SLOVENSK� POLNOHOSPOD�RSKA UNIERZITA VN ITRE

Document Sample
SLOVENSK� POLNOHOSPOD�RSKA UNIERZITA VN ITRE Powered By Docstoc
					SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIERZITA V NITRE
FAKULTA AGROBIOLÓGIE A POTRAVINOVÝCH ZDROJOV
                       Katedra výživy ľudí




Využitie enzýmovej imunoanalýzy na detekciu falšovania
                    mlieka a syrov

                    Autoreferát dizertačnej práce
   na získanie vedecko – akademickej hodnosti philosophiae doctor
                    vo vednom odbore 41 – 04 – 9
                       Všeobecná zootechnika




                                         Ing. Lucia Zeleňáková


                            Nitra 2006
      Dizertačná práca bola vypracovaná v externej forme doktorandského



                                 1
štúdia na Katedre výživy ľudí Fakulty agrobiológie a potravinových zdrojov
Slovenskej poľnohospodárskej univerzity v Nitre.

Doktorand: Ing. Lucia Zeleňáková
              Katedra výživy ľudí
              Fakulta agrobiológie a potravinových zdrojov
              Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre
Vedúci dizertačnej práce: doc. MUDr. Jaroslav Daniška, CSc
                             Katedra výživy ľudí, FAPZ, SPU v Nitre
Školiteľ špecialista: doc. Ing. Jozef Golian, Dr.
                      Katedra hygieny a bezpečnosti potravín, FBP, SPU v
                      Nitre
Oponenti: 1. prof. MVDr. Jozef Sokol, DrSc.
              Krajská veterinárna a potravinová správa Trnava
           2. doc. MVDr. Eva Dudríková, CSc.
              Katedra hygieny a technológie potravín,
              Univerzita veterinárneho lekárstva Košice
           3. Ing. Karol Herian, CSc.
              Emeritný pracovník Výskumného ústavu mliekarenského a .s.
              Žilina

          Autoreferát bol rozoslaný dňa ..................
          Stanovisko k dizertácii vypracovala Katedra hygieny a bezpečnosti
potravín,     Fakulta      biotechnológie         a potravinárstva,     Slovenská
poľnohospodárska univerzita v Nitre.
          Obhajoba dizertačnej práce sa koná dňa .............. o .......... h pred
komisiou pre obhajobu dizertačných prác vedného odboru 41–04–9 Všeobecná
zootechnika na Fakulte agrobiológie a potravinových zdrojov SPU v Nitre.

Miesto konania: ..........................................................................
         Fakulta agrobiológie a potravinových zdrojov
         Slovenská poľnohospodárska univerzita
                   Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Nitra
         S dizertačnou prácou sa možno oboznámiť na dekanáte Fakulty
agrobiológie a potravinových zdrojov SPU v Nitre
         Predseda komisie pre obhajoby vo vednom odbore 41–04–9

                                   prof. Ing. Daniel Bíro, CSc
                          Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre
ABSTRAKT
     Zameranie dizertačnej práce vychádza z potreby efektívnej



                                            2
kontroly mlieka a syrov na detekciu falšovania priamo v mliekarenskej
praxi.
         V zmysle stanovených cieľov sme v laboratórnych podmienkach
skúmali a hodnotili kvalitu detekcie falšovania mlieka pomocou štyroch
druhov ELISA testov od dvoch výrobcov a použité testy sme zároveň
aplikovali v praxi. Uskutočnili sme:
 detekciu laboratórne pripraveného vzájomného falšovania kravského,
     kozieho a ovčieho mlieka pomocou ELISA testov
         Laboratórnym skúšaním presnosti ELISA testov sme zistili, že
všetky testy splnili kvalitatívne kritériá. Hodnoty variačných koeficientov
absorbancií sledovaných falšovaných koncentrácií boli vo všetkých
prípadoch pod limitujúcou hodnotou 10 % a na kvalitatívny parameter
presnosť nevplývali nami sledované faktory.
         Laboratórnym skúšaním špecifickosti a citlivosti ELISA testov
sme zistili, že citlivosť, a teda aj kvalitu detekcie vzájomného falšovania
kravského, kozieho a ovčieho mlieka ovplyvňuje vytvorenie štandardnej
krivky so špecifickým detekčným rozpätím. U všetkých testov sme
zaznamenali veľmi dobrú až výbornú schopnosť detekovať väčšinu
sledovaných falšovaných prídavkov. Zároveň môžeme konštatovať, že z
hľadiska hodnotenia špecifickosti a citlivosti nemožno spomedzi
hodnotených ELISA testov vybrať jeden a označiť ho ako najlepší.
         Skúmaním vplyvu tepelného ošetrenia mlieka na detekciu
falšovania sme zistili, že vzorky, ktoré boli v rôznych kombináciách
tepelne ošetrené (pasterizované pri teplote 71,7 – 77 ºC po dobu 20
sekúnd), vykazovali nižšie optické denzitné reakcie v porovnaní s tými,
ktoré tepelnému ošetreniu neboli vôbec vystavené.
 detekciu falšovania mlieka a syrov vo vybraných oblastiach Slovenska
     pomocou ELISA testov a hodnotenie výsledkov podľa požiadaviek
     platných právnych noriem
         Analýza náhodne odobratých vzoriek od rôznych výrobcov
a spracovateľov ovčieho a kozieho mlieka a syrov potvrdila nevyhnutnosť
ich pravidelnej kontroly na stanovenie falšovania jednak orgánmi
potravinového dozoru, či samotnými mliekárňami. Dosiahnuté výsledky
potvrdzujú, že vhodný výber ELISA testov sa môže stať významným
objektivizujúcim činiteľom pri hľadaní možností a spôsobov detekcie
falšovania mlieka.

