclinical udder infections and individual somatic cell counts
      in three dairy goat herds during a full lactation. Schaeren W. Maurer J Schweiz
       Arch Tierheilkd. 2006.
4) Effect of subclinical intramammary infection on somatic cell counts and
   chemical composition of goats' milk. Min BR, Tomita G, Hart SP.J Dairy Res.
   2007 May;74(2):204-10. Epub 2007 Jan 17
5) Mastitis of dairy small ruminants. Bergonier D, de Crémoux R, Rupp R,
   Lagriffoul G, Berthelot X. Vet Res. 2003 Sep-Oct;34(5):689-716. Review
6) Influence of intramammary infection and non-infection factors on somatic cell
   counts in dairy goats. Luengo C, Sánchez A, Corrales JC, Fernández C,
   Contreras A.J Dairy Res. 2004 May;71(2):169-74.
7) Persistence of subclinical intramammary pathogens in goats throughout
   lactation. Contreras A, Corrales JC, Sanchez A, Sierra D.J Dairy Sci. 1997
   Nov;80(11):2815-9.
8) Het gebruik van de DeLaval Direct Cell Counter ter ondersteuning van
   mastitis management op melkveebedrijven Twan van Bussel 2006.
9) Effect of natural infection with minor pathogens on susceptibility to natural
   infection with major pathogens in the bovine mammary gland. Lam TJ,
   Schukken YH, van Vliet JH, Grommers FH, Tielen MJ, Brand A. 1997 Jan,
   58(1):17-22.

								
To top