Biocat�lise em Ambientes Aquo-Restritos Utilizando Lipases by g3WHbPhm

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									                Biocatálise em Ambientes Aquo-Restritos
              Utilizando Lipases Produzidas por Penicillium
                         corylophilum IOC 4211

           Alessandra M. Baron1; Nadia Krieger1, David A. Mitchell2, Mario Baigorí3


    1,2
          Universidade Federal do Paraná- Departamento de Química, Departamento de Bioquímica e Biologia
               Molecular, Curitiba-PR, Brasil, Caixa Postal 19081 - 81531-990 Curitiba - PR - E-mail:
                                           alessmachado@hotmail.com
              3
               PROIMI (Planta Piloto de Procesos Industriales Microbiológicos)- Tucumán, Argentina.



                                                 RESUMO
  O objetivo deste trabalho foi estudar lipases de Penicillium corylophilum (IOC 4211)
visando utilização em biocatálise em solventes orgânicos. Foram estudadas a) as melhores
condições de produção da enzima; b) a estabilidade do extrato lipolítico em solventes
orgânicos; c) a utilização do extrato lipolítico em reações de síntese do oleato de n-butila em
micelas reversas AOT/n-heptano. A produção máxima da enzima foi de 6,8  0,4 U.mL-1,
após 144 h, a 29C e 120 rpm, utilizando-se um meio composto por sais, glicose e 2 % (v/v)
de óleo de oliva. Em heptano observou-se uma ativação de 14 e 30 %, respectivamente para
valores de aw de 0,53 e 0,95. O extrato lipolítico de P. corylophilum catalisou a síntese do
oleato de n-butila, com um rendimento de 100 %  5 %, após 12 h de reação, nas condições
de W0 (W0=[H2O]/[AOT]) 10, 37 ºC, razão molar (RM) 1:3.

                                              INTRODUÇÃO
  A utilização de enzimas na transformação de compostos orgânicos é conhecida há mais de
cem anos (Costa e Amorim, 1999). Entretanto, foi somente a partir da segunda metade da
última década que o verdadeiro potencial que estes biocatalisadores representa em síntese
orgânica começou a ser explorado. Dentre as numerosas aplicações de reações enzimáticas em
meio orgânico destacam-se a síntese de produtos de interesse nas áreas clínica, nutricional,
ambiental, industrial e biotecnológica (Reetz, 2002). Apesar do reconhecimento desses
benefícios, o número de trabalhos onde enzimas têm sido utilizadas em meios não-aquosos ou
aquo-restritos é ainda bastante limitado quando comparado com a quantidade de monografias
produzidas sobre estudos em fase aquosa. As principais razões que podem justificar tal
diferença no uso de meios aquosos e não-aquosos estão relacionadas com o desconhecimento
do comportamento de inúmeras enzimas em ambientes aquo-restritos (Lima e Angnes, 1999).
  A possibilidade de melhor solubilização de substratos hidrofóbicos (Knezevic et al., 2002)
bem como, o esclarecimento do comportamento de lipases em meios aquo-restritos
justificaram a realização deste trabalho, cujo objetivo principal foi o estudo do
comportamento destas enzimas em meios de solventes orgânicos.

                                       MATERIAL E MÉTODOS
1. Produção de lipases
1.1. Microrganismo e condições de cultivo: foi utilizado o microrganismo P. corylophilum
Dierckx (IOC–4211). A produção da enzima foi estudada em dois diferentes meios (% m/v ou
v/v): Meio (1)-0,2 KNO3; 0,1 K2HPO4; 0,05 MgSO4. 7H2O; 0,043 ZnSO4.7H2O; 0,11
FeSO4.7H2O; 0,015 MnSO4.4H2O; 1,25 (NH4)2SO4; 0,5 de extrato de levedura; 2 de peptona
de carne e 1 de óleo de oliva. Meio (2)- 0,14 de NH4NO3; 0,073 MgSO4.7H2O; 0,067
KH2PO4; 0,01 ZnSO4.7H2O; 0,0007 FeSO4.7H20; 0,067 de glucose e 2 de óleo de oliva. Os
cultivos foram realizados em Erlenmeyers, a 120 rpm e 29 oC.