ABSTRACT



                                    3
         The subject matter of the dissertation thesis derives from the need
of an effective inspection of milk and cheese focusing adulteration
detection as performed directly in the industrial practice. In line with set up
objectives we have studied and evaluated the quality of adulteration
detection of milk in laboratory conditions using four different ELISA tests
of two different producers and at the same time we have directly applied
the selected tests in industrial practice. We have carried out:
    Detection of lab-prepared mutual adulteration of cow´s, goat´s and
     sheep´s milk using ELISA tests
         Through laboratory testing of accuracy of the ELISA tests we
have arrived to a conclusion that all the tests met the quality criteria. Values
of variation coefficients of absorbances of the studied adulterated
concentrations in all the cases did not reach the limit value of 10 % and the
quality parameter of accuracy was not impacted by the studied factors.
         Through laboratory testing of specificity and sensitivity of the
ELISA tests we have found out that the sensitivity, and thus also the quality
of detection of the mutual adulteration of the cow´s, goat´s and sheep´s
milk is being impacted by a standard curve with a specific detection range.
In case of all the tests we have identified a very good capacity of detecting
the majority of the studied adulterants. Concurrently, we can state that from
the point of view of the specificity and sensitivity assessment it is not
possible to select any of the evaluated ELISA tests and designate it as the
best one.
         Upon having studied the impact of milk heat treatment on the
adulteration detection we found out that samples that had been heat treated
in different combinations (pasteurization in the temperature range 71,7 –
77 ºC for 20 sec.) showed lower optical density reactions as compared with
those not subjected to the heat treatment at all.
 Detection of milk and cheese adulteration in selected areas of Slovakia
     by means of the ELISA tests and assessment of results by compliance
     with requirements set out in applicable regulations
         The analysis of randomly sampled products of different producers
of sheep´s and goat´s milk and cheese confirmed the need of their regular
inspection for detection of adulteration by food control authorities as well
as by the dairies themselves. The achieved results confirm that a suitable
selection of ELISA tests can become a significant factor in objective
definition of the methods of milk adulteration detection.




                                       4
OBSAH
1 Úvod ........................................................................... ...........................5
2 Ciele práce ..............................................................................................6
3 Metodika práce ......................................................................................7
  3.1 Použité ELISA testy ........................................................................7
  3.2 Detekcia falšovania ovčieho mlieka a syrov vo vybraných
      regiónoch Slovenska pomocou ELISA testov .................................7
  3.3 Detekcia laboratórne pripraveného vzájomného falšovania
      kravského, kozieho a ovčieho mlieka pomocou ELISA testov .......7
  3.4 Detekcia falšovania ovčieho mlieka a kozieho mlieka vo
      vybraných regiónoch Slovenska pomocou ELISA testov ...............8
  3.5 Použité metódy vyhodnotenia a interpretácie výsledkov ................9
4 Výsledky práce .......................................................................................9
  4.1 Aplikácia ELISA testov na detekciu falšovania ovčieho mlieka
      a syrov vo vybraných regiónoch Slovenska.....................................9
  4.2 Aplikácia ELISA testov na detekciu laboratórne pripraveného
      vzájomného falšovania kravského, kozieho a ovčieho mlieka.........9
  4.3 Aplikácia ELISA testov na detekciu falšovania ovčieho mlieka
       a kozieho mlieka vo vybraných regiónoch Slovenska..................15
5 Záver práce a návrhy na využitie výsledkov........................................ 15
6 Použitá literatúra ...................................................................................19
7 Zoznam publikovaných prác autora ......................................................20

1 ÚVOD
         Mlieko a mliečne výrobky zaujímajú v správnej výžive ústredné
postavenie vďaka typickým senzorickým vlastnostiam, originálnemu
a vyváženému zloženiu, či širokému spektru esenciálnych zložiek, ktoré sú
nevyhnutné z hľadiska správnej a preventívnej výživy. Vďaka nutričným
predispozíciám sa okrem kravského mlieka dostáva do popredia
v ostatných rokoch aj konzumácia mlieka kozieho a ovčieho. Zvyšujúca sa
akceptácia týchto nebovinných mliek a produktov z nich u spotrebiteľov,
často vedie výrobcov k zvyšovaniu ich kvantity na úkor kvality.
         Sezónne poklesy v produkcii nebovinných mliek, ako aj ich
vyššia cenová úroveň na rozdiel od kravského mlieka, často vedú
prvovýrobcov, ako aj ďalších spracovateľov k nežiadúcemu falšovaniu.
Vzájomné falšovanie ovčieho, kozieho a kravského mlieka sa môže stať
vážnym problémom vo výrobe, pretože spôsobuje technologické problémy
pri spracovaní, jeho následkom sú aj hygienické a výživové nedostatky,
ako i ekonomické straty.


                                                      5
         Preto je pravidelná kontrola mlieka a mliečnych výrobkov
štátnymi kontrolnými orgánmi, ako aj samotnými mliekarňami priam
nutná. Nové kontrolné limity, smernice spolu s novými kvalitatívnymi
stratégiami a spotrebiteľskými požiadavkami na bezpečné a nefalšované
potraviny si vyžadujú senzitívnejšie analytické metódy, ako aj zvýšenie ich
počtu. Doteraz používané a na fyzikálno-chemickom princípe založené
metódy, ako sú chromatografické a elektroforetické postupy, sú veľmi
časovo, prístrojovo a personálne náročné. Pre metódy založené na
imunologickom princípe, medzi ktoré patria imunoelektroforéza
a imunodifúzia, platia v princípe z hľadiska rutinnej aplikácie tie isté
podmienky. Preto boli v posledných rokoch vyvinuté najviac
imunoenzymatické metódy (EIA, ELISA). Tie predstavujú vzhľadom na
časovú potrebu, prípravu analýzy a jej priebeh rozhodujúci pokrok.
V princípe sú tiež vysoko špecifické, citlivé, spoľahlivé, automatizované
a cenovo prístupné. Najdiskutovanejšou požiadavkou, ktorá v súčasnosti
rezonuje u výrobcov, ako aj spracovateľov mlieka je, aby sa testovacie
súpravy dostali priamo do mliekarní a umožnili tak rýchlu, jednoduchú
a efektívnu kontrolu mlieka na jeho prípadné falšovanie už pri dodávke.

2 CIELE PRÁCE
         Zameranie dizertačnej práce vychádza z potreby efektívnej
kontroly mlieka a syrov na detekciu falšovania priamo v praxi (výrobcovia
a spracovatelia mlieka, orgány štátneho potravinového dozoru/úradnej
kontroly potravín). Z tohto dôvodu sme si stanovili nasledovné ciele:
1.  Skúmanie a hodnotenie kvality detekcie vzájomného falšovania
    kravského, kozieho a ovčieho mlieka pomocou imunoenzymatických
    metód (ELISA testov) v laboratórnych podmienkach.
Zamerali sme sa na laboratórne skúšanie, hodnotenie a porovnávanie
kvalitatívnych parametrov štyroch druhov ELISA testov od dvoch
výrobcov.
2.  Aplikácia ELISA testov v praxi s konkrétnymi odporúčaniami pre
    výrobcov a spracovateľov mlieka, orgány štátneho potravinového
    dozoru.
Zamerali sme sa na detekciu prípadov falšovania mlieka a syrov vo
vybraných oblastiach Slovenska a hodnotenie výsledkov podľa
požiadaviek platných právnych noriem.




