Real Time PCR 2 by B4Z4B9U2

VIEWS: 84 PAGES: 13

									              ประเมินประสิ ทธิภาพการรักษาของยามาลาเรีย ด้ วยเทคนิค Real-Time PCR
         (Assessment of a Real-Time PCR for Monitoring Efficacy of Antimalarial Treatment)

บทนา
              1. ความเป็ นมา
                      ม า ล า เ รี ย ยั ง ค ง เ ป็ น ปั ญ ห า ท า ง ส า ธ า ร ณ สุ ข ข อ ง ป ร ะ เ ท ศ ไ ท ย
มีมากตามบริ เวณพื้นที่ป่าและชายแดน จากข้อมูลของสานักโรคติดต่อนาโดยแมลง ในปี งบประมาณ 2547-
2548 มี จ านวนผู ้ป่ วยมาลาเรี ย ลดลง แต่ ใ นช่ ว งเดื อ น เมษายน-มิ ถุ น ายน 2548 ยัง มี จ านวนเพิ่ ม สู ง ขึ้ น
          ้                    ้
ทั้งในผูป่วยไทยและผูป่วยต่างชาติ (รู ปที่ 1)
                      จากปั ญหาการดื้อต่อยามาลาเรี ย ได้ขยายวงกว้างมากขึ้น ทาให้ยากต่อการควบคุมในทุกพื้น
ที่       ทั้ ง นี้ ค ว ร มี ยุ ท ธ วิ ธี ใ น ก า ร เ ฝ้ า ติ ด ต า ม ก า ร ดื้ อ ย า [ 1 ]
ก า ร ดื้ อ ย า สั ม พั น ธ์ กั บ ก า ร ต อ บ ส น อ ง ต่ อ ก า ร รั ก ษ า ที่ ไ ม่ ไ ด้ ผ ล [ 2 ]
ซึ่ งอัตราการรักษาที่ไม่ได้ผลเพิ่มสู งขึ้นในพื้นที่ที่แพร่ เชื้อนั้น ควรจะมีการควบคุมทางระบาดวิทยา
                      ในประเทศไทย เชื้อมาลาเรี ยชนิดฟัลซิ ปารัมดื้อต่อยาคลอโรควิน มากว่า 40 ปี แล้ว และ
เริ่ ม ขย า ย วง ก ว้ า ง ม าก ขึ้ นใ น ร ะ ย ะ 1 0 ปี หลั ง แล ะ ต่ อ ม า ได้ เ กิ ดก า รดื้ อ ต่ อย า เม ฟ โ ฟล ค วิ น
โดยเฉพาะในเขตพื้ น ที่ ช ายแดนไทย-พม่ า [3] และพบการดื้ อ ต่ อ ยา ซั ล ฟาดอกซิ น /ไพริ เ มธามิ น
ในเชื้อมาลาเรี ยชนิดไวแวกซ์ [4]
                      ทั้ ง นี้ ในการควบคุ ม การระบาดของเชื้ อมาลาเรี ย ในส่ วนหนึ่ งต้ อ งอาศั ย ความรู ้
                                   ั            ั
ความก้าวหน้าจากการวิจยทางห้องปฏิ บติการ และภาคสนาม [5] ซึ่ งวิธีทางห้องปฏิบติการที่มีความไว            ั
รวดเร็ ว เป็ นที่ ย อมรั บ สามารถน ามาใช้ใ นการตรวจวินิ จฉัย และประเมิ น ประสิ ท ธิ ภ าพการรั ก ษา [6]
ทั้ง นี้ สามารถเลื อ กแต่ ล ะวิ ธี ใ นการตรวจวิ นิ จ ฉั ย การใช้ ก ล้อ งจุ ล ทรรศน์ เ ป็ นวิ ธี ที่ ใ ช้ อ ย่า งแพร่ ห ลาย
แต่ ท้ ัง นี้ ต้ อ งอาศั ย ผู ้ช านาญเฉพาะ [7] มี ก ารศึ ก ษาวิ ธี ก ารตรวจวิ นิ จ ฉั ย มาลาเรี ย อย่ า งต่ อ เนื่ อ ง
โ ด ย เ ฉ พ า ะ วิ ธี ท า ง ภู มิ คุ ้ ม กั น วิ ท ย า ห รื อ ชุ ด ต ร ว จ แ บ บ ร ว ด เ ร็ ว
สามารถนาไปใช้ในภาคสนามหรื อถิ่นทุรกันดารได้ เนื่องจากเป็ นวิธีที่ทาง่าย ใช้ปริ มาณตัวอย่างเลือดน้อย [8]
                                            ้                                                   ั
ใช้เวลาในการตรวจวินิจฉัยน้อย ไม่ตองอาศัยผูเ้ ชี่ ยวชาญ [6] แต่อย่างไรก็ตาม วิธีดงกล่าว ยังมีความไวต่ า
ในกรณี เชื้ อในเลื อ ดต่ า หรื อ การติ ด เชื้ อเฉี ยบพลั น [9] นอกจากนี้ อาจเกิ ด การตรวจผิ ด ได้
ในกรณี แอนติ เจนที่ ยง คงค้า งอยู่ใ นเลื อด และยัง ไม่สามารถแยกเชื้ อมาลาเรี ยทั้ง 4 ชนิ ด ได้ [6] วิธี PCR
                                 ั
(polymerase chain reaction) เป็ นวิธีก ารตรวจวินิจฉัย มาลาเรี ย ที่ มีความไว และความจาเพาะสู งสุ ด
และสามารถน ามาใช้เ ป็ นมาตรฐาน (gold standard) ในการตรวจวิ นิ จ ฉั ย [7] เชื้ อ มาลาเรี ย
โดยเฉพาะอย่างยิ่งในกรณี ที่มีปริ มาณเชื้ อมาลาเรี ยจานวนน้อยมากๆในเลื อด [3] อย่างไรก็ตาม วิธี PCR
                 ิ                   ่               ั
ส่ วนใหญ่วธีการจะค่อนข้างยุงยาก ในทางปฏิบติไม่เหมาะสมสาหรับการตรวจวิเคราะห์ตวอย่างจานวนมากๆ         ั
และไม่สามารถตรวจวิเคราะห์เชิงปริ มาณได้