1.2. Obtenção do extrato bruto: após a seleção do melhor meio de cultivo para produção da
enzima, o fungo foi cultivado e a fermentação foi interrompida quando a atividade lipolítica
era máxima (144 h); em seguida, adicionou-se sulfato de amônio (80 %) ao sobrenadante, sob
agitação branda, a 4°C, e deixou-se por 12 h, seguindo-se uma etapa de centrifugação (12.000
g, 10 min). O sobrenadante foi removido e o precipitado ressuspendido em um volume
mínimo de tampão fosfato pH 7,0, 0,05 mol.L-1 e dialisado contra o mesmo tampão a 4 ºC. O
extrato lipolítico bruto assim obtido foi utilizado para os estudos neste trabalho.

2. Estabilidade em solventes orgânicos: para determinar a estabilidade da enzima em
solventes hidrofílicos (acetona, etanol, isopropanol e butanol), o precipitado ressuspenso em
tampão foi adicionado e incubado (30 min, 37 oC) em diferentes concentrações de solventes
(10, 20, 40, 60 e 75 % v/v). Para ensaios com solventes hidrofóbicos (tolueno, hexano,
isooctano e heptano), a enzima foi previamente imobilizada em gel Octyl Sepharose, (item 3).
Tanto os solventes como a enzima previamente imobilizada foram incubados a 20 C durante
16 horas em presença de diferentes soluções salinas saturadas para atingir a atividade de água
(aw) requerida (Vulson et al., 2000). Os sais empregados foram LiCl (aw 0,11); Mg(NO3)2 (aw
0,5) e KNO3 (aw 0,95). Em seguida, a enzima imobilizada foi incubada na presença dos
solventes (30 min, 37 oC). Após este período de incubação, o suporte foi lavado com tampão
fosfato pH 7,0 (0,05 mol.L-1) e submetido à dosagem de atividade lipolítica, conforme
descrito em 5.1.

3. Imobilização da Enzima: a imobilização enzimática foi realizada utilizando como suporte
o gel hidrofóbico OctylSepharose Fast Flow (Amersham-Pharmacia). O gel que se encontrava
em solução alcóolica 20 % (m/v) foi previamente lavado com tampão fosfato pH 7,0, 0,05
mol.L-1 (2 vezes). A imobilização foi realizada adicionando-se 300 L do extrato lipolítico a
100 L do gel, sob agitação branda, por 1 hora.

4. Síntese do Oleato de n-Butila em Micelas Reversas: as micelas invertidas foram
preparadas por adição do extrato lipolítico liofilizado adicionando-se a quantidade de tampão
fosfato pH 7,0, (0,05 mol.L-1) requerida para atingir o teor de água desejado, expresso pelo
parâmetro W0 (W0=[H2O]/[AOT]) desejado (5, 10 ou 15), a 5 mL de uma solução de AOT
(bis 2 etil, hexil sulfosuccinato de sódio, 0,1 mol.L-1) em heptano, agitando-se em vórtex até
que a solução estivesse translúcida. A concentração de proteínas foi mantida constante em
todos os experimentos (0,38 mg/mL do meio reacional). A reação foi realizada em bioreator
de vidro com camisa de aquecimento, tendo sido iniciada com a adição dos substratos butanol
e ácido oleico, na razão molar (RM) 1:3, a 37 oC. O rendimento da produção de éster e a
atividade da enzima foram determinados através do método de Lowry e Tinsley (1976).

5. Métodos Analíticos
5.1 Dosagem de Atividade Lipolítica em Meio Aquoso: a atividade lipolítica foi determinada
pela hidrólise do palmitato de p-nitrofenila a 410 nm, conforme Krieger et al. (1997). Uma
unidade de atividade enzimática (U.mL-1) foi definida como a liberação de 1 mol.min-1 de p-
nitrofenol por mL do extrato enzimático. Para os cálculos, foi utilizado o coeficiente de
extinção molar do pNPP de 0,978.103 L.mol-1.cm-1, determinado a partir de uma curva de
calibração com o p-nitrofenol.