                                    6
3 METODIKA PRÁCE
         Dizertačná práca bola súčasťou riešenia štátneho projektu
(Transferová úloha č.7) “Detekcia falšovania mlieka a syrov” riešeného
v Štátnom veterinárnom a potravinovom ústave v Nitre – Národnom
referenčnom laboratóriu pre mlieko a mliečne výrobky v rokoch 2001 –
2004.
3.1 Použité ELISA testy
RIDASCREEN CIS: Enzýmová imunoanalýza na detekciu kravského
mlieka v ovčom a kozom mlieku a v ovčom a kozom syre.
RIDASCREEN GIS: Enzýmová imunoanalýza na detekciu kozieho mlieka
v ovčom mlieku.
RC test – bovine (kravské): Enzýmová imunoanalýza na detekciu
kravského mlieka v ovčom a kozom mlieku a v ovčom a kozom syre.
          – caprine (kozie): Enzýmová imunoanalýza na detekciu kozieho
mlieka v ovčom a kravskom mlieku a ovčom a kravskom syre.

3.2 Detekcia falšovania ovčieho mlieka a syrov vo vybraných
    regiónoch Slovenska pomocou ELISA testov
         V rokoch 2001 – 2002 sme uskutočnili laboratórne analýzy
zamerané na sledovanie aktuálnej situácie vo falšovaní ovčieho mlieka
a syrov na Slovensku. Vzorky ovčieho mlieka a syrov sme počas
uvedeného obdobia odoberali od výrobcov a spracovateľov mlieka
z rôznych oblastí Slovenska (Bryndziareň Turčianske Teplice, Agrofarma
Červený Kameň, výrobcovia a spracovatelia mlieka v Košickom kraji).

3.3 Detekcia laboratórne pripraveného vzájomného falšovania
     kravského, kozieho a ovčieho mlieka pomocou ELISA testov
         Našou úlohou bolo zmiešavať kravské, kozie a ovčie mlieko
v stanovených pomeroch (0; 0,5; 1; 3; 10 a 15 % falšované množstvo
v skúmanej vzorke mlieka), pričom sme vzorky podrobili v rôznych
kombináciách tepelnému ošetreniu (71,7 – 77 ºC po dobu 20 sekúnd).
Druhy detekcie: kravské mlieko v kozom mlieku
                 kravské mlieko v ovčom mlieku
                 kozie mlieko v ovčom mlieku
Laboratórny postup prípravy vzoriek na detekciu falšovania
         Laboratórny postup je principiálne rovnaký pre všetky druhy
detekcie a spočíva:
     1. vo východiskovej úprave vzoriek pred analýzou ELISA testami,
     2. v špecifickej príprave vzoriek na analýzu ELISA testami.


                                  7
Sledované ukazovatele a metodika ich stanovenia
     1. Laboratórne skúšanie presnosti ELISA testov
     2. Laboratórne skúšanie citlivosti a špecifickosti ELISA testov
1. Laboratórne skúšanie presnosti ELISA testov: Presnosť determinuje tzv.
opakovateľnosť merania absorbančnej hodnoty sledovaného podielu
mlieka iného druhu v skúmanej zmesi mlieka na tej istej vzorke pomocou
rovnakej testovacej súpravy. Uvedené merania sme pri rôznych spôsoboch
a rôznych pomeroch vzájomného zmiešavania opakovali trikrát.
Z nameraných hodnôt sme vypočítali aritmetický priemer ( X ),
smerodajnú odchýlku (s) a variačný koeficient (Vk). Za uvedených
podmienok musí byť variačný koeficient vždy menší ako 10 %. Napriek
tomu, že uvedené hodnotiace princípy odporúča len výrobca testov RC vo
svojej validačnej správe, z hľadiska objektívneho hodnotenia
a vzájomného porovnania kvality testov sme uvedenej analýze podrobili
všetky použité ELISA testy.
2. Laboratórne skúšanie citlivosti a špecifickosti ELISA testov: Cieľom
analýzy bolo zistiť, či použité testy skutočne zachytia sledované falšované
podiely. V zmysle odporúčaní výrobcov sme merania absorbancií
sledovaných falšovaných podielov pri rôznych spôsoboch a rôznych
pomeroch vzájomného zmiešavania opakovali dvakrát. Pri hodnotení
výsledkov sme aplikovali požiadavky výrobcov všetkých použitých testov,
no z hľadiska objektívneho hodnotenia a porovnania kvality testov sme
použili aj rovnaké hodnotiace princípy.

3.4 Detekcia falšovania ovčieho a kozieho mlieka vo vybraných
    regiónoch Slovenska pomocou ELISA testov
        V roku 2004 sme v NRLM uskutočnili analýzy zamerané na
monitoring prípadov falšovania ovčieho a kozieho mlieka. Vzorky kozieho
a ovčieho mlieka sme odobrali zo spracovateľského podniku Bryndziareň
Turčianske Teplice. Na detekciu falšovania sme použili testy
RIDASCREEN CIS.

Sledované ukazovatele:
1. dôkaz zohriatia mlieka pred stanovením falšovania,
2. kvalitatívne a kvantitatívne stanovenie prídavku mlieka iného druhu
    vo vzorke,
3. porovnanie kvality (resp. citlivosti) ELISA testov meraním
    absorbancií falšovaných množstiev v skúmanej zmesi mlieka na tej
    istej vzorke pomocou dvoch testovacích súprav.



                                    8
3.5 Použité metódy vyhodnotenia a interpretácie výsledkov
         Absorbančné hodnoty sme merali pomocou mikroplatňového
  spektrofotometra pri vlnovej dĺžke 450 nm. Štatistickými metódami
  v programe Microsoft Office Excel a v programe Statgraphics Plus sme
  namerané hodnoty analyzovali, spracovali a vyjadrili tabuľkovou
  a grafickou formou.