                                                                                                                        1
                    Real-time PCR เป็ นวิธีใหม่ที่กาลังเป็ นที่นิยม ซึ่ งเกิดจากการพัฒนาเทคโนโลยี 2 ส่ วน
ใหญ่ ๆ คือ การพัฒนาเทคโนโลยีในการตรวจหา PCR products ในสารละลายโดยการใช้สารเรื องแสง
(fluorescence reporters) ต่าง ๆ และการพัฒนาเครื่ อง thermocycler มาเป็ นเครื่ อง real time thermocycler
โดยเพิ่มส่ วนที่เป็ นแหล่งกาเนิดแสงเพื่อไปก่อให้เกิดการเรื องแสงของ                   PCR          products
และส่ วนตรวจวัดการเรื องแสงที่เกิดจาก PCR product ในหลอดปฏิกิริยา ทาให้สามารถตรวจวัดปริ มาณ
PCR products ที่เกิดขึ้นจริ ง ณ เวลานั้น ๆ [6]
                    ในการศึกษาครั้งนี้ ได้นา วิธี Real-time PCR มาประยุกต์ใช้ในการติดตามความก้าวหน้าใน
การรักษา โดยเปรี ยบเทียบกับการใช้กล้องจุลทรรศน์ เพื่อประโยชน์ในงานด้านระบาดวิทยา


                                จำนวนผู้ป่วย (คน)
                                 6,000
                                                                                                              a)
                                 5,000

                                 4,000

                                 3,000

                                 2,000

                                 1,000

                                   -0
                                          ต.ค. พ.ย. ธ.ค. ม.ค. ก.พ. มี.ค. เม.ย. พ.ค. มิ.ย. ก.ค. ส.ค. ก.ย.
                                    0
                         ปี งบประมาณ 2547 1,893 2,904 3,101 1,724 1,475 1,113 1,180 2,602 4,687 2,778 2,017 1,636
                                    0
                         ปี งบประมาณ 2548 1,424 1,938 2,131 1,374 1,096 1,099 1,455 3,289 4,822 3,720 2,983 2,208
                                    0



                                จำนวนผู้ป่วย (คน)
                                 7,000                                                                         b)
                                 6,000
                                 5,000
                                 4,000
                                 3,000
                                 2,000
                                 1,000
                                   -0
                                          ต.ค. พ.ย. ธ.ค. ม.ค. ก.พ. มี.ค. เม.ย. พ.ค. มิ.ย. ก.ค. ส.ค. ก.ย.

                         ปี งบประมาณ 2547 2,186 3,382 3,636 1,773 1,503 1,156 1,458 2,548 5,749 3,045 2,413 1,801
                         ปี งบประมาณ 2548 1,750 1,681 1,881 1,098 922   940 2,097 3,642 6,490 3,319 2,515 2,112




                         ้                                        ้                     ้
    รู ปที่ 1 แสดงจานวนผูป่วยมาลาเรี ย ปี งบประมาณ 2547-2548 a) ผูป่วยต่างชาติ และ b) ผูป่วยไทย




                                                                                                                    2
            2. สมมติฐาน
                    ศึกษาความเป็ นไปได้ในการพัฒนาการประเมินประสิ ทธิภาพการรักษามาลาเรี ย
                ้
โดยติดตามผูป่วยหลังรับการรักษา โดยวิธี Real-time PCR จาก องค์การอนามัยโลก (WHO)
ได้กาหนดระดับการดื้อยา (S, RI, RII และ RII) อิงกับปริ มาณเชื้ อที่ตรวจได้จากกล้องจุลทรรศน์
          ั              ้                                                ้
ซึ่ งวิธีดงกล่าวขึ้นกับผูตรวจในแต่ละคน หรื อในแต่ละวัน แต่ถาใช้ เทคนิค Real-time PCR
จะช่วยตัดปั ญหาการแปรปรวนเหล่านี้ได้                        ประกอบกับวิธีน้ ีมีความไวและความจาเพาะสู งกว่า
ดังนั้นในการแบ่งประเภท อาจเป็ นไปได้ในกรณี ระดับการดื้อยา RI จากการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์
เปลี่ยนเป็ น ระดับการดื้อยา RII เมื่อตรวจด้วย Real-time PCR
            3. วรรณกรรม/สารสนเทศ (information) ที่เกี่ยวข้อง
                    จากปั ญหาการดื้อต่อยารักษามาลาเรี ย ที่ขยายวงกว้างมากขึ้น ในประเทศไทย พบการดื้อต่อ
ยา ซัลฟาดอกซิน/ไพริ เมธามิน ในเชื้ อมาลาเรี ยชนิดไวแวกซ์ [4]                 และการดื้อต่อยาคลอโรควิน ของ
เชื้อมาลาเรี ยชนิดฟัลซิ ปารัม โดยเฉพาะในเขตพื้นที่ชายแดนไทย-พม่า [3] ทั้งนี้ควรมีการเฝ้ าติดตามการดื้อยา
[1]
                    Ciceron L. และคณะ (1999) ได้ศึกษาประสิ ทธิภาพการรักษาของยามาลาเรี ย โดยเปรี ยบ
เทียบการตรวจฟิ ล์มเลือด ด้วยกล้องจุลทรรศน์ และ PCR พบว่า การตรวจวินิจฉัยด้วยกล้องจุลทรรศน์
มีความไวต่ากว่า                      PCR                      ซึ่งเมื่อตรวจวินิจฉัยด้วย                 PCR
ให้ผลยืนยันการพบเชื้อในช่วงเวลาการติดตามที่นานกว่า                     โดยการตรวจพบเชื้ อหลังวันที่       5-8
                                       ่
หลังจากรับการรักษา อาจคาดการณ์วาเกิดจากเชื้ อดื้อต่อยา [10]
                    Erah P.O. และคณะ (2003) ได้ศึกษาการดื้อต่อยา คลอโรควิน ของเชื้ อมาลาเรี ยชนิด
                                                 ้
ฟัลซิ ปารัม โดยแบ่งระดับการดื้อยา ซึ่ งศึกษาในผูป่วยแสดงอาการไข้มาลาเรี ยในประเทศไนจีเรี ย จานวน 218
ตัวอย่าง พบว่า จากการติดตามการรักษาเป็ นเวลา 7 วัน มีการดื้อยาในระดับ R2 และ R3 เท่ากับ ร้อยละ 37.2
และ 17.4 ตามลาดับ [11]
                    Broek I. และคณะ (2005) ได้ประเมินประสิ ทธิ ภาพการรักษามาลาเรี ย ที่ติดเชื้ อมาลาเรี ย
ชนิดฟัลซิปารัม ด้วยยา อาร์ ติซูเนต+อะโมดิเอควิน และ อาร์ ติซูเนต+ซัลฟาดอกซิน/ไพริ เมธามิน ในเด็กอายุ
6-59 เดือน ในประเทศซูดาน โดยติดตามการรักษาเป็ นเวลา 42 วัน ตรวจวินิจฉัยด้วยกล้องจุลทรรศน์ และใช้
PCR ตรวจสอบแยก การติดเชื้อซ้ าจากเชื้ อเก่าหรื อใหม่ พบว่ายา อาร์ ติซูเนต+ซัลฟาดอกซิน/ไพริ เมธามิน
                                                                    ู้
มีประสิ ทธิ ภาพการรักษาดีกว่า อาร์ ติซูเนต+อะโมดิเอควิน ซึ่งมีผป่วยมีไข้กลับหลังการรักษาร้อยละ 4.4 และ
15 ตามลาดับ [12]
                                                                             ั
                    จากการศึกษาดังกล่าว พบว่า การดื้อยา มีความสัมพันธ์กบการตอบสนองต่อการรักษาที่ไม่