5.2 Dosagem de Atividade em Meio Micelar: o método de Lowry e Tinsley (1976) foi
utilizado para quantificar o teor residual dos ácidos graxos durante a síntese do éster
catalisada pela enzima. Uma unidade de atividade enzimática em reações de síntese foi
definida como 1 mol de ácido graxo consumido, por minuto e por mL do meio reacional. Os
cálculos de concentração tiveram por base a curva de calibração do ácido oleico, preparada
nas mesmas condições do ensaio.

5.3 Dosagem de Proteínas: foi feita de acordo com o método de Bradford (1976).

                                   RESULTADOS E DISCUSSÃO

1. Produção de lipases
  Esta etapa teve por objetivo verificar se era possível a produção da enzima em um meio
inorgânico, de custo menor do que o que era normalmente utilizado para produção da enzima
em trabalhos anteriores (Fernandes, 2001). Além disso, a utilização do meio inorgânico pode
beneficiar as etapas de purificação, pois não há a formação de pigmentos escuros durante a
etapa de esterilização, o que normalmente ocorre com o meio contendo fontes de nitrogênio
como a peptona e o extrato de levedura.

                                                  8
                                                  7

                                                  6
                                     A (U.mL-1)




                                                  5

                                                  4

                                                  3

                                                  2

                                                  1
                                                  0
                                                      0   24   48   72    96     120   144   168   192
                                                                         t (h)


Figura 1. Produção de lipases por Penicillium corylophilum. Condições: Meio 1 (), solução de sais, extrato de
levedura, peptona de carne e 1 % de óleo de oliva. Meio 2 (), solução de sais, glucose e 2 % de óleo de oliva.
Agitação 120 rpm e 29 C.

  Os resultados mostraram que com o meio de cultivo 2 obteve-se atividade máxima de 7,1
U.mL-1, após 144 h, a 29C e 120 rpm, praticamente o dobro da obtida com o meio complexo
(1) 3,25 U.mL-1, após 72 h (Figura 1). Houve diferenças também no pH do meio de cultivo,
tanto inicial como no final, e na morfologia do microrganismo: no meio 1, o fungo produziu
pellets maiores (4,07  0,103 mm) do que os obtidos no meio 2 (1,21  0,05 mm). Os valores
de pH inicial para ambos os meios foram de 6,6 e 7,0 respectivamente e no pico máximo de
atividade o pH da fermentação no meio 1 foi de 6,5  0,26 e no meio 2, pH de 2,28  0,05. A
redução do pH dos meios de cultivo, neste último caso, pode ser atribuída ao fato do íon
amônio ser um ácido fraco e ao dissociar-se no meio produz amônia, que entra na célula por
difusão passiva, liberando íons H+ (Miranda et al., 1999).
  Em seguida, estudou-se a cinética de crescimento do microrganismo no meio 2,
acompanhando-se o pH, a atividade lipolítica, a concentração de proteínas e a biomassa
produzida. Estes experimentos foram feitos no regime de batelada, sacrificando-se três
Erlenmeyers para cada tempo estudado. Os resultados de pH e atividade confirmaram os
obtidos anteriormente (Figura 2 a,b,c). Os estudos de crescimento do fungo (Figura 2d)
permitiram o cálculo da taxa específica de crescimento () 0,0191 ± 0,033 h-1, com um tempo
de duplicação de 37,4 ± 6,46 h, que indicam um crescimento mais lento do fungo neste meio
inorgânico, em relação ao dados encontrados em literatura para o mesmo gênero de fungo
cultivado em fontes complexas de nitrogênio (Krieger, 1995). Como conclusão destes
experimentos, verificou-se que era possível produzir lipases de P. corylophillum no meio (2)
inorgânico, e este passou a ser o procedimento adotado para a produção do extrato bruto, que
após precipitação e diálise, foi utilizado nos experimentos descritos a seguir.