4 VÝSLEDKY PRÁCE
4.1 Aplikácia ELISA testov na detekciu falšovania ovčieho mlieka
     a syrov vo vybraných regiónoch Slovenska
1. V prvej fáze monitoringu, ktorý prebiehal v roku 2001, sme na analýzu
66 vzoriek ovčieho mlieka a syrov použili ELISA test RIDASCREEN 
CIS. Zamerali sme sa na stanovenie ich falšovania kravským mliekom. Pri
vyšetrení ovčieho mlieka sme zistili, že k falšovaniu došlo len v 1 prípade,
kde bolo pridané viac ako 1 % kravského mlieka. U ovčích syrov bolo
z celkového počtu 35 vzoriek s obsahom viac ako 1 % kravského mlieka 5
vzoriek. Všetky vzorky s obsahom vyšším ako 1 % kravského mlieka
pochádzali od toho istého výrobcu.
2. V druhej fáze prebiehajúcej v roku 2002 sme na detekciu falšovania 25
vzoriek ovčieho mlieka a 52 vzoriek ovčích syrov použili ELISA testy RC
– kravské a RC – kozie. Zistili sme, že až 45 vzoriek ovčích syrov
obsahovalo viac ako 0,1 % prídavku kozieho mlieka. Z výsledkov zároveň
vyplýva, že k falšovaniu ovčích syrov kravským mliekom dochádza len
v ojedinelých prípadoch.
4.2 Aplikácia ELISA testov na detekciu laboratórne pripraveného
    vzájomného falšovania kravského, kozieho a ovčieho mlieka
1. Laboratórne skúšanie presnosti ELISA testov
 Matematicko-štatistickou analýzou sme zistili, že všetky hodnoty
    variačných koeficientov absorbancií sledovaných falšovaných
    koncentrácií boli pod limitujúcou hodnotou 10 %, ktorú stanovuje vo
    validačnej správe výrobca testu RC.
 Môžeme konštatovať, že kvalita ELISA testov vyhovovala z hľadiska
    opakovateľnosti výsledkov troch meraní absorbancií stanoveným
    kritériám a na kvalitatívny parameter presnosť nevplývali nami
    sledované faktory (rôzne falšované podiely a rôzne spôsoby
    vzájomného zmiešavania vrátane tepelného ošetrenia).




                                     9
2. Laboratórne skúšanie citlivosti a špecifickosti ELISA testov
       Na základe dosiahnutých výsledkov možno konštatovať, že
porovnávané ELISA testy sú napriek rozdielnym princípom vyhodnotenia
analýz vysoko špecifické a citlivé.
 ELISA testy RC – kravské, RC – kozie a RIDASCREEN GIS sú
    kvalitatívne a kvantitatívne testy, ktoré na vyhodnotenie analýzy
    využívajú kalibračnú (štandardnú) krivku vytvorenú z viacerých
    štandardov. Krivka je dostatočne ostrá presnú determináciu
    jednotlivých falšovaných podielov. Tie možno určiť interpoláciou ich
    absorbancie (pri 450 nm) na kalibračnej krivke.
 ELISA test RIDASCREEN CIS je kvalitatívny a semikvantitatívny
    test, ktoré síce determinuje prítomnosť jednotlivých podielov
    kravského mlieka v mliečnej zmesi v určitom detekčnom rozpätí,
    z hľadiska citlivosti detekcie však nemožno presne určiť konkrétne
    falšované koncentrácie. Na presnú kvantifikáciu chýba vytvorenie
    štandardnej krivky, resp. štandardná krivka vytvorená zo šiestich
    hodnôt štandardov nie je dostatočne ostrá na kvalitnejšiu determináciu
    falšovaných podielov.

        Pri hodnotení výsledkov sme aplikovali požiadavky výrobcov
všetkých použitých testov, no z hľadiska objektívneho hodnotenia
a porovnania kvality testov sme použili aj rovnaké hodnotiace princípy.
 Výberom jednotlivých regresných modelov (lineárne a polynomické)
    sme pre jednotlivé detekčné rozpätia štandardných kriviek získali
    rôzne alternatívy riešenia.
 Porovnaním vypočítaných hodnôt absorbancií, resp. koncentrácií
    pomocou regresných rovníc sme zistili, že citlivosť, a teda aj kvalitu
    detekcie vzájomného falšovania kravského, kozieho a ovčieho mlieka
    ovplyvňuje vytvorenie štandardnej krivky so špecifickým detekčným
    rozpätím (okrem testu RIDASCREEN  CIS, ktorý sa nevyhodnocuje
    pomocou štandardnej krivky).

        Z výsledkov hodnotenia kvality detekcie vzájomného falšovania
kravského, kozieho a ovčieho mlieka v surovom stave vyplývajú
nasledovné závery:
 Podľa výrobcov použitých ELISA testov vzorky vykazujúce tú istú
    alebo slabšiu absorbanciu ako 0 %, resp. 0,1 % štandard neobsahujú
    kravské, resp. kozie mlieko. Uvedenú skutočnosť sme zaznamenali aj
    v našom výskume, kde absorbancia všetkých sledovaných vzoriek


                                   10
    neobsahujúcich falšovaný podiel mlieka bola nižšia oproti tej
    štandardnej.
   U väčšiny hodnotených ELISA testov sme zistili nízku detekčnú
    schopnosť pri stanovení 0,5 % podielov surového kravského, resp.
    kozieho mlieka vo vzorkách surového ovčieho, resp. kozieho mlieka.
    Uvedenú koncentráciu najlepšie zachytili testy RC – kozie (0,48 %) a
    RIDASCREEN GIS (0,49 %) a najhoršie testy RC – kravské
    (kravské mlieko v kozom mlieku – 0,05 %, kravské mlieko v ovčom
    mlieku – 0,04 %).
   Najlepšiu schopnosť detekovať 1 % prídavku mlieka iného druhu v
    skúmanej vzorke preukázali testy RIDASCREEN  CIS (kravské
    mlieko v kozom mlieku – 0,99 %, kravské mlieko v ovčom mlieku –
    0,94 %), RIDASCREEN GIS (0,93 %) a RC – kravské (kravské
    mlieko v ovčom mlieku – 0,92 %).
    Najhoršiu detekčnú schopnosť sme zaznamenali pri stanovení
    kravského mlieka v kozom mlieku pomocou testu RC – kravské (0,77
    %) a pri stanovení kozieho mlieka v ovčom mlieku pomocou testu RC
    – kozie (0,71 %).
   Zreteľné rozdiely v kvalite detekcie vzájomného falšovania
    kravského, kozieho a ovčieho mlieka použitím ELISA testov sme
    zistili pri falšovanom množstve 3 %. Vypočítané koncentrácie
    zodpovedajúce uvedenému falšovanému množstvu sa pohybovali
    v rozmedzí od 2,49 % (RC – kravské: kravské mlieko v ovčom
    mlieku) do 3,08 % (RC – kozie).
   U väčšiny hodnotených ELISA testov sme zistili výbornú detekčnú
    schopnosť pri stanovení 10 % a 15 % prídavkov mlieka iného druhu
    v skúmanej vzorke mlieka. Výnimku tvorili testy RIDASCREEN 
    CIS, pomocou ktorých koncentráciu 15 % nebolo možné presne
    detekovať.
   Možno konštatovať, že ani jeden ELISA test nezachytil všetky
    sledované falšované koncentrácie na 100 %. Napriek tomu sme
    u všetkých testov zaznamenali veľmi dobrú až výbornú schopnosť
    detekovať väčšinu sledovaných falšovaných prídavkov. Možno teda
    konštatovať, že v princípe všetky testy splnili kvalitatívne kritériá, no
    z hľadiska hodnotenia uvedeného ukazovateľa nemožno spomedzi
    hodnotených ELISA testov vybrať jeden a označiť ho ako najlepší.