                                                                                                           3
ได้ผล                [2]               ซึ่ ง       อัตราการรักษาที่ไม่ได้ผลเพิมสู งขึ้นในพื้นที่ที่แพร่ เชื้อนั้น
                                                                              ่
ควรจะมีการควบคุมทางระบาดวิทยา [3]
                                                 ั
                 มีรายงานการศึกษาในหลายทีมวิจยจากต่างประเทศ เช่น คณะของ Farcas G.A. (2004)
คณะของ         Perandin     F.       (2004)     และ        คณะของ          Mangold        K.A.           (2005)
ได้เปรี ยบเทียบการตรวจวินิจฉัยเชื้อมาลาเรี ย โดยการตรวจฟิ ล์มเลือดด้วยกล้องจุลทรรศน์ กับ PCR และ
Real-Time PCR พบว่า การตรวจวินิจฉัยด้วย Real-Time PCR มีความไวและความจาเพาะสู งสุ ด [6, 13 และ
14]

                    จากการศึกษาดังกล่าว การควบคุม การระบาดของเชื้ อมาลาเรี ย ในส่ วนหนึ่งต้องอาศัยความ
                             ั               ั
รู้ ความก้าวหน้าจากการวิจยทางห้องปฏิบติการ [5] ซึ่งเทคนิค Real-time PCR เป็ นวิธีใหม่ที่กาลังเป็ นที่นิยม
ในการวินิจฉัยเชื้อมาลาเรี ยทั้ง 4 ชนิด [6]
                                                                                       ้
                    Lee M.A. และคณะ (2002) ศึกษาการตรวจวินิจฉัยเชื้อมาลาเรี ยในผูป่วยแสดงอาการไข้
มาลาเรี ยที่มารับการตรวจในโรงพยาบาล                       ประเทศสิ งคโปร์                โดยเปรี ยบเทียบ
การตรวจฟิ ล์มเลือดด้วยกล้องจุลทรรศน์ กับ Real-Time PCR และใช้ติดตามการรักษา พบว่า จากวันที่ 1-5
ฟิ ล์มเลือดมีความหนาแน่นของเชื้อลดลงจากร้อยละ 0.45 เป็ น 0 ในขณะที่ การตรวจวินิจฉัยด้วย Real-Time
PCR           ลดลงจาก 2 x 104 – 0.17 ต่อเลือด 5 ไมโครลิตร แสดงให้เห็นว่าทั้ง 2
วิธีใช้ติดตามประสิ ทธิ ภาพการรักษาของยามาลาเรี ยได้ แต่ วิธี Real-Time PCR มีความไวมากกว่า [15]
                                                                                             ้
                    Hutagalumg R. และคณะ (2005) ได้ทดลองรักษามาลาเรี ยชนิดฟัลซิปารัม ในผูป่วยแสดง
อาการไข้มาลาเรี ย 490 ตัวอย่าง ใน อ.แม่สอด จ.ตาก ตั้งแต่ปี ค.ศ. 2001 - 2002 ด้วยยา อาร์ ติมิเทอร์ -
ลูมิแฟนทริ น และ เมฟโฟลควิน-อาร์ติซูเนต โดยติดตามเป็ นเวลา 42 วัน ด้วย PCR พบว่า ยาทั้ง 2 กลุ่ม
                                 ั
มีประสิ ทธิ ภาพสู ง สามารถใช้กบเชื้อมาลาเรี ยชนิ ดฟัลซิ ปารัมที่ด้ือต่อยาสู งๆได้ [16]
                                                                                           ั
                    จากการศึกษาทั้งในประเทศและต่างประเทศเหล่านี้ ทาให้เป็ นที่มาของงานวิจยครั้งนี้ที่จะ
ศึกษาความเป็ นไปได้ในการพัฒนาการประเมินประสิ ทธิภาพการรักษามาลาเรี ย
               ้
โดยติดตามผูป่วยหลังรับการรักษา โดยการตรวจวินิจฉัยด้วยกล้องจุลทรรศน์ เปรี ยบเทียบกับ Real-time PCR
                                           ่
ซึ่ งถ้ารักษาไม่ได้ผล อาจคาดการณ์วา เชื้ อดื้อต่อยา โดย องค์การอนามัยโลก (WHO)
ได้กาหนดระดับการดื้อยา (S, RI, RII และ RII) อิงกับปริ มาณเชื้ อที่ตรวจได้จากกล้องจุลทรรศน์ [10]
          ั              ้                                              ้
ซึ่ งวิธีดงกล่าวขึ้นกับผูตรวจในแต่ละคน หรื อในแต่ละวัน แต่ถาใช้ เทคนิค Real-time PCR
จะช่วยตัดปั ญหาการแปรปรวนเหล่านี้ได้ [15]                 ประกอบกับวิธีน้ ีมีความไวและความจาเพาะสู งกว่า
ดังนั้นในการแบ่งประเภท อาจเป็ นไปได้ในกรณี ระดับการดื้อยา RI จากการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์
เปลี่ยนเป็ น ระดับการดื้อยา RI เมื่อตรวจด้วย Real-time PCR

วัตถุประสงค์ ของโครงการวิจัย


                                                                                                               4
             1. เพื่อประเมินประสิ ทธิภาพการรักษาของยามาลาเรี ย
โดยเปรี ยบเทียบการตรวจวินิจฉัยเชื้อมาลาเรี ยด้วย วิธี Real-Time PCR และการตรวจฟิ ล์มเลือด
โดยกล้องจุลทรรศน์