                                                                                                 180
                 7
                                                                                                 150
                 6
                                                                                                 120




                                                                         A (U.mg )
                                                                        -1
                 5
                                                                                                  90
    pH




                 4
                                                                                                  60
                 3
                                                                                                  30
                 2
                                                                                                   0
                     0   24   48    72    96      120 144 168 192 216                                  0   24    48    72    96      120 144 168 192 216
                                              t (h)                                                                              t (h)

   (a)                                                                                           (b)
                 8
                 7                                                                               10

                 6
                                                                             Biomassa (mg.mL )




                                                                                                  8
                                                                         -1
     A (U.mL )
    -1




                 5
                                                                                                  6
                 4
                 3                                                                                4
                 2
                                                                                                  2
                 1
                 0                                                                                0
                     0   24   48   72    96     120 144 168 192 216                                   0    24   48    72    96    120 144 168 192 216
                                              t (h)                                                                          t (h)

   (c)                                                                                           (d)
Figura 2. Cinética de crescimento microbiano durante cultivo para produção de lipase por Penicillium
corylophilum Dierckx IOC 4211. (a): pH; (b) atividade específica (U.mg-1) (c): atividade volumétrica (U.mL-1);
(d) Biomassa (mg.mL-1), sendo mg de células secas e mL, volume do meio de cultura.

3. Estabilidade do extrato lipolítico frente a solventes orgânicos
  O extrato lipolítico foi estável apenas em baixas concentrações (10 %, v/v) dos solventes
polares testados (Figura 3a), apresentando, para esta concentração, atividades residuais de 100
% para o etanol, 74 % para a acetona, 52 % para isopropanol e 1,7 % para o butanol. Com
concentrações de 20 % (v/v) dos solventes, a enzima apresentou atividade residual de 31 %
para o etanol e de 19 % para a acetona; em concentrações acima de 20 % (v/v) não foi
observada atividade residual para nenhum dos solventes estudados. Este resultado pode ser
explicado através da alteração da conformação cataliticamente ativa da enzima, causada pela
interação da enzima com o solvente ou pela remoção da água da camada de hidratação da
biomolécula, necessária à sua atividade (Simon et al., 1998).
  Os melhores resultados de estabilidade do extrato bruto de P. corylophilum frente a
solventes apolares foram obtidos para o heptano (Figura 3b), pois nos valores mais elevados
de aw a enzima mostrou uma ativação de 14 a 30 %. Em seguida, a enzima foi estável em
hexano (100 % de atividade residual), também com a maior aw (0,95). Para estes dois
solventes, houve um aumento da atividade residual com o aumento dos valores de aw, o que
não ocorreu para o isooctano ou para o tolueno. Este efeito pode ser explicado pela
manutenção da camada de hidratação da enzima, necessária para a manutenção da atividade
catalítica (Ahmad et al., 1998).

                                    100                                                                                       140
  Atividade em pontos percentuais




                                                                                            Atividade em pontos percentuais
                                                                                                                              120
                                    80
                                                                                                                              100
                                    60                                                                                         80

                                                                                                                               60
                                    40
                                                                                                                               40
                                    20
                                                                                                                               20

                                     0
                                                                                                                                0
                                           etanol    isopropanol    butanol     acetona
                                                                                                                                     hexano       heptano      isooctano     tolueno

                                          Solventes com diferentes concentrações de água                                            Solventes com diferentes atividades de água (aw).



(a)                                                                                        (b)
Figura 3. Estabilidade do extrato lipolítico de Penicillium corylophilum em solventes (a) polares. Condições:
Porcentagens em solventes 10 % (); 20 % (); 30 % (); 40 % (); 50 % (); (b) apolares. Atividade de água
(aw): 0,11 (); 0,53 (); 0,95 (). Tempo de incubação da enzima em presença do solvente: 30 min a 37ºC. O
percentual de atividade residual foi calculado pelo método do pNPP em meio aquoso em relação ao extrato
lipolítico não incubado (100 % de atividade).

  Geralmente a atividade enzimática é baixa em solventes que apresentam log P (logaritmo do
coeficiente de partição num sistema bifásico padrão octanol/água) menor do que 2, é
moderada em solventes com log P entre 2 e 4, e é alta em solventes apolares com log P maior
do que 4. Os valores do log P para os solventes estudados são: etanol -0,24; acetona 0,23;
isopropanol 0,29; butanol 0,8; tolueno 2,5; hexano 3,5; heptano 4,0 e isooctano 4,51 (Ahmad
et al., 1998; Jesus et al., 1997). Os resultados obtidos neste trabalho confirmam apenas
parcialmente esta regra, pois os maiores valores de atividade residual foram obtidos com o
heptano e com o hexano, solventes com log P de 3,5 e 4,0 respectivamente.