                                    11
Tab. 1 Výsledky detekcie vzájomného falšovania kravského, kozieho a ovčieho mlieka pomocou ELISA testov (0; 0,5 a 1 % falšovaný podiel)

                                           Koncentrácia kravského a kozieho mlieka v zmesi mlieka vypočítaná pomocou vybraných regresných rovníc, %
Koncentrácia,         Spôsob
     %              zmiešavania         RC – bovine            RID CIS                RC – bovine            RID CIS              RC – caprine             RID GIS
                                      kravské mlieko        kravské mlieko          kravské mlieko        kravské mlieko           kozie mlieko          kozie mlieko
                                      v kozom mlieku        v kozom mlieku          v ovčom mlieku        v ovčom mlieku         v ovčom mlieku        v ovčom mlieku
                           01                ●                      ●                       ●                     ●                      ●                     ●
       0                   02                ●                      ●                       ●                     ●                      ●                     ●
                           03                ●                      ●                       ●                     ●                      ●                     ●
                           A                0,05                 0,23                     0,04                  0,18                   0,48                  0,49
                           B                 ●                   0,21                     0,02                  0,16                     ●                     ●
                           C                 ●                   0,2                        ●                   0,14                   0,08                  0,41
                           D                 ●                   0,18                       ●                   0,11                     ●                   0,02
      0,5
                           E                 ●                     ●                        ●                    ●                       ●                     ●
                           F                 ●                     ●                        ●                   0,11                     ●                     ●
                           G                 ●                     ●                        ●                    ●                       ●                     ●
                           H                 ●                     ●                        ●                    ●                       ●                     ●
                           A                0,77                  0,99                   0,92                  0,94                    0,71                 0,93
                           B                0,42                  0,68                   0,33                  0,69                      ●                  0
                           C                0,76                  0,89                   0,63                  0,72                    0,11                 0,8
                           D                0,25                  0,56                   0,23                  0,6                       ●                  0,02
       1
                           E                0,12                  0,45                   0,12                  0,52                      ●                  0
                           F                0,14                  0,46                   0,13                  0,53                      ●                   ●
                           G                 ●                    0,45                   0,1                   0,51                      ●                  0
                           H                 ●                    0,22                      ●                  0,37                      ●                   ●
Vysvetlivky k tab. 1 a 2
01= nefalšované surové mlieko
02= nefalšované 1 x pasterizované mlieko C = surové mlieko v pasterizovanom mlieku                 F = pasterizované mlieko v surovom mlieku – pasterizovaná zmes
03= nefalšované 2 x pasterizované mlieko D = surové mlieko v pasterizovanom mlieku – pasterizovaná zmes G = pasterizované mlieko v pasterizovanom mlieku
A = surové mlieko v surovom mlieku       E = pasterizované mlieko v surovom mlieku                   H = pasterizované mlieko v pasterizovanom mlieku – pasterizovaná zmes
B = surové mlieko v surovom mlieku – pasterizovaná zmes
● absolútna hodnota vypočítanej koncentrácie nie je uvedená, pretože nameraná absorbancia falšovaného podielu v mliečnej zmesi je menšia ako absorbancia 0 % štandardov

                                                                               12
Tab. 2 Výsledky detekcie vzájomného falšovania kravského, kozieho a ovčieho mlieka pomocou ELISA testov (3; 10 a 15 % falšovaný podiel)

                                       Koncentrácia kravského a kozieho mlieka v zmesi mlieka vypočítaná pomocou vybraných regresných rovníc, %
Koncentrácia,       Spôsob
     %            zmiešavania        RC – bovine           RID CIS              RC – bovine          RID CIS            RC – caprine          RID GIS
                                   kravské mlieko       kravské mlieko        kravské mlieko      kravské mlieko         kozie mlieko       kozie mlieko
                                   v kozom mlieku       v kozom mlieku        v ovčom mlieku      v ovčom mlieku       v ovčom mlieku     v ovčom mlieku
                       A                  2,51               2,89                 2,49                2,56                   3,08             3,06
                       B                  1,61               2,14                 1,57                1,92                     ●              0,08
                       C                  2,49               2,76                 2,43                2,3                    2,95             2,93
                       D                  1,27               2,72                 1,3                 1,39                   0,03             0,32
       3
                       E                  0,85               1,92                 1,06                1,12                     ●                ●
                       F                  0,87               1,94                 1,01                1,08                     ●                ●
                       G                  1,48               2,16                 1,18                1,25                     ●                ●
                       H                  0,71               1,21                 0,84                0,98                     ●                ●
                       A                  9,87              9,99                  9,9                 9,98                   9,93              9,46
                       B                  4,85              8,11                  5,78                8,5                    0,37              1,39
                       C                  9,45              9,85                  9,51                9,04                   9,62              6,71
                       D                  4,13              7,8                   5                   6,69                   1,16              1,33
      10
                       E                  3,54              7,32                  4,64                6,25                     ●               0,15
                       F                  3,13              6,68                  4,42                6,19                     ●                ●
                       G                  3,91              6,93                  4,95                6,45                   0,05              0,18
                       H                  2,93              5,89                  3,65                5,65                     ●                ●
                       A                  14,93               ●                     14,77               ●                   14,81              14,88
                       B                  5,99               8,99                 7,23                 9,44                  2,39                1,44
                       C                  12,78               ●                   11,47                 ●                   11,42              11,69
                       D                  5,72              9,06                  6,43                 7,43                  2,76               1,53
      15
                       E                  4,61              8,5                   5,51                 6,92                  0,08               0,3
                       F                  3,98              7,34                  4,48                 6,79                    ●                 ●
                       G                  5,31              7,87                  6,17                 7,19                  0,35               0,44
                       H                  3,59              6,6                   4,08                 6,29                    ●                0,11