         ่
สถานทีศึกษาวิจัย และระยะเวลาศึกษาวิจัย
             1. สถานที่ศึกษาวิจย   ั
                      - ศูนย์ควบคุมโรคติดต่อนาโดยแมลงที่ 9.3 แม่สอด จ.ตาก
              -         ศูนย์อบรมโรคติดต่อนาโดยแมลง พระพุทธบาท จ.สระบุรี
              -               ้                   ั
                        ศูนย์อางอิงทางห้องปฏิบติการฯ สานักโรคติดต่อนาโดยแมลง กรมควบคุมโรค
             2. ระยะเวลาศึกษาวิจย    ั
                      12 เดือน ( พฤษภาคม 2550 – เมษายน 2551)
วิธีการทาการวิจัย
             1. ประชากรที่จะศึกษา
 -                      เลือดติดเชื้อมาลาเรี ยชนิดเดี่ยว (monoinfection) (ความหนาแน่นระหว่าง 1,000 – 80,000
                                           ้
ตัว/เลือด 1 ไมโครลิตร) จากผูป่วยที่เป็ นโรคมาลาเรี ย ที่เข้ามารับบริ การตรวจในมาลาเรี ยคลินิก ของ
ศูนย์ควบคุมโรคติดต่อนาโดยแมลงที่ 9.3 แม่สอด จ.ตาก
                      - จานวนประชากร 50 ตัวอย่าง                   (อ้างอิงจากมาตรฐานของ องค์การอนามัยโลก
ที่แสดงในวารสารเรื่ อง Monitoring Antimalarial Drug Resistance, Report of WHO Consultation,
Geneva, Switzerland, 3-5 December 2001)
             2. ขั้นตอนดาเนินงานวิจย   ั
                      2.1 การคัดเลือกและเก็บตัวอย่างเลือดสาหรับการตรวจวินิจฉัย
                                                                           ้
                                คัดเลือกตัวอย่าง จานวน 50 ตัวอย่าง จาก ผูป่วยโรคมาลาเรี ยที่เข้ามารับบริ การ
ตรวจที่มาลาเรี ยคลินิก ของ ศูนย์ควบคุมโรคติดต่อนาโดยแมลงที่ 9.3 แม่สอด จ.ตาก เก็บตัวอย่างเลือด
นามาทาฟิ ล์มหนาและบาง และเก็บอีกส่ วนหนึ่งโดยหยดเลือดบนกระดาษ Whatman 3 MM ปล่อยทิ้งให้แห้ง
เพื่อใช้ทดสอบด้วยวิธี Real-time PCR
                      2.2 การคัดเลือกและเก็บตัวอย่างเลือดสาหรับการติดตามการรักษา
                                จากตัวอย่างข้อ 2.1 ติดตามการรักษามาลาเรี ยชนิดฟัลซิปารัม หลังจากได้รับยา
(Combination drugs) ตามตารางที่ 1 โดยทาการเก็บเลือดหลังได้รับยารักษามาลาเรี ยดังกล่าว ในวันที่ 3, 7,
14 และ 28 นามาทาฟิ ล์มหนาและบาง และเก็บอีกส่ วนหนึ่งโดยหยดเลือดบนกระดาษ Whatman 3 MM
ปล่อยทิงให้แห้ง เพื่อใช้ทดสอบด้วยวิธี Real-time PCR
           ้
                      2.3 การวินิจฉัยเชื้อมาลาเรี ย
                                ตรวจวินิจฉัยฟิ ล์มเลือดด้วยกล้องจุลทรรศน์ และ ทดสอบด้วย วิธี Real-time
                                         ั
PCR (ตามขั้ นตอนในงานศึกษาวิจยของ ดร.คนึงนิจ คงพ่วงและคณะ ปี ค.ศ.2008 [16])

                                                                                                          5
                2.4 การจาแนกระดับการดื้อยาและการตอบสนองต่อการรักษา

                                             การจาแนกระดับการดื้อยา
        การดื้อยามีระดับแตกต่างกันตั้งแต่ด้ือน้อยๆ             ดื้อปานกลาง                จนถึงดื้อมาก
กลุ่มนักวิชาการได้จาแนกชั้นการดื้อยาที่ทดสอบในผูป่วยหรื อ in vivo ไว้ดงนี้
                                                   ้                  ั

        S       คือ                                                            ้
                        ไวต่อยา เชื้ อมาลาเรี ยหมดไปภายใน 7 วัน หลังผูป่วยได้รับยาและเชื้อไม่กลับมา
                        ปรากฏอีกเลย
        RI      คือ                    ้
                        ดื้อน้อยหลังผูป่วยได้ยา เชื้อมาลาเรี ย เชื้อมาลาเรี ยหมดไปเหมือนใน S แต่จะกลับ
                                             ู้ ั
                        มา มีเชื้ออีก โดยที่ผน้ นไม่ได้รับเชื้ อเข้าไปใหม่
        RII     คือ                             ้
                        ดื้อปานกลาง หลังผูป่วยได้ยา เชื้อมาลาเรี ยลดลงมาก ในวันที่ 7 เชื้อยังไม่หมด
                        เหลือ อยู่ 25 % หรื อน้อยกว่า
        RIII    คือ                      ้
                        ดื้อมาก หลังผูป่วยได้ทานยา 48 ชม. เชื้อมาลาเรี ยกลับเพิ่มเติมหรื อไม่ลดลง หรื อ
                                                               ่             ้
                        ลด ลง เพียงเล็กน้อย มีเชื้อเหลืออยูมากกว่า 25 % ผูป่วยมักมีอาการทรุ ดลง [17]

                                  ประเภทการตอบสนองต่อการรักษา [18]