4. Síntese do Oleato de n-Butila em Micelas Reversas
  Os estudos anteriores mostraram que o melhor solvente para a manutenção da atividade
enzimática é o heptano. Assim, este solvente foi utilizado no meio de micelas reversas, que é
relatado na literatura como um dos mais adequados para a catálise enzimática em ambientes
orgânicos, pois facilita o controle de água no sistema através do parâmetro W0 (Carvalho e
Cabral, 2000).
  Observou-se que o extrato lipolítico catalisou a síntese do éster oleato de n-butila (Figura 4),
cujos melhores rendimentos após 9 h de reação foram: 80,8  4,04 % e atividade específica de
11,82  1,35 U.mg-1 para o W0 10; e 79,6  1,7 % e atividade específica de 11,51  0,47
U.mg-1 para o W0 5. Observou-se ainda que o rendimento decresceu consideravelmente com
W0 de 15, resultado este já esperado, tendo em conta que um aumento do teor de água no
sistema desloca o equilíbrio da reação no sentido da hidrólise.
  Após os primeiros ensaios com diferentes valores de W0 nas reações de esterificação do
oleato de n-butila, decidiu-se verificar a possibilidade de obter-se 100 % de rendimento. Para
isso, a reação foi seguida por 48 h, utilizando as melhores condições, isto é, meio reacional
com AOT/hepatno; 37 C; R.M 1:3 (70 de ácido e 210 mmol.L-1 de álcool) e W0 10 (com
tampão fosfato pH 7,0; 0,05 mol.L-1). Os resultados mostram que o rendimento foi de em 12 h
de reação.
  Considerando que o extrato lipolítico empregado nestes ensaios preliminares possui uma
atividade enzimática menor em relação às enzimas comerciais, e que as variáveis do sistema
não foram completamente estudadas, os resultados obtidos podem ser considerados bons,
porque abrem uma perspectiva de estudo da otimização da síntese do éster, visando uma
diminuição do tempo de reação. Além disso o oleato de n-butila é um composto de interesse
comercial. A literatura descreve que este éster é utilizado para adição no biodiesel durante o
inverno, como agente plastificante no cloreto de polivinila (PVC) e em fluidos hidráulicos
(Linko et al., 1995). Estes mesmos autores obtiveram o éster empregando lipases comerciais
de Chromobacterium viscosum, meio reacional de éter dietílico etanol (1:1), 0 a 14 % de
água, 0,3 a 1,5 % de enzima, razão molar (álcool: ácido) de 0,5:1 a 10:1 e temperatura de
37C. Os melhores resultados foram obtidos em 12 h com 98 % de rendimento. As condições
empregadas foram: 0 % de água, 0,3 % (m/v) de lipase, R.M 2:1.

                                           100

                                            80
                       Esterificação (%)




                                            60

                                            40

                                            20

                                             0

                                                 0   2    4      6        8        10
                                                       t (h)
        Figura 4. Cinética da reação de síntese do oleato de n-butila, catalisada por extrato lipolítico
        de Penicillium corylophilum em micelas reversas. W0 5 (○); W0 10 ();W0 15 (□).

                                                     CONCLUSÕES
  Foi possível produzir lipases de P. corylophilum em meio de cultivo com fonte inorgânica
(meio 2) de nitrogênio, de custo relativamente baixo (cerca 35 vezes menor), com atividades
de 6,8  0,4 U.mL-1, após 144 h, a 29C e 120 rpm de agitação.
  O extrato lipolítico mostrou baixa estabilidade com concentrações altas de solventes
polares. Acima de 20 % (v/v) não foi observada atividade residual. Nos estudos com solventes
apolares, os melhores resultados foram obtidos para o heptano. Com os valores mais elevados
de aw (0,53 e 0,95), a enzima mostrou uma ativação de 14 e 30 %, respectivamente. Em
seguida, a enzima foi estável no hexano (100 % de atividade residual), com aw de 0,95. O
extrato lipolítico de P. corylophilum catalisou a síntese do oleato de n-butila, com um
rendimento de 100 de éster após 12 h de reação, em condições de: W0 10, 37 ºC, RM 1:3
(ácido oleico: butanol).