                                                                         13
Z výsledkov hodnotenia kvality detekcie vzájomného zmiešavania
kravského, kozieho a ovčieho mlieka po ich tepelnom ošetrení (71,7 – 77
ºC po dobu 20 sekúnd) vyplývajú nasledovné závery:
 Jednofaktorovou analýzou rozptylu sme zistili, že na absorbancie
    sledovaných falšovaných množstiev mal výrazný vplyv použitý
    spôsob vzájomného zmiešavania kravského, kozieho a ovčieho mlieka
    (vrátane tepelného ošetrenia mlieka). Uvedenú skutočnosť sme
    vyjadrili jednak hodnotou P, ako aj hodnotou testovacieho kritéria F.
 Hodnota P bola vo všetkých prípadoch nižšia než 0,05, t.z., že medzi
    nameranými absorbanciami rôznych falšovaných množstiev existovali
    štatisticky preukázne rozdiely vplyvom použitých spôsobov
    vzájomného zmiešavania. Štatisticky veľmi vysoko preukázny vplyv
    (***P<0,001) sme zaznamenali u väčšiny realizovaných meraní
    (falšovaná koncentrácia – 0,5; 1; 3; 10 a 15 %). Štatisticky preukázny
    vplyv (*P<0,05) sme zistili pri 0 % koncentrácii kravského mlieka
    v kozom a ovčom mlieku a vysoko preukázny vplyv (**P<0,01) pri 0
    % koncentrácii kozieho mlieka v ovčom mlieku.
 Hodnota testovacieho kritéria F bola vo všetkých prípadoch väčšia než
    F krit (F > F krit), t.z., že skúmaný faktor premenlivosti (spôsob
    zmiešavania) výrazne vplýval na rozptyl absorbancií.
 Skúmaním vplyvu tepelného ošetrenia mlieka na detekciu falšovania
    sme zistili, že vzorky, ktoré boli v rôznych kombináciách tepelne
    ošetrené, vykazovali nižšie optické denzitné reakcie v porovnaní s
    tými, ktoré tepelnému ošetreniu neboli vôbec vystavené.
    Najvýraznejší pokles absorbancií sme zaznamenali pri zmiešavaní
    všetkých sledovaných pomerov pasterizovaného mlieka v
    pasterizovanom mlieku iného druhu – pasterizovaná zmes. Denzitné
    reakcie ostatných vzoriek boli vplyvom pasterizácie taktiež znížené,
    ale v menšej miere.

4.3 Aplikácia ELISA testov na detekciu falšovania ovčieho a kozieho
    mlieka
        Z analýz, ktoré boli zamerané na detekciu falšovania ovčieho
a kozieho mlieka na Slovensku pomocou testov RIDASCREEN CIS,
vyplývajú nasledovné závery:
 Dôkaz zohriatia mlieka pomocou Fosfatestu (dôkaz zohriatia mlieka
    na 71 až 74 ºC krátkodobo alebo 62 až 65 ºC po dobu 30 minút), ktorý
    sme uskutočnili pred vlastnou detekciou falšovania u všetkých
    vyšetrovaných vzoriek, nepotvrdil uvedené tepelné ošetrenie mlieka.


                                   14
    V analyzovaných vzorkách kozieho a ovčieho mlieka sme nezistili
     žiadne prídavky kravského mlieka (resp. menej ako 0,1 %). Zároveň
     sme zaznamenali, že vzorky, ktoré boli tepelne ošetrené (71,7 – 77 ºC
     po dobu 20 sekúnd) vykazovali nižšie optické denzitné reakcie v
     porovnaní s tými, ktoré tepelnému ošetreniu vystavené neboli (ovčie
     mlieko: o 3 %; kozie mlieko: o 2,4 %).
    S cieľom porovnať citlivosť ELISA testov, sme meraním absorbancií
     falšovaných množstiev v skúmaných vzorkách ovčieho a kozieho
     mlieka pomocou dvoch testovacích platní, dosiahli rovnaké výsledky
     týkajúce sa stanovenia falšovania.

  5 ZÁVER PRÁCE A NÁVRHY NA VYUŹITIE VÝSLEDKOV
         Výsledky získané v dizertačnej práci majú širšie uplatnenie pre
ďalší rozvoj vedy, ako aj spoločenskej praxi v nasledovných oblastiach.

1. Vzhľadom k tomu, že problematika detekcie falšovania mlieka nebola
na Slovensku doteraz cielene riešená a spracovaná, za prínos tejto
dizertačnej práce považujeme sústredenie zdrojov informácií, resp.
vedeckých poznatkov z európskej, ako aj svetovej vedeckej literatúry,
ktoré sa zaoberajú autentifikáciou mlieka.
         Na základe získaných poznatkov, ktoré uvádzame v časti
“Prehľad o súčasnom stave riešenej problematiky” je možné získať hlbší
a ucelený pohľad na posúdenie, analyzovanie, porovnanie a praktickú
aplikáciu konkrétnych metód. Z balíka získaných poznatkov sa časť
využila pri spracovaní predkladanej dizertačnej práce a časť má podstatný
význam v ďalšej vedeckej práci, napr. pri tvorbe výskumných projektov.

2.   Vedecký prínos dizertácie
         Vedeckým prínosom predkladanej dizertačnej práce je skúmanie a
hodnotenie kvality detekcie laboratórne pripraveného vzájomného
falšovania kravského, kozieho a ovčieho mlieka pomocou ELISA testov.
         Zamerali sme sa na laboratórne skúšanie, hodnotenie
a porovnávanie kvalitatívnych parametrov štyroch druhov ELISA testov
od dvoch výrobcov.
         Išlo o testy RIDASCREEN CIS, RIDASCREEN GIS, RC –
kravské a RC – kozie. Všetky testy sú založené na špecifickej detekcii
kravských, resp. kozích imunoglobulínov vo vzorkách mlieka, resp. syrov
pomocou špecifických protilátok.



                                    15
   V oblasti laboratórneho skúšania presnosti ELISA testov sme
    matematicko-štatistickou analýzou zistili, že všetky testy splnili
    kvalitatívne kritériá. Hodnoty variačných koeficientov absorbancií
    sledovaných falšovaných koncentrácií boli vo všetkých prípadoch pod
    limitujúcou hodnotou 10 % a na kvalitatívny parameter presnosť
    nevplývali nami sledované faktory.
   V oblasti laboratórneho skúšania špecifickosti a citlivosti ELISA
    testov sme u väčšiny z nich zaznamenali veľmi dobrú až výbornú
    schopnosť detekovať väčšinu sledovaných falšovaných prídavkov.
    Zároveň možno konštatovať, že z hľadiska hodnotenia špecifickosti
    a citlivosti nemožno spomedzi hodnotených ELISA testov vybrať
    jeden a označiť ho ako najlepší.
   V oblasti skúmania vplyvu tepelného ošetrenia mlieka na detekciu
    falšovania sme zistili, že vzorky, ktoré boli v rôznych kombináciách
    tepelne ošetrené (pasterizované pri teplote 71,7 – 77 ºC po dobu 20
    sekúnd), vykazovali nižšie optické denzitné reakcie v porovnaní s
    tými, ktoré tepelnému ošetreniu neboli vôbec vystavené.

Ďalší výskum v riešenej problematike odporúčame zamerať na:
   skúmanie a hodnotenie kvality detekcie falšovania mlieka a syrov
    ELISA testami od ďalších výrobcov,
    skúmanie vplyvu rôznych druhov tepelných ošetrení mlieka na
    detekciu falšovania (vysoká pasterizácia, sterilizácia a UHT ohrev),
   skúmanie vplyvu rôznych faktorov na detekciu falšovania mlieka
    (podnebie, botanické zloženie pastvy, genetické a fyziologické faktory
    - plemeno, individualita, štádium laktácie, zdravotný stav zvierat),
   porovnanie kvality detekcie falšovaných podielov vo vzorke mlieka,
    resp. syrov stanovením srvátkového IgG a kazeínu,
   skúmanie vplyvu procesu zrenia syrov na citlivosť a špecifickosť
    detekcie falšovania,
   vývoj nových progresívnych analytických možností detekcie
    falšovania mlieka a mliečnych výrobkov (bryndza, rôzne druhy syrov,
    jogurty a pod.), ako aj ďalších produktov z prvovýroby
    a potravinárskej výroby.
3. Spoločenský a národohospodársky prínos dizertácie
         V súčasnosti    sa    v potravinárstve  zvýšilo     zastúpenie
imunologických techník umožňujúcich zisťovať falšované potraviny.


                                   16
         Predložená dizertačná práca by mala okrem iného pomôcť našim
prvovýrobcom, a spracovateľom mlieka, ale aj orgánom potravinového
dozoru ľahšie sa orientovať pri nákupe a využití ELISA testov pre detekciu
falšovania mlieka, prípadne syrov.
         Na základe vyhodnotených výsledkov možno konštatovať, že
porovnávané ELISA testy sú napriek rozdielnym princípom vyhodnotenia
analýz vysoko špecifické a citlivé.
         Vzhľadom k tomu, že ELISA testy RC – kravské a RC – kozie
patria medzi kvalitatívne a kvantitatívne testy, odporúčame ich aplikovať
najmä v referenčných laboratóriách. Tie sú vybavené kvalitnejšou
prístrojovou technikou, laboratórnymi pomôckami, doplňujúcim
materiálom i vyškoleným personálom. Výhodou je aj 96 jamkové
prevedenie súprav, ktoré umožňuje naraz vykonať väčší počet testovaní.
Keďže sa jedná o stripové súpravy, v prípade potreby možno analyzovať aj
menší počet vzoriek.
          ELISA test RIDASCREEN CIS patrí medzi kvalitatívne a
semikvantitatívne testy, ktoré síce determinujú prítomnosť jednotlivých
podielov kravského mlieka v mliečnej zmesi v určitom detekčnom rozpätí,
z hľadiska citlivosti detekcie však nemožno presne určiť konkrétne
falšované koncentrácie. Z uvedeného dôvodu je tento test určený
predovšetkým pre výrobcov i spracovateľov mlieka, ktorí ho môžu
aplikovať v rámci samokontroly zameranej na orientačné stanovenie
falšovania už pri dodávke nespracovaného mlieka. Výhodou je v tomto
prípade 48 jamkové prevedenie diagnostických súprav, ktoré sú
taktiež stripové a v prípade potreby umožňujú analyzovať aj menší počet
vzoriek.
          ELISA test RIDASCREEN GIS patrí medzi kvalitatívne
a kvantitatívne testy, preto je vhodný tak pre referenčné laboratóriá, ako aj
pre výrobcov a spracovateľov mlieka, ktorí však disponujú kvalitnejším
laboratórnym vybavením. Tento test patrí medzi stripové 48 jamkové
diagnostické súpravy, ktoré v prípade potreby umožňujú analyzovať aj
menší počet vzoriek.
          Stanovenie falšovania mlieka a syrov si okrem ELISA testov
vyžaduje aj základné laboratórne vybavenie: meracie pipety, skúmavky,
trecie misky, mikroplatňový spektrofotometer (vlnová dĺžka 450 nm),
centrifúgu, číre reagenčné poháre, mixér alebo mažiar atď. V prípade, že
pre analýzy nie sú vytvorené všetky spomenuté podmienky, detekciu
falšovania možno uskutočniť aj ELISA testami, ktoré sú založené na
vizuálnej determinácii prostredníctvom farebnej reakcie (membránové,


                                     17
resp. imunochromatické testy). Tieto testy vykazujú menšiu senzitivitu,
čoho výsledkom je nižšia presnosť výsledkov.
         Z uvedeného vyplýva, že výsledky práce možno využiť v procese
kontroly mlieka z hľadiska stanovenia autenticity jednak orgánmi štátneho
potravinového dozoru (resp. úradnej kontroly potravín), ako aj samotnými
spracovateľskými podnikmi.
         Z dosiahnutých výsledkov tiež vyplýva, že detekciu falšovania
mlieka výrazne ovplyvňuje tepelné ošetrenie mlieka. Z uvedeného dôvodu
odporúčame pred každým stanovením uskutočniť u vzoriek dôkaz
zohriatia mlieka.
         S problematikou autenticity mlieka a mliečnych výrobkov sa
stretávajú výrobcovia, spracovatelia, distribútori, spotrebitelia, orgány
štátneho dozoru a odborníci na legislatívu. Práve z legislatívneho hľadiska
navrhujeme novelizáciu Výnosu Ministerstva pôdohospodárstva
Slovenskej republiky a Ministerstva zdravotníctva Slovenskej republiky z
9. septembra 2004 č. 2265/2004-100, ktorým sa vydáva hlava
Potravinového kódexu Slovenskej republiky upravujúca mlieko a výrobky
z mlieka doplnením paragrafu, ktorý sa týka falšovania mlieka a syrov.
         Uvedený paragraf sa totiž nachádzal v predchádzajúcom Výnose
Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky a Ministerstva
zdravotníctva Slovenskej republiky z 22. marca 2000 č. 636/1/2000-100.
         Právne akty ES/EÚ, ktoré sa zaoberajú falšovaním mlieka a
mliečnych výrobkov (Nariadenie komisie (ES) č. 577/97 a Nariadenie
komisie (ES) č. 213/2001) platia aj pre Slovenskú republiku a musia sa
v plnom rozsahu rešpektovať. Vo Výnose z 9. septembra 2004 č.
2265/2004-100 sú uvádzané vo forme osobitných predpisov, ktoré je nutné
v prípade potreby samostatne vyhľadať.
         Výsledky dosiahnuté v dizertačnej práci sú využiteľné v
pedagogickom procese pri výučbe predmetov zaoberajúcich sa
autentifikáciou, resp. falšovaním potravín (Potraviny a imunológia,
Falšovanie potravín, Bezpečnosť potravín, Hygiena potravín), na
odborných prednáškach alebo v rámci doškoľovacích kurzov pre
záujemcov o uvedenú problematiku.

6 POUŽITÁ LITERATÚRA
1. CAN, E. 1996. Entwicklung und Andwendung von
enzymimmunologischen Verfahren zum Nachweis von Kuhmilch in
Büffelmilch und käse: Inaugural-Disseration zur Erlangung der



                                    18
  tiermedizinischen Doktorwürde. München: die Tierärztlichen Fakultät der
  Ludwig-Maximilians-Universität, 1996, 92 s.
  2. GARCÍA, T. – MARTÍN, R. – RODRÍGUEZ, E. et al. 1994. Detection
  of goats milk in ewes milk by an indirect ELISA. In: Food Agric.
  Immunol., 1994, 6, p. 113-118.
  3. MIRALLES, B. – BARTOLOMÉ, B. – RAMOS, M. ET AL. 2000.
  Determination of whey protein to total protein ratio in UHT milk using
  fourth derivative spectroscopy. In: Int. Dairy J., 2000, 10, p. 191-197.
  4. Nariadenie komisie (ES) č. 577/97 z 1. apríla 1997, ktorým sa
  ustanovujú niektoré podrobné pravidlá pre uplatňovanie nariadenia Rady
  (EHS) 1898/87/ES o ochrane označení používaných pri predaji mlieka a
  mliečnych výrobkov.
  5. Nariadenie komisie (ES) č. 213/2001 z 9. januára 2001, ktorým sa
  ustanovujú podrobné pravidlá pre aplikáciu nariadenia Rady (ES) č.
  1255/1999 týkajúce sa metód analýzy a hodnotenia kvality mlieka a
  mliečnych výrobkov a ktorým sa menia a dopĺňajú nariadenia (ES) č.
  2771/1999 a (ES) 2799/1999.
  6. RODRÍGUEZ, E. – MARTÍN, R. – GARCÍA, T. et al. 1994. Sandwich
  ELISA for detection of goats milk in ewes milk and cheese. In: Food Agric.
  Immunol., 1994, 6, p. 105-111.
  7. SCHILK, J. 1995. Enzymimmuntests für bovines Plasmin und caprines
  IgG – Nachweis von Kuh- und Ziegenmilch in Schafmilch: Inaugural
  Dissertation zur Erlangung der tiermedizinischen Doktorwürde. München:
  die Tierärztlichen Fakultät der Ludwig-Maximilians-Universität München,
  1995, 120 s.
  8. STEFANIAK, T. – CHRZANOWSKA, J. – NIKOLAJCZUK, M. et al.
  2000. Immunologiczne i elektroforetzcne wykrywanie zafalszowań mleka
  koziego i jego produktów mlekiem krowim. In: Medycyna Wet, 2000, 56
  (8), s. 505-509.

Ďalších 129 literárnych zdrojov je uvedených v dizertačnej práci.


  7 ZOZNAM PUBLIKOVANÝCH PRÁC AUTORA
  1. Zeleňáková, L. – Popelka, P. – Golian, J. – Horská, D. – Popelka, P.
  2002. Detekcia falšovania ovčích syrov pomocou enzýmovej
  imunoanalýzy (ELISA). In: Vedecký seminár s medzinárodnou účasťou
  “Aktuálne problémy riešené v agrokomplexe” 15. november 2002, Nitra:
  SPU, 2002, s. 257 – 259, ISBN 80-8069-126-6



                                     19
2. Zeleňáková, L. – Golian, J. 2003. Vývoj a aplikácia imunochemických
metód na detekciu falšovania mlieka. In:          Zborník z konferencie
Laboralim, s.356 – 359, ISBN 80-1887-4
3. Zeleňáková, L. – Golian, J. 2003. Vyšetrenie a hodnotenie ovčieho
mlieka a syrov na detekciu falšovania metódou ELISA podľa požiadaviek
potravinového kódexu SR. In: Vedecká seminár “Mlieko a mliečne
výrobky vo výžive ľudí” 20. 5. 2003, Nitra: SPU, 2003, s. 42 – 45, ISBN
80-8069-197-5
4. Zeleňáková, L. 2003. Ekonomické hľadiská produkcie mlieka a
mliečnych výrobkov. In: Vedecký seminár “Mlieko a mliečne výrobky vo
výžive ľudí” 20. 5. 2003, Nitra: SPU, 2003, s. 54 – 57, ISBN
80-8069-197-5
5. Zeleňáková, L. – Golian, J. 2003. Aplikácia ELISA metódy na detekciu
falšovania ovčieho mlieka a syrov a hodnotenie výsledkov podľa
požiadaviek Potravinového kódexu SR. In: Mliekárstvo, roč. 34, 2003, č.
4, s. 35 – 37, ISBN 1210-31-44
6. Zeleňáková, L. 2003. Analytické možnosti autentifikácie mlieka
a mliečnych výrobkov. In: Mliekárstvo, roč. 34, 2003, č. 4, s. 38 – 40,
ISBN 1210-31-44
7. Zeleňáková, L. – Pavličová, S. – Kovačic, V. – Golian, J. 2004.
Determinácia geografického pôvodu ementálskych syrov vybranými
analytickými metódami. In: Medzinárodná vedecká konferencia “Hygiena
alimentorum XXV – Aktuálne otázky výroby a spracovania mlieka –
bezpečné potraviny pre všetkých” 27. – 28. 5. 2004 Štrbské Pleso – Vysoké
Tatry. Košice, Bratislava: UVL, 2004, s. 185 –186, ISBN 80-88985-99-4
8. Zeleňáková, L. 2004. Validácia kvalitatívnych parametrov RC
bovinného testu. In: Mliekárstvo, roč. 35, 2004, č. 3, s. 39 – 41, ISBN
1210-31-44




                                   20

				
DOCUMENT INFO
Shared By:
Categories:
Tags:
Stats:
views:108
posted:5/20/2012
language:Slovak
pages:20