             ้ ่ ี่
           พืนทีทมีการแพร่ ในระดับเชื้อสู ง                   ้ ่ ี่
                                                            พืนทีทมีการแพร่ เชื้อในระดับต่าถึงปานกลาง
                                       Early Treatment Failure (ETF)
ETF                                                   ETF
 มีอาการแสดงรุ นแรงในวันที่ 1 2 หรื อ 3 และยัง  มีอาการแสดงรุ นแรงในวันที่ 1 2 หรื อ 3 และยัง
มีเชื้อในเลือด                                        มีเชื้อในเลือด
 มีเชื้อในเลือดในวันที่ 2 สู งกว่า วันที่ 0           มีเชื้อในเลือดในวันที่ 2 สู งกว่า วันที่ 0
 มีเชื้อในเลือดในวันที่ 3 และอุณหภูมิ ≥ 37.5 0 C  มีเชื้อในเลือดในวันที่ 3 และอุณหภูมิ ≥ 37.5 0 C
 มีเชื้อในเลือดในวันที่ 3 ≥ 25 % (ของการนับใน  มีเชื้อในเลือดในวันที่ 3 ≥ 25 % (ของการนับใน
วันที่ 0                                              วันที่ 0
              ้ ่ ี่
           พืนทีทมีการแพร่ ในระดับเชื้อสู ง                    ้ ่ ี่
                                                            พืนทีทมีการแพร่ เชื้อในระดับต่าถึงปานกลาง
                                       Late Treatment Failure (LTF)
Late Clinical Failure                                 Late Clinical Failure
 มีอาการแสดงรุ นแรงหลังวันที่ 3 และมีเชื้อใน          มีอาการแสดงรุ นแรงหลังวันที่ 3 และมีเชื้อใน
เลือด (นอกเหนือจากเกณฑ์ของ ETF)                       เลือด (นอกเหนือจากเกณฑ์ของ ETF)
 มีเชื้อในเลือด และมีอุณหภูมิ ≥ 37.5 0 C ใน           มีเชื้อในเลือด และมีอุณหภูมิ ≥ 37.5 0 C ใน

                                                                                                        6
ระหว่างวันที่ 4 ถึง 14 (นอกเหนือจากเกณฑ์ของ                     ระหว่างวันที่ 4 ถึง 28 (นอกเหนือจากเกณฑ์ของ
ETF)                                                            ETF)
Late Parasitological Failure                                    Late Parasitological Failure
 มีเชื้อในเลือดในวันที่ 14 และมีอุณหภูมิ < 37.5 0               มีเชื้อในเลือดในระหว่างวันที่ 7 ถึง 28 และมี
C (นอกเหนือจากเกณฑ์ของ ETF และ LCF)                             อุณหภูมิ < 37.5 0 C (นอกเหนือจากเกณฑ์ของ ETF
                                                                และ LCF)




                2.5 สถานที่ทาการทดลอง/เก็บข้อมูล
                        ดาเนินการคัดเลือกและเก็บตัวอย่างที่ศูนย์ควบคุมโรคติดต่อนาโดยแมลงที่ 9.3
อ.แม่สอด จ.ตาก                            ้                                   ้            ั
                        และตรวจวิเคราะห์ดวยวิธี Real-time PCR ที่ศูนย์อางอิงทางห้องปฏิบติการฯ
สานักโรคติดต่อนาโดยแมลง กรมควบคุมโรค
                                                       ้
                2.6 การเก็บรวบรวมข้อมูล และวิเคราะห์ขอมูล
                                                                            ้
                        ใช้โปรแกรมคอมพิวเตอร์ สาหรับการเก็บและวิเคราะห์ขอมูล โดยคานวณค่า เฉลี่ย
สัดส่ วน ร้อยละ

            ี่
ประโยชน์ ทจะได้ รับจำกกำรวิจัย
               1. นามาประยุกต์ใช้ในการตรวจวินิจฉัย
และหาปริ มาณความหนาแน่นของเชื้ อมาลาเรี ยในเลือด
เป็ นการตรวจเพิ่มเติมนอกเหนือจากการตรวจวินิจฉัยปกติ
               2. สามารถประยุกต์ใช้ในการติดตามประสิ ทธิภาพของยารักษามาลาเรี ย
                                      ้
ซึ่ งเหมาะกับเชื้อที่ด้ือต่อยา โดยใช้ขอมูลในการเตือนระยะเบื้องต้น
               3. นามาประยุกต์ใช้ทางระบาดวิทยา
เช่นใช้ตรวจสอบเชื้อมาลาเรี ยจากตัวอย่างเลือดในพื้นที่ที่ไม่แพร่ เชื้ อ
หรื อกับนักท่องเที่ยวที่ไปในพื้นที่ที่มีการแพร่ เชื้อเพื่อคัดแยกเชื้อ เป็ นการป้ องกันการแพร่ เชื้อต่อไป

ผลการศึกษา
                            ั
          การศึกษาวิจยครั้งนี้ ได้ประเมินประสิ ทธิภาพการรักษาของยามาลาเรี ย (Combination drugs) ใน
ก า ร รั ก ษ า ผู ้ ป่ ว ย ที่ ติ ด เ ชื้ อ ม า ล า เ รี ย ช นิ ด ฟั ล ซิ ป า รั ม                แ ส ด ง ต า ม ต า ร า ง ที่ 1
โ ด ย คั ด เ ลื อ ก ผู ้ ป่ ว ย ดั ง ก ล่ า ว ที่ ยิ น ย อ ม เ ป็ น อ า ส า ส มั ค ร บ ริ จ า ค เ ลื อ ด จ า น ว น 5 0 ค น
และนัดหมายมาเจาะเก็บเลือดหลังได้รับยารักษามาลาเรี ยดังกล่าว ในวันที่ 3, 7, 14 และ 28
                                                                                                                             7
            จากอาสาสมั ค รบริ จาคเลื อ ด จ านวน 50 คน                มี อ าสาสมั ค รบริ จาคเลื อ ด 36 คน
ที่ มี ก ารเจาะเก็ บ เลื อ ดครบตามที่ นัด หมาย ในวัน ที่ 3, 7, 14 และ 28 โดยเป็ นเพศชาย 40 คน (80%)
เป็ นเพศหญิง 10 คน (20%) สัญชาติไทย 11 คน (22%) สัญชาติ พม่า 39 คน (78%) อายุเฉลี่ย 30 ปี
อุณหภูมิเฉลี่ยเริ่ มต้น 38 องศาเซลเซียส และความหนาแน่นของเชื้อเริ่ มต้นเฉลี่ย 403 ตัว/เลือด 1 ไมโครลิตร
            จากการตรวจวินิจฉัยเชื้ อมาลาเรี ยใน 36 ตัวอย่าง ด้วยการตรวจฟิ ล์มเลือด โดยกล้องจุลทรรศน์
และเทคนิ ค Real-Time PCR พบว่า มีผลแสดงเป็ นเชื้ อมาลาเรี ยชนิ ดฟั ลซิ ปารัมทั้ง 36 ตัวอย่าง ในขณะที่
เทคนิค Real-Time PCR มีผลแสดงเป็ นเชื้ อมาลาเรี ยชนิ ดฟั ลซิ ปารัมและชนิดไวแวกซ์ จานวน 33 (Tm 73-
74 oC) และ 3 (Tm 76-77 oC) ตัวอย่าง ตามลาดับ (ค่า Tm : melting temperature ของ P. malariae,
P. falciparum, P. ovale และ P. vivax เท่ากับ 71.0-72.0, 73-74, 75.0-75.0 และ 76.0-77.0 ตามลาดับ [9])



