Your Federal Quarterly Tax Payments are due April 15th Get Help Now >>

Ika Lab Biologi Tanah by anamaulida

VIEWS: 87 PAGES: 22

									           Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB




     INSTRUKSI KERJA

LABORATORIUM BIOLOGI TANAH




    UNIVERSITAS BRAWIJAYA
           MALANG
             2011



                1
                        Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB




                 Instruksi Kerja
           Laboratorium Biologi Tanah
                 Jurusan Tanah
               Fakultas Pertanian
              Universitas Brawijaya

Kode Dokumen        :   0040207300
Revisi              :   2
Tanggal             :   08 Juni 2011
Diajukan oleh       :   Tim Unit Jaminan Mutu
                        Ketua,

                        ttd


                        Dr. Ir. Sugeng Prijono, SU
Dikendalikan oleh   :   Sekretaris Jurusan

                        ttd

                        Dr. Ir. Sugeng Prijono, SU
Disetujui oleh      :   Ketua Jurusan


                        ttd

                        Prof. Dr. Ir. Zaenal Kusuma, SU

                              2
                            Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB




                           DAFTAR ISI


                                                                Halaman
Daftar Isi                                                     iii
Daftar Gambar                                                  iii
1. Analisa Lignin                                              1
   …………………………………………………………………………………
2. Analisa Polyphenolic
   ………………………………………………………………………….…….                            3
3. Fraksionasi Bahan Organik berdasarkan ukuran
   partikel dengan metode POM                                  6
   ……………………………………………………………………….……….
4. Pengamatan Makrofauna Tanah : Cacing Tanah dan
   Rayap………………………………………………………………………                            8
5. Pengamatan Mikroorganisme tanah
   metode Slide Contact                                        12
   ……………………………………………………………………………………
6. Isolasi Mikrobia dari Lingkungan
……………………………………………………………………                                     15




                       DAFTAR GAMBAR


                                                                Halaman
1.    Skema prosedur fraksionasi bahan organic
     berdasarkan ukuran partikel (Particulate Organic
     Matter = POM)……………………………………………………………                      7
2. Posisi Pengambilan Sampel Cacing Tanah dan Rayap
di Lapangan………………                                              9




                                 3
                           Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB


                      ANALISIS LIGNIN
                    (Kode : 0040207301)

1. RUANG LINGKUP

   Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang
   akan mengukur kualitas bahan organik menggunakan parameter
   konsentrasi Lignin.

2. ALAT dan BAHAN

   A. Bahan pereaksi
   1. Acid detergent solution
     8 g CTAB ( cetylmethyl-ammonium bromide) dilarutkan
     dalam 400 ml H2SO4, 0.5 ( larutkan 28 ml H2SO4 pekat p.a ke
     dalam aquadest sampai mencapai volume 1000 ml),
   2. Antifoam solution
     2.5 ml silicon antifoam 30% dilarutkan dalam 100 ml
     aquadest. Silicon antifoam : 30 ml silicon antifoam dilarutkan
     dalam 100 ml aquadest, dan
   3. H2SO4 72%
     Larutkan 720 ml H2SO4 pekat p.a ke dalam aquadest sampai
     mencapai volume 1000 ml.

3. REFERENSI
    Prosedur Layanan Analisa Laboratorium dan Panduan Analisa
    Biologi Tanah.

4. DEFINISI
     -

5. URAIAN PROSEDUR

   1. Timbang 0.5 g contoh tanaman (WI) dan tambahkan 25 ml
       acid detergent solution dan 1 ml antifoam ke dalam 250 ml
       botol volumetric,
   2. Panaskan sampai T = 150oC selama 1 jam, setelah mendidih
       (turunkan suhu pada awal terjadinya pembuihan dan
       dikocok sambil digoyang untuk beberapa waktu),
   3. Kemudian disaring dalam filter glass crucible ( W2) dan cuci
       dengan aceton ( 1 kali saja) dan disusul dengan air panas
       sampai tidak berwarna,

