Ensayo Western blot

							Electroforesis
   Método de laboratorio
    en el que se utiliza una
    corriente       eléctrica
    controlada     con      la
    finalidad de separar
    biomoleculas (ácidos
    nucleicos, proteínas)
    según su tamaño y
    carga     eléctrica      a
    través de una matriz
    gelatinosa.
    Técnicas
•   Northern blot: separación de moléculas de
    ARN transferencia a una matriz    se fija

•   Southern blot: separación de moléculas de
    ADN transferencia a una matriz     se fija

•   Western blot: separación de proteínas
    transferencia a una matriz    se adhiere
    anticuerpo específico     se fija
Procedimiento General
   A) Cultivo tisular
    B) Lisado celular y obtención de
    proteínas.
    C) Electroforesis en gel de
    poliacrilamida .
    D) Transferencia de las proteínas a
    un papel de nitrocelulosa.
    E) Incubación del papel con suero
    del paciente.
    F) Si existen anticuerpos para el
    Antígeno en el suero, éstos se
    unirán fuertemente a las proteínas
    transferidas al papel y se
    detectarán como bandas oscuras
    (f).
Procedimiento General
   Los anticuerpos primarios pueden
    detectarse a través de dos métodos:
    1) Usando proteína A o proteína G
    2) Con la participación de un segundo
    anticuerpo
   Tanto la proteína A como la proteína G son
    proteínas que se aislan de la pared celular de
    bacterias y que tienen la capacidad de unirse a
    la región Fc de los anticuerpos. Ambas pueden
    ser marcadas con facilidad con enzimas y otros
    marcadores. La proteína G tiene una capacidad
    de reconocimiento más amplia que la proteína
    A.
Anticuerpos secundarios:

  -Anticuerpos anti-anticuerpos
  -Anticuerpos monoclonales




-Fragmentos      Fab2,    producidos
   mediante digestión con pepsina
   de los anticuerpos puros
Ensayo de transferencia Western para VIH
   Es un enzimoinmunoensayo cualitativo para
    la detección in vitro de anticuerpos frente a
    los virus de VIH-1 y VIH-2, en suero o
    plasma humanos.

   Es más especifico para la detección de VIH
    en plasma o suero.
   Se utiliza electroforesis y
    electrotransferencia para la adhesión de
    antígeno vírico del VIH-1.

   Péptido sintético específico contra VIH-2.

   Control interno para reducir el riesgo de
    falsos negativos.
Principios quimicos y biologicos
Componentes del kit

•   Tiras de nitrocelulosa
•   Control no reactivo
•   Control reactivo fuerte
•   Control reactivo debil
•   Tampón de blotting concentrado (10x)
•   Tampon de lavado concentrado (20X)
•   Conjugado
•   Sustrato
•   Polvo de blotting
Control de Calidad
   Debe cumplir con las siguientes
    condiciones:
     Control no reactivo: no bandas específicas
      de VIH1 u VIH2. la banda control debe ser
      visible.
     Control reactivo fuerte: todas las bandas de
      peso molecular que corresponda deben ser
      visibles.
     Control reactivo débil: medida de
      sensibilidad del kit. Las bandas del control
      de suero deben ser visibles.
Interpretación de los resultados
•   Tiras deben estar completamente secas.


•   Se determina comparando cada tira de
    nitrocelulosa con las tira de control de
    ensayo con los controles No reactivo,
    Reactivo Fuerte y Reactivo Débil.

•   Algunos antígenos derivan de las
    mismas proteínas precursoras y pueden
    tener epitopos superpuestos.
 Verificar que la banda de control del
  suero sea visible
 Identificacion del peso molecular de
  cada banda de la tira de analisis
  utilizando como guia las tiras de control
  reactivo Fuerte, Debil o ambos.
 Interpretacion de las tiras de analisis
  según las autoridades pertinentes.
PMENV    GEN   Antígeno           Descripción

Gp 160   ENV   Forma polimerica   Ancha y difusa de
               de la gp41         glucoproteina
Gp 120   ENV   Membrana           Difusa de
               externa            glucoproteina
p66      POL   Transcriptasa      Banda discreta
               inversa
p55      GAG   Proteina           Banda discreta
               precursora
p51      POL   Transcriptasa      Banda discreta
               inversa            justo por debajo
                                  de p55
p39      GAG   Fragmento de p55 Banda discreta

gp41     ENV   Transmembrana      Difusa de
                                  glucoproteina
p31      POL   Endonucleasa       Doblete

p24      GAG   Proteína central   Banda ancha
               (core)
p17      GAG   Proteína central   Banda ancha
   Todas las bandas deben ser detectadas e
    interpretarse como Negativo, Positivo o Dudoso.
Patron                                Interpretacion
Ninguna banda virica especifica       Negativo
presente
Deteccion de anticuerpos p17          Negativo
unicamente
Deteccion de dos ENV y GAG o POL      VIH-1 positivo
Deteccion de dos ENV y GAG o POL      VIH-1 positivo con VIH-2 señalado
y banda especifica de VIH-2 visible
Cualquier banda virica especifica     Dudoso
presente, pero el patro no cumple con
los patrones de positivo
Cualquier banda virica especifica     Dudoso con VIH-2 señalado
presente ,pero el patron no cumple
los criterios para positivo con una
banda especifica de IH-2 visible