ตารางที่ 1 ยารักษาหายขาดเชื้อมาลาเรี ยชนิ ดฟัลซิ ปารัมในพื้นที่ด้ือยาเมโฟลควิน [12]
   กลุ่มผู้ป่วย                  วันที่ 1                   วันที่ 2                        ่
                                                                                    รวมยาทีจ่าย
     (อายุ)                  ้
                           มือแรก         มือทีสอง ATS
                                            ้ ่                       P      ATS          M      P
                       ATS         M           M       (เม็ด) (มก.) (เม็ด)              (เม็ด) (มก.)
                      (เม็ด) (เม็ด)          (เม็ด)
  14 ปี ขึ้นไป           6         3           2         6            30      12          5     30
หมายเหตุ ยา ATS และ M สาหรับวันที่ 1 ให้รับประทานต่อหน้าเจ้าหน้าที่ ยาที่เหลือมอบให้ไป
             รับประทานต่อที่บาน้
             ATS คือ ยา Artesunate มีเม็ดละ 50 มก. ขนาด 12 มก./กก.
             M คือ ยา Mefloquine เม็ดละ 250 มก. ขนาด 25 มก./กก.
             P คือ ยา Primaquine เม็ดละ 5 มก. และ 15 มก. ขนาด 0.5 มก./กก.


ตารางที่ 2
ผลเปรี ยบเทียบการตรวจวินิจฉัยเชื้อมาลาเรี ยชนิดฟัลซิปารัมด้วยการตรวจฟิ ล์มเลือดโดยกล้องจุลทรรศน์
และเทคนิค Real-Time PCR
            ฟิ ล์มหนา                              Real-Time PCR                           รวม
                                    F            V               ไม่ พบเชื้อ
F                                   38           3                    0                     41
V                                    0           0                    0                      0
ไม่ พบเชื้อ                          6           2                   131                    139
รวม                                 44           5                   131                    180
                                                                                                       8
หมายเหตุ : วิธีการตรวจฟิ ล์มเลือดด้วยกล้องจุลทรรศน์ มีความไวของการทดสอบ (Sensitivity)
           เท่ากับ 83.67 %

             จ      า            ก         ต           า     ร          า          ง       ที่               2
ผลเปรี ยบเทียบการตรวจวินิจฉัยเชื้ อมาลาเรี ยชนิ ดฟั ลซิ ปารัมด้วยการตรวจฟิ ล์มเลือดโดยกล้องจุลทรรศน์
และเทคนิค Real-Time PCR ใน 165 ตัวอย่าง จากตัวอย่างของอาสาสมัครบริ จาคเลือดจานวน 36 คน
พบว่า การตรวจฟิ ล์มเลือด แสดงผลไม่พบเชื้ อ เท่ากับ 16.33 % โดยมีผลไม่พบเชื้ อชนิ ดฟั ลซิ ปารัม
และไวแวกซ์ เท่ากับ 13.64 % และ 40.0 % ตามลาดับ ของ จานวนผลการตรวจพบเชื้ อทั้งหมดด้วย เทคนิค
                                    ั
Real-Time PCR นอกจากนี้ มีตวอย่างของอาสาสมัครบริ จาคเลือด 6 คน จาก 36 คน ที่ตรวจฟิ ล์มเลือดแล้ว
แสดงผลไม่พบเชื้ อ ในวันที่ 3, 7, 14 และ 28 หลังจากที่ได้รับประทานยามาลาเรี ย ในวันแรก ในขณะที่
การตรวจด้วย เทคนิค Real-Time PCR แสดงผลว่า พบเชื้ อชนิ ดฟั ลซิ ปารัม ในวันที่ 3 และ 28 จานวน 3
และ 1 คน ตามลาดับ และ แสดงผลว่า พบเชื้ อชนิ ดไวแวกซ์ ในวันที่ 7 จานวน 2 คน แสดงให้เห็นว่า
การตรวจวินิจฉัยเชื้ อมาลาเรี ยด้วยการตรวจฟิ ล์มเลื อดโดยกล้องจุลทรรศน์ มีความไวต่ ากว่า เทคนิ ค Real-
Time PCR ซึ่ งผลการศึ ก ษานี้ สอดคล้อ งกับ การศึ ก ษาของ Liliane C. และคณะ ปี ค.ศ. 1999
ได้เปรี ยบเทียบผลการตรวจ วินิจฉัยเชื้ อมาลาเรี ยด้วยการตรวจฟิ ล์มเลื อดโดยกล้องจุลทรรศน์ และเทคนิ ค
PCR                              พบว่ า ใน 132 ตั ว อย่ า ง จากผู ้ ป่ วยติ ด เชื้ อมาลาเรี ย จ านวน 12 คน
ที่ ไ ด้ รั บ การตรวจฟิ ล์ ม เลื อ ดด้ ว ยกล้ อ งจุ ล ทรรศน์   ตั ด สิ นผลว่ า ไม่ พ บเชื้ อ เท่ า กั บ 27.7 %
                                           ั
ของผลการตรวจด้วยเทคนิค PCR ที่ตดสิ นว่า พบเชื้อ [13]

ตารางที่ 3 ผลเปรี ยบเทียบของระดับการดื้อยา และประเภทการตอบสนองการรักษา
จากการตรวจวินิจฉัยเชื้ อมาลาเรี ยด้วยการตรวจฟิ ล์มเลือดโดยกล้องจุลทรรศน์
   ผลลัพธ์           S               RI            RII           RII     ตัดสิ นไม่ ได้              รวม
ACPR                 33              0              0             0            0                      33
LTF                   0              2              0             0            0                       2
ETF                   0              0              0             0            0                       0
ตัดสิ นไม่ ได้        0              0              0             0            1                       1
รวม                  33              2              0             0            1                      36