                                4
                        Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB


4. Crucible dan isinya di oven pada T = 105oC selama 24 jam
    dan didinginkan dalam desikator dan timbang ( W3),
5. Crucible dan isinya ditempatkan dalam beaker glass dan
    tambahkan H2SO4 72% secukupnya sampai setengah dari
    volume crucible dan didiamkan selama 3-4 jam,
6. Gunakan vacum pump untuk membilas / menyedot dan
    setelah bersih dibilas dengan air panas sampai tidak asam (
    tidak berwarna dan tidak berbuih),
7. Crucible dan isi dioven pada T = 105oC selama 24 jam,
    dinginkan dan timbang ( W4), sedangkan isinya diabukan
    pada T = 500oC untuk waktu 4-5 jam, dinginkan dan
    timbang ( W5 ).

PERHITUNGAN :


       ADF ( % ) = ( W3 – W2) X 100
                      W1

       ADL (%) = (W4 – W5) X 100
                   W1


Keterangan :
     ADF : Acid Detergent Fiber
     ADL : Acid Detergent Lignin
     W : Weight (g)




                             5
                            Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB


                  ANALISIS POLYPHENOLIC
                   (Kode : 0040207302)

1. RUANG LINGKUP
    Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang
    akan mengukur kualitas bahan organik menggunakan parameter
    konsentrasi polyphenolic.

2. ALAT dan BAHAN
    a. Bahan Pereaksi
    1. Methanol 50 %
        Larutkan 101.01 ml methanol 99% dalam 200 ml aquadest.
    2. Sodium Carbonat ( Na2CO3 17%)
        25.5 g Na2CO3 dalam 124.5 ml aquadest dilarutkan dalam
        beaker glass.
    3. Sodium tungstate ( Na2WO4)
    4. Asam orthophosphoric.
    5. Asam phosphomolybdic.
    6. Asam tannic.
    7. Reagent Folin-Denis
        25g sodium tungstate + 5 g asam phosphomolybdic dan 12.5
        asam orthophosphoric dimasukkan ke dalam 250 ml botol
        volumetrik yang berisi 187.5 ml aquadest. Kemudian di
        reflux selama 2 jam dan diencerkan untuk 250 ml dengan
        menggunakan aquadest.

3. REFERENSI
    Prosedur Layanan Analisa Laboratorium, Panduan Analisa
    Biologi Tanah.

4. DEFINISI
     -

5. URAIAN PROSEDUR
    Membuat Standart
    1. Siapkan 0,1 mg/ml asam tannic.
    2. Larutkan 0.01 g asam tannic dalam 100 ml botol volumetrik
       dengan aquadest.
    3. Pipet 0,1,2,3,4,5 dan 6 ml dari 0.1 mg/ml asam tannic
       dimasukkan dalam 50 ml cuvet yang berisi 20 ml aquadest.



                                 6
                        Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB


4. Tambahkan 2.5 ml reagent Folin- Denis dan 10 ml Na2CO3
   17% dan kemudian dibaca dengan spectrophotometer,
   absorbance 760 nm.

Cara Kerja :
1. Timbang 0.75 g contoh tanaman dan diekstrak dengan 20
   ml methanol 50% dalam beaker glass 100 ml kemudian
   tutup dengan para film atau aluminium foil.
2. Didihkan dalam water bath pada T = 70-80oC selama 1 jam
   dan hasil ekstraksi disaring dengan kertas saring
   (Whatman No. 42) dan dibilas dengan menggunakan
   methanol 50 % kemudian diencerkan sampai 50 ml dalam
   botol volumetrik ( konsentrasi = 15 mg/ ml ).
3. Pipet 1 ml hasil ekstraksi ke dalam cuvet 50 ml dan
   tambahkan 20 ml aquadest, 2.5 ml reagent Folin Dennis
   dan 10 ml Na2CO3 ( sodium carbonat 17%), kemudian
   encerkan sampai 50 ml dengan menggunakan aquadest dan
   diamkan selama 20 menit.
4. Baca dengan menggunakan Spectrophotometer, absorbance
   760 nm.