                                                 AGRADECIMENTOS
 A Fundação Araucária e CAPES/SETCyP (Projeto de Cooperação Internacional Brasil
Argentina) pelo suporte financeiro e ao CNPq pelas bolsas de pesquisa concedidas a David
Alexander Mitchell e Nadia Krieger.
                                              REFERÊNCIAS
Ahmad, R.M.Y.; William, A.A. e Murray M. (1998), Ester synthesis in lipase-catalyzed reactions. Enzyme
Microb Tech, v. 23, n. 7-8, p. 438-450.
Bradford, M.M. (1976), A rapid sensitive method for a quantitation of microgram quantities of protein utilizing
the principle of protein-dye binding, Anal Biochem, v. 72, p. 248-254.
Carvalho, C.M.L. e Cabral, J.M.S. (2000), Reverse micelles as reaction media for lipases. Biochimie, v. 82, n.
11, p. 1063-1085.
Costa, V.E.U. e Amorim, H.L. (1999), O emprego de Lipases como Agentes de resolução Cinética de
Enantiômeros em Síntese Orgânica: Aspectos Gerais Sobre a Influência do Solvente. Quim Nova, v. 22, n. 6, p.
863-864.
Fernandes, A.M. (2001), Produção e Purificação de Novas Enzimas Hidrolíticas por Fungos Filamentosos.
Relatório de Iniciação Científica, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, Brasil.
Gerard, A.S. e Julian, B.C. (1999), Biocatalysis in organic media using enzymes from extremophiles. Enzyme
Microb Tech, v. 25, n. 6, p. 471-482.
Jesus, P.C.; Juarez J.; Silva P.L.F.; Burlin G. e Nascimento M.G. (1997), Organo-Gel: Um Sistema para a
Imobilização de Lipases e sua Aplicação em Síntese Orgânica. Quim Nova, v. 20, n. 6, p. 664-672.
Knezevic, Bobic, S.; Milutinovic, A.; Obradovic, B.; Mojovic, L. e Bugarski, B. (2002), Alginate-immobilized
lipase by electrostatic extrusion for the purpose of palm oil hydrolysis in lecithin/isooctane system. Process
Biochem, v. 38, n. 3, p. 313-318.
Krieger, N. (1995), Produção e Caracterização de Lipases de Penicillium citrinum. Tese de Doutorado.
Universidade Federal do Paraná, Curitiba, Brasil.
Krieger, N.; Taipa, E.H.M.; Lima-Filho, J.L. e Cabral, J.M.S. (1997), Kinetic charactristics of Penicillium
citrinum lipase in AOT- Isooctane reversed micelles. Appl Biochem Biotech, v. 67, n. 1-2, p. 85-87.
Lima, A.W.O. e Angnes, L. (1999), Biocatálise em Meios Aquo-Restritos: Fundamentos a Aplicações em
Química Analítica. Quim Nova, v. 22, n. 2, p. 229-245.
Linko, Y.Y.; Lämsa, M.; Huhtala, A. e Rantanen, O. (1995), Lipase Biocatalysis in the Production of Esters. J.
Am Oil Chem Soc, v. 72, n. 11, p. 1293-1299.
Lowry, R.R. e Tinsley, J.I. (1976), Rapid colorimetric determination of free fatty acids. J Am Oil Chem Soc, v.
53, p. 470-472.
Miranda, O.A.; Salgueiro, A.A.; Pimentel, M.C.B.; Lima Filho, J.L.; Melo, E.H.M. e Durán, N. (1999), Lipase
production by a brazillian strain of Penicillium citrinum using na industrial residue. Bioresource Technol, v. 69,
p. 145-147.
Reetz, M.T. (2002), Lipases as practical biocatalysts, Curr Opin Chem Biol, v. 6, n. 2, p. 145-150.
Simon, L.M.; László, K.; Vértesi, A.; Bagi, K. e Szajáni, B. (1998), Stability of hydrolytic enzymes in water-
organic solvent systems. J Mol Catal B- Enzy, v. 4, n. 1, p. 41-45.

								
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