       จากตารางที่ 3 และ 4 แสดงผลเปรี ยบเทียบของระดับการดื้อยา และประเภทการตอบสนองการรักษา
จากการตรวจวินิจฉัยเชื้ อมาลาเรี ยด้วยการตรวจฟิ ล์มเลือดโดยกล้องจุลทรรศน์ และ เทคนิค Real-Time PCR
โดยจาแนกตามองค์การอนามัยโลก (WHO) [10 และ 12]
       จากการตรวจวินิจฉัยเชื้ อมาลาเรี ยด้วยการตรวจฟิ ล์มเลือดโดยกล้องจุลทรรศน์              พบว่า
จากตัวอย่างอาสาสมัครบริ จาคเลือด                  36       คน       มีระดับการดื้อยา            RI
                                                                                                            9
ได้จาแนกประเภทการตอบสนองการรักษาเป็ น              LTF     จานวน       2      ตัวอย่าง   ในขณะที่
การตรวจวินิจฉัยเชื้ อมาลาเรี ยด้วยเทคนิค Real-Time PCR มีระดับการดื้อยา RI และ RII จานวน 4 และ 2
ตัวอย่าง ได้จาแนกประเภทการตอบสนองการรักษาเป็ น LTF                   แสดงให้เห็นว่า ระดับการดื้อยา
จากการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ มีการเปลี่ยนระดับ เมื่อตรวจด้วยเทคนิค Real-time PCR

ตารางที่ 4 ผลเปรี ยบเทียบของระดับการดื้อยา และประเภทการตอบสนองการรักษา
จากการตรวจวินิจฉัยเชื้ อมาลาเรี ยด้วย เทคนิค Real-Time PCR
   ผลลัพธ์           S               RI            RII     RII      ตัดสิ นไม่ ได้                                     รวม
ACPR                 26               0             0       0             0                                             26
LTF                   0               4             2       0             0                                              6
ETF                   0               0             0       0             0                                              0
ตัดสิ นไม่ ได้        0               0             0       0             4                                              4
รวม                  26               4             2       0             4                                             36
สรุ ปและวิจารณ์ ผลการศึกษา
                        ง า น วิ จั ย ค รั้ ง นี้ เ พื่ อ ป ร ะ เ มิ น ป ร ะ สิ ท ธิ ภ า พ ก า ร รั ก ษ า ข อ ง ย า ม า ล า เ รี ย
โดยเปรี ย บเที ย บการตรวจวิ นิ จฉัย เชื้ อ มาลาเรี ย ด้ว ย วิ ธี Real-Time PCR และการตรวจฟิ ล์ม เลื อ ด
โดยกล้องจุลทรรศน์ โดยติดตามผูป่วยหลังรับการรักษา ซึ่ งถ้ารักษาไม่ได้ผล อาจคาดการณ์วา เชื้ อดื้อต่อยา
                                              ้                                                                    ่
ทั้งนี้ องค์การอนามัยโลก (WHO) ได้จาแนกระดับการดื้อยา ดังนี้ คือ 1. S/ACPR 2. RI/LTF 3. RII/ETF
หรื อ LTF                  และ 4. RIII/ETF                 อิ ง กั บ ปริ มาณเชื้ อที่ ต รวจได้ จ ากกล้ อ งจุ ล ทรรศน์ [14]
ซึ่ งวิ ธี ดั ง กล่ า วขึ้ นกั บ ผู ้ต รวจในแต่ ล ะคน หรื อในแต่ ล ะวัน แต่ ถ้ า ใช้ เทคนิ ค Real-time                      PCR
อาจช่ ว ยตัด ปั ญ หาการแปรปรวนเหล่ า นี้ ได้                          ประกอบกับ วิ ธี น้ ี มี ค วามไวและความจ าเพาะสู ง กว่ า
ดั ง นั้ น ใ น ก า ร จ า แ น ก ร ะ ดั บ ก า ร ดื้ อ ย า อ า จ เ ป็ น ไ ป ไ ด้ ใ น ก ร ณี ร ะ ดั บ ก า ร ดื้ อ ย า RI
จากการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ อาจเปลี่ยนเป็ น ระดับการดื้อยา RII เมื่อตรวจด้วยเทคนิค Real-time PCR
                                  ั
               ผลการศึกษาวิจยครั้งนี้ พบว่า ใน 180 ตัวอย่าง จากตัวอย่างของอาสาสมัครบริ จาคเลือดจานวน 36
คน ที่ได้รับการตรวจฟิ ล์มเลือดด้วยกล้องจุลทรรศน์                            ตัดสิ นผลว่า ไม่พบเชื้อ เท่ากับ 16.33 %
                                                                   ั
ของผลการตรวจด้วยเทคนิค Real-Time PCR ที่ตดสิ นว่า พบเชื้อ แสดงให้เห็นว่า เทคนิค Real-Time PCR
เป็ นวิธีตรวจวินิจฉัยเชื้ อมาลาเรี ยที่มีความไว                                                        และความจาเพาะสู งกว่า
การตรวจฟิ ล์มเลือดด้วยกล้องจุลทรรศน์ นอกจากนี้ การตรวจด้วยเทคนิค Real-Time PCR พบว่ามี
จานวนตัวอย่างที่รักษาไม่ได้ผล เท่ากับ 16.67 % ในขณะที่ การตรวจฟิ ล์มเลือดด้วยกล้องจุลทรรศน์ เท่ากับ
5.56             %                       (จากตารางที่                3      และ               4)             ซึ่ งจากผลดังกล่าว
ได้ถูกยืนยันจากการที่ตรวจพบการรักษาไม่ได้ผลอย่างรวดเร็ วของเทคนิค Real-time PCR ดังนั้น เทคนิค
Real-Time                        PCR                     สามารถนาไปใช้ประโยชน์ในการติดตามการรักษาของยามาลาเรี ย
เพื่อเป็ นการตรวจสอบระดับการดื้อยาของเชื้ อมาลาเรี ย                                 ก่อนที่ระดับดื้อยาจะถึงในระดับสู งต่อไป
                                                                                                                               10
              ั
นอกจากนี้ยงสามารถใช้ในการตรวจวินิจฉัยเชื้ อมาลาเรี ย                  เพื่อเสริ มวิธีการตรวจวินิจฉัยอื่นๆ
ในพื้นที่ที่มีการแพร่ เชื้อมาลาเรี ยในระดับต่าและปานกลาง
และขาดแคลนบุคลากรที่เชี่ยวชาญในการตรวจวินิจฉัยเชื้ อมาลาเรี ยด้วยฟิ ล์มเลือด            [5]             ่
                                                                                                    แม้วา
                                              ั
วิธีการตรวจฟิ ล์มเลือดด้วยกล้องจุลทรรศน์ยงคงได้รับการยอมรับให้เป็ นวิธีมาตรฐาน (Gold standard) [13]
ในปัจจุบน ั

 ข้ อเสนอแนะ
            1                                                                                                                        .
                                            ้
ควรมีมาตรการในการติดตามผูป่วยที่ติดเชื้ อมาลาเรี ยที่ยินยอมเป็ นอาสาสมัครบริ จาคเลือดในโครงการวิจยใ                               ั
                                          ั
ห้มาเจาะเก็บเลือดตามเวลาที่นดหมาย อย่างเหมาะสม
                                    ้
            2. ควรคัดเลื อ กผูป่ วยที่ ติ ด เชื้ อ มาลาเรี ย ที่ ยิ นยอมเป็ นอาสาสมัค รบริ จ าคเลื อ ดในโครงการวิ จ ัย
ที่มีพ้ืนที่ที่สามารถติดตามได้สะดวก เพื่อลดปั ญหาการสู ญเสี ยตัวอย่าง เวลา และค่าใช้จ่าย
            3 . ค ว ร มี ก า ร ข ย า ย ก า ร ศึ ก ษ า อ ย่ า ง ต่ อ เ นื่ อ ง
ห รื อ เ พิ่ ม พื้ น ที่ ศึ ก ษ า เ พื่ อ เ ป รี ย บ เ ที ย บ ป ร ะ เ ภ ท ก า ร ต อ บ ส น อ ง ก า ร รั ก ษ า ข อ ง ย า ม า ล า เ รี ย
ในแต่ละพื้นที่หรื อแต่ละปี




เอกสารอ้างอิงของโครงการวิจัย
         1. Labbe AC., Patel S., Crandall I. and Kain KC. 2003. Molecular Surveillance System for Global
Patterns of Drug Resistance in Imported Malaria. Emerging Infectious Disease. Vol.9, No.1,
p. 33-36
         2. Rabbo A.A., Bassilia A., and Atta H. 2005. The Quality of Antimalarials Available in Yemen.
Malaria Journal. 4:28, 7 pages (http://www.malariajournal.com/content/14/1/28)
         3. Lopes D., Rungsihirunrat K., Nogueria F., Seugorn A., Gil J.P., Rosario V.E. and Cravop. 2002.
Molecular Characterisation of Drug Resistant Plasmodium falciparum from Thailand. Malaria Journal.
4:28, 7 pages (http://www.malariajournal.com/content/1/1/12)
         4. Tjitra E., Baker J., Suprianto S., Cheng Q. amd Chloroquine-Sulfadoxine-Pyrimethamine in
Vivax Malaria Pilot Studies : Relationship to Plasmodium vivax dhfr Mutations. Antimicrobial Agent and
Chemotherapy. Vol.46, No.12, p.3947-3953
         5. Sattabongkot J., Tsuboi T., Zollner G.E., Sirichaisinthop J. and Cui L. 2004. Plasmodium vivax
transmission : chances for control ?, Trend in Parasitology, Vol.20, No.4, pp.192-198


                                                                                                                                  11
         6. Perandin F., Manca N., Calderaro A., Piccolo G., Galati L., Ricci L., Medici M.C., Arcangeleti
M.C., Snounou G., Dettori G. and Chezzi C. 2004. Development of a Real-Time PCR Assay for Detecion
of Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale for Routine Clinical Diagnosis. Journal
of Clinical Microbiology,Vol.42,No.3,p.1214-1219
         7. Maria H. C., Maristela G., Richardo L.D., Orlando C, Mauricio M. and Irene S. 2003.
Serological detection of Plasmodium vivax malaria using recombinant proteins corresponding to the
19-kDa C-terminal region of the merozoite surface protein-1. Malaria Journal, Vol. 2, No. 39, 7 p.
         8. จันทรา เหล่าถาวร และ ศรชัย หลูอารี ยสุวรรณ, 2540, มาลาเรี ย, พิมพ์ครั้งที่1, ศักดิ์โสภาการพิมพ์,
                                                 ์
กรุ งเทพฯ, 155 หน้า
         9. Anintita L., Fumihiko K., Nichapat T., Somei K., R. Scott M., Kevin C. and Chunsuda W.
2001. PCR-based ELISA Technique for Malaria Diagnosis of Specimens from Thailand. Vol. 6, No. 6,p.
458-462
         10. Ciceron L., Jaureguiberry G., Gay F. and Danis M. 1999. Development of a Plasmodium PCR
for Monitoring Efficacy of Antimalarials Treatment. Journal of Clinical Microbiology. Vol.37, No.1, p.35-
38
         11. Erah P.O. , Arienmughare G. and Okhamate A.O. 2003. Plasmodium falciparum malaria
resistance to Chloroquine in Five Communities in Southern Nigeria. African Journal of Biotechnology.
Vol.2 (10), p.384-389
         12. Broek I., Amsalu R., Balasegaram M., Hepple P., Alemu E., Hussein E.B., Alfaith M.,
Montgomery J. and Checchi. 2005. Efficacy of Two Artemisinin Combination Therapies for
Uncomplicated Falciparum Malaria in Children under 5 Years, Upper Nile, Sudan. Malaria Journal. 4:14,
7 pages. (http://www.malariajournal.com/content/4/1/14)
         13. Farcas G.A., Zhong K.J.Y., Mazzulli T. and Kain K.C. 2004. Journal of Clinical
Microbiology. Evaluation of the Realart Malaria LC Real-Time PCR Assay for Malaria Diagnosis. Vol.42,
No.2, p.636-638
         14. Mangold K.A., Manson R.U., Koay E.S.C., Stephens L., Regner MA., Thomson R.P.,
Peterson L.R. and Kaul K.L. 2005 Real-Time PCR for Detection and Identification of Plasmodium spp.
Journal of Clinical Microbiology. Vol.43, No.5, p.2435-2440
         15. Lee M.A., Tam C.H., Aw L.T., Tang C.S., Singh M., Lee S.H., Chia H.P. and Yap E.p.h.
2002. Real-Time Fluorescence-Based PCR for Detection of Malaria Parasites. Journal of Clinicla
Micorbiology. Vol.40, No.11, p.4343-4345



                                                                                                         12
       16. Kanungnit C., Jose. Pedro G., Pongwit B., Yaowares K., Ampai D. And Walther H W. 2008.
Mix-species malaria infection in high transmission areas of Thailand. Asian Biomedicine, Vol. 2, No. 2, 5
p.
       17. จันทรา เหล่าถาวร และคุณหญิงตระหนักจิต หะริ ณสุ ต. 2534. การดื้อยาของเชื้อมาลาเรี ย. บริ ษท   ั
รวมทรรศน์ จากัด. กรุ งเทพฯ. 184 หน้า
       18. http://www.who.int/emc




                                                                                                      13

								
To top