Perhitungan :

1. Carilah persamaan regresi dari larutan standart.
2. Tentukan TAE sampel dan TAE blanko (X) berdasarkan
   persamaan regresi diatas.




Keterangan :

TEP : Total Extractable polyphenols (mg)
TAE : Tannic Acid Equivalent (mg)
 W : weight of sample (g)




                             7
                                Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB


Tabel Pengamatan :
A. Tabel Pengamatan
       X            Y               XY             X2             Y2
       0
      0.1
      0.2
      0.3
      0.4
      0.5
      0.6
      ∑=


   Catatan : X = konsentrasi larutan standart (mg/ml), Y = absorbance

          Sampel                 Y bacaan                TAE sampel
            0
            1
            2
            3
            4
            5
            6
            7
            8
            9




                                         8
                            Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB


              FRAKSIONASI BAHAN ORGANIK TANAH
                         METODE POM
                     (Kode : 0040207303)



1. RUANG LINGKUP
    Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang
    akan mempelajari dinamika karbon dalam tanah, melalui
    pemisahan partikel bahan organik tanah berdasarkan distribusi
    ukuran partikel dengan menggunakan Metode POM (Particulate
    Organic Matter)

2. ALAT dan BAHAN
   1. Satu set ayakan basah : ukuran kasa 2 mm, 250 μm,             150
      μm dan 50 μm.
   2. Tanah segar.
   3. Na hexametaphosphate (hanya untuk tanah liat).

3. REFERENSI
    Prosedur Layanan Analisa Laboratorium, Panduan Analisa
    Biologi Tanah.

4. DEFINISI
    Fraksi BOT berukuran pasir (5.0 mm – 2.0 mm) biasanya lebih
    labil daripada BOT berukuran liat dan debu (Tiesen dan
    Steward, 1983). Bahan organic tanah yang mempunyai ukuran
    pasir selanjutnya oleh Cambardella dan Elliot (1992) disebut
    dengan bahan organic berukuran partikel (particulate organic
    matter = POM).

    Prinsip penetapan fraksi BOT berdasarkan ukuran partikel
    adalah menentukan jumlah absolute dan proporsi relative C
    dan N dari partikel organic dalam tanah. Metode penetapan
    fraksi POM dari TSBF (Okalebo, 1993) adalah metode yang
    relative cepat, murah dan tidak menimbulkan pencemaran
    lingkungan karena hanya menggunakan air. Klasifikasi ukuran
    partikelnya sedikit berbeda dengan POM dari Cambardella dan
    Elliot (1992); pada teknik dari TSBF POM adalah fraksi BOT
    berukuran 50-250 nm. POM adalah fraksi bahan organic yang
    mudah didekomposisi, oleh karena itu dalam mempelajari
    dinamika C fraksi ini sangat penting untuk ditetapkan.


                                 9
                          Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB


    Mengingat pentingnya fraksi BOT dalam mempelajari dinamika
    C di daerah tropis, maka pemilihan teknik penetapan fraksi
    BOT yang murah dan cepat dengan hasil yang baik sangat
    dibutuhkan.

5. URAIAN PROSEDUR
    1. Ambil 25 g subsample tanah segar kemudian tentukan
       kandungan air tanahnya. Bila tanah yang dimiliki adalah
       tanah kering udara, maka tanah harus dibasahi terlebih
       dahulu pada kapasitas lapang selama 1-2 minggu, kemudian
       tetapkan kadar air tanahnya.
    2. Atur ayakan diatas mesin kocok dengan urutan ayakan 2 mm
       diatas 250 μm, 150 μm, 50 μm, yang terbawah adalah
       penampung.
    3. Timbang 500 g contoh tanah basah (segar) dan letakkan
       pada ayakan ukuran kasa 2mm, pengayakan basah dapat
       dimulai.
    4. Setelah 20 menit ambil semua partikel yang terdapat pada
       ayakan 2 mm, 250 μm, 150 μm, dan 50 μm secara terpisah.
    5. Keringkan masing-masing fraksi tersebut dalam oven pada
       suhu 650C selama 24 jam, timbang berat keringnya dan
       tetapkan kandungan C dan N nya.
    6. Tetapkan juga total C dan N dari total tanah.




Gambar 1. Skema prosedur fraksionasi bahan organic berdasarkan
             ukuran partikel (Particulate Organic Matter = POM)




                              10
                            Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB


        PENGAMATAN DAN INDENTIFIKASI
MAKROFAUNA TANAH : CACING TANAH DAN RAYAP
             (Kode : 0040207304)

1. RUANG LINGKUP
    Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang
    akan melakukan pengamatan biodiversitas makrofauna (cacing
    tanah dan rayap) masing-masing menggunakan metode monolit
    yang dimodifikasi oleh BGBD (2005) dan metode transek.

2. ALAT dan BAHAN
   Alat yang diperlukan meliputi :
      1. Cetok,
      2. nampan (4 buah),
      3. pinset serangga,
      4. kuas lukis,
      5. bingkai kuadrat dari besi ukuran 25 x 25 x 10 cm,
      6. Frame 50 cm x 50 cm
      7. pensil 2B,
      8. kertas HVS yang telah dipotongi untuk label, dan
      9. Botol film.
   Bahan:
      1. Formalin 4%
      2. Ethanol 70%
      3. Air bersih

3. REFERENSI
    Prosedur Layanan Analisa Laboratorium, Panduan Analisa
    Biologi Tanah.

4. DEFINISI
   Fauna tanah berperanan penting dalam mempertahankan:
   ketersediaan hara (misalnya mikoriza dan rhizobium), porositas
   dan infiltrasi air tanah (misalnya cacing tanah). Dengan
   demikian, laju limpasan permukaan dan erosi bisa dikurangi
   sehingga produktivitas tanah dan tanaman dapat dipertahankan.
   Untuk itu pemahaman akan pentingnya peran fauna tanah dalam
   proses-proses biologi tanah sangat diperlukan.
    Metode monolit untuk pengambilan sampel cacing tanah
    diadopsi dari prosedur ASB ( Swift and Bignell, 2001) yang


                                11
                            Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB


    dimodifikasi (BGBD, 2005). Fungsinya adalah                      untuk
    mengkoleksi cacing tanah dan makroarthropoda.

    Metode standar untuk pengambilan contoh rayap di lapangan
    adalah metode transek semi kuantitatif 100 m X 2 m yang bisa
    disederhanakan menjadi 20 x 2 m. Data yang dihasilkan dari
    pengukuran dengan metode semi kuantitatif transek merupakan
    data kualitatif bukan merupakan nilai mutlak. Namun data ini
    memiliki    tingkat   keakuratan     tinggi.  Metode     transek
    dideskripsikan pertama kali oleh Jones dan Eggleton (2000).


5. URAIAN PROSEDUR
Skema pengambilan contoh makrofauna tanah (cacing tanah dan
rayap) dapat dilihat pada Gambar 2 di bawah ini:




1. Monolith cacing tanah (0.5x0.5 m2)
2. Transek semi kuantitatif untuk pengambilan contoh rayap

Gambar 2. Posisi Pengambilan Sampel Cacing Tanah dan Rayap di
         Lapangan.




                                12
                            Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB


A. Cara Kerja Pengambilan Sampel Cacing Tanah dengan Metode
    Sampling Monolit

    Pada setiap sistem penggunaan lahan ditentukan 4-6 titik
    monolit. Pada hutan ditentukan 4 monolit cacing tanah yakni 1
    monolit berukuran 25 cm x 25 cm x 10 cm dan 3 monolit
    lainnya berukuran 50 cm x 50 cm x 10 cm, sedangkan pada
    lahan pertanian misalnya perkebunan sawit diambil 6 monolit
    masing-masing dengan ukuran 50 cm x 50 cm x 10 cm.
    Pengambilan contoh monolit dilakukan pada lapisan (1)
    seresah, di atas tanah mineral (2) tanah kedalaman 0-10 cm,
    (3) tanah kedalaman 10-20 cm, dan (3) tanah kedalaman 20-30
    cm.


B. Cara Kerja Pemilahan Sampel Cacing Tanah dengan Metode
   Hand Sortir

   1. Lapisan tanah yang diperoleh dari tiap monolit per lapisan
      kedalaman dimasukkan ke dalam nampan.
   2. Setiap cacing yang ditemukan diambil secara manual (hand
      sortir).
   3. Cacing tanah tidak langsung dimasukkan ke dalam ethanol
      70% tetapi terlebih dahulu dimasukkan ke dalam nampan
      yang sudah diisi air. Tujuan perlakukan ini pertama, untuk
      menghilang tanah yang menempel pada tubuhnya. Kedua,
      cacing dimasukkan dalam nampan kedua yang berisi etanol
      70 % untuk relaksasi. Ketiga, cacing dimasukkan dalam
      formalin 4% selama beberapa detik hingga tubuhnya kaku.
      Keempat, cacing tanah siap dimasukkan dalam botol film
      yang berisi ethanol 70 % dan sudah diberi label.

C. Cara Pengambilan Sampel Rayap

    1. Tali sepanjang 20 m ditarik dan dipasang di permukaan
       tanah sebagai garis tengah transek (midline of transect).
       Jaraknya dari sub-plot pengambilan monolit adalah 8
       meter. Pemilihan lokasi untuk transek dilakukan dengan
       mempertimbangkan        jarak   terhadap      monolit,     dan
       kemiringan lahan. Transek diletakkan sejajar kontur.
    2. Transek dibagi dalam 4 seksi berukuran 5 x 2 m
       (selanjutnya disebut seksi 1, seksi 2, seksi 3, seksi 4). Tiap
       seksi dibagi oleh garis tengah transek menjadi 8 sub seksi

                                13
                        Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB


   yaitu S1 kiri dan kanan, S2 kiri dan kanan, S3 kiri dan
   kanan, S4 kiri dan kanan. Satu orang kolektor bekerja di
   satu seksi.
3. Dalam setiap sub seksi digali 6 monolit kecil berukuran 12 x
   12 x 10 cm. Pada lima menit pertama, kolektor menggali
   monolit 1, tanah dimasukkan ke dalam nampan.
   Pengambilan contoh rayap dilakukan secara in situ dengan
   hand sortir.
4. Contoh rayap yang diperoleh, baik dari kasta pekerja
   maupun prajurit, dimasukkan ke tabung film berisi etanol
   70 % dan diberi label. Kolektor diberi waktu 5 menit untuk
   menggali, memilah, memilih dan mengkoleksi contoh ke
   dalam tabung film sekaligus memberikan label. Setelah
   lima menit pertama berlalu, kolektor segera pindah ke
   monolit berikutnya. Sehingga total waktu yang dibutuhkan
   untuk menyelesaikan pengambilan contoh pada 6 monolit
   kecil adalah 30 menit.
5. Selama lima belas menit berikutnya, dilakukan pengambilan
   contoh pada lokasi alam kecil (micro sites) yang
   diperkirakan representatif untuk mendapatkan rayap untuk
   tiap sub seksi, misalnya:
   a. Pada tanah yang terdapat remukan dan sisa-sisa lapukan
      kayu
   b. Posisi samping kayu-kayu mati, tunggul
   c. Pada tanah dengan akumulasi humus yang tebal di
      bawah pohon, dan diantara perakaran.
   d. Disamping sarang rayap, gundukan, dan sarang karton,
      jalan rayap pada pepohonan dan sarang-sarang di atas
      pohon hingga ketinggian 2 m di atas permukaan tanah.




                            14
                            Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB


        PENGAMATAN MIKROORGANISME TANAH
              METODE SLIDE CONTACT
               (Kode : 0040207305)


1. RUANG LINGKUP
    Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang
    akan melakukan pengamatan mikroorganisme dalam tanah
    menggunakan metode slide kontak.

2. ALAT dan BAHAN
    1. Tabung reaksi 25 ml untuk pengenceran,
    2. Gelas slide yang disterilkan dengan api sebelum digunakan.
    3. Larutan Bengal Rose Fenol: larutan 1.0 g Bengal Rose dan
       0.01g CaCl2.2H2O dalam 100 ml akua-fenol 5% .

3. REFERENSI
    Prosedur Layanan Analisa Laboratorium, Iswandi Anas.1989.
    Petunjuk Laboratorium, Biologi Tanah dalam Praktek,
    Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jenderal
    Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas Bioteknologi Institut
    Pertanian Bogor.

4. DEFINISI

   Cara slide kontak adalah pengamatan mikroorganisme tanah
   yang menempel pada gelas slide yang dibenamkan ke dalam
   tanah selama beberapa waktu. Tujuan dari cara slide kontak ini
   adalah untuk mengamati populasi mikroorganisme tanah dalam
   keadaan alami. Pemindahan mikroorganisme ke dalam gelas
   slide   memungkinkan    pengamatan    yang     baik    karena
   menghilangkan kesalahan yang disebabkan oleh adanya partikel
   tanah.

   Pembenaman gelas slide dilakukan secara hati-hati ke dalam
   tanah, untuk mendapatkan sampel mikroorganisme tanah
   dilakukan dengan cara menggosokkan bongkah tanah pada
   permukaan slide tersebut. Bila gelas slide dibenamkan untuk
   beberapa waktu di dalam tanah, kelompok organisme yang
   dapat menempel pada permukaan slide dapat diamati. Bila
   dikerjakan dengan hati-hati seandainya ada pembentukan spora
   maka spora tersebut dapat diusahakan agar tetap utuh.

                                15
                           Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB


   Demikian pula pengamatan terhadap sifat – sifat koloni, bahan
   yang digunakan mikroorganisme sebagai sumber energi dan
   responnya terhadap faktor lingkungan dan sebagainya dapat
   dilakukan.

   Cara ini mempunyai arti yang sangat penting dalam mengamati
   hubungan penyusunan dan morfologi mikroorganisme dalam
   tanah. Pembuatan foto akan sangat berguna dalam
   penyampaian apa yang diperoleh. Dengan memanfaatkan gelas
   slide yang berbeda baik dari segi waktu dan lama inkubasinya,
   maka urutan proses ekologi dari mikroorganisme dapat diamati
   dan dipelajari.

   Metode ini adalah metode kualitatif dan dengan cara ini isolasi
   sukar dilakukan. Koloni berkembang sesuai pada tempatnya
   pada gelas slide. Bila isolasi dan identifikasi lebih lanjut
   dikehendaki, hal ini dapat dilakukan akan tetapi tidak semua
   organisme dapat tumbuh pada media buatan. Pemasukan gelas
   slide ke dalam tanah akan mengubah keadaan alami dengan
   terbentuknya permukaan yang baru untuk kolonisasi, akan
   tetapi pengaruhnya sukar dievaluasi.

5. URAIAN PROSEDUR

   1. Buatlah celah di dalam tanah dengan mengusahakan sedikit
       mungkin gangguan pada tanah. Untuk ini dapat digunakan
       pisau.
   2. Masukkan dengan hati-hati gelas slide dengan arah vertikal,
       sampai tersisa kira-kira 1.5 cm dari permukaan tanah.
       Tekan kembali tanah ke arah gelas slide.
   3. Gelas slide diinkubasi sesuai dengan waktu yang
       dikehendaki, biasanya sekitar 1-3 minggu.
    4. Bersihkan permukaan gelas slide sebelah atas dari tanah,
       kemudian tarik gelas slide dari belahan yang tidak
       terganggu dengan mengangkat gelas slide tersebut secara
       hati-hati.
       Setelah agregat tanah yang menempel pada gelas slide
       dilepaskan, kering udarakan gelas slide tersebut. Dengan
       bantuan aliran air, partikel tanah yang menempel pada
       permukaan tanah yang tidak terganggu dilepaskan dengan
       hati-hati sampai hanya ada lapisan tipis yang tertinggal.
       Bersihkan permukaan gelas slide pada


                               16
                        Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB


    belahan yang terganggu dengan kain basah yang steril.
    Lengketkan mikroorganisme tanah pada gelas slide dengan
    membiarkan gelas slide tersebut kering udara dan panaskan
    di atas nyala api.
5. Tempatkan gelas slide di atas bejana air yang mendidih dan
    basahi selama 6 sampai 10 menit dengan Bengal Rose
    Fenol. Bila perlu tambahkan Bengal Rose Fenol agar gelas
    slide tersebut tidak kering. Buang kelebihan pewarna
    dengan mencuci gelas slide dengan air sampai tidak ada
    pewarna yang tercuci bersama air cucian.
6. Keringkan gelas slide tersebut dan amati gelas slide dengan
    menggunakan mikroskop.




                            17
                            Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB


          ISOLASI MIKROBIA DARI LINGKUNGAN
                 (Kode : 0040207306)


1. RUANG LINGKUP
    Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang
    akan melakukan isolasi mikrobia dari lingkungan.

2. ALAT dan BAHAN
    Alat dan bahan yang diperlukan dalam kegiatan pembuatan
    media dan sterilisasi secara aseptik yakni Erlenmeyer, cawan
    petri, kertas payung, plastik wrapping, kapas, benang kasur,
    autoklaf, Media TPC sebagai media isolat total mikrobia,
    Nutrien Agar (NA) sebagai media isolat bakteri, Potato
    Dextrose Agar (PDA) sebagai media isolat fungi.

    Berikut ini alat dan bahan yang diperlukan untuk sterilisasi
    dengan pembakaran Jarum oose, bunsen, korek api, media
    padat dalam cawan petri (berisi Na/PDA).

    Sedangkan alat dan bahan berikut ini digunakan dalam
    sterilisasi dengan Panas basah Bertekanan Tinggi (autoklaf):
    Media PDA dan NA dalam tabung reaksi, cawan petri steril,
    kertas payung, kapas, benang kasur dan inkubator.

    Alat dan bahan yang diperlukan dalam isolasi mikrobia dari
    lingkungan :
    1. Sampel air rendaman bahan kompos.
    2. Aquades steril dalam erlenmeyer (45 ml)
    3. Aquades steril dalam tabung reaksi (9 ml)
    4. Media Nutrien agar (NA)
    5. Media Potato Dextrose Agar (PDA)
    6. Oose

3. REFERENSI
    Prosedur Layanan Analisa Laboratorium, Panduan Analisa
    Biologi Tanah.

4. DEFINISI
   Mikrobia yang berasal dari lingkungan, berada dalam populasi
   campuran. Mikrobia di alam sangat jarang berada dalam spesies
   tunggal. Dalam bidang bioteknologi, ketersediaan biakan murni
   sangatlah penting. Selain itu pemeliharaan kemurnian isolat

                                18
                             Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB


   selama penyimpanan juga sangat perlu mendapatkan perhatian,
   karena berkaitan dengan didapatkannya produk atau metabolit
   tertentu dari suatu spesies tunggal yang hanya dapat dipelajari
   apabila spesies tunggal mikroba terpisah dari populasi
   campuran. Untuk itu perlu dilakukan isolasi/pemisahan untuk
   mendapatkan mikroba biakan murni.

   Untuk melakukan isolasi mikroba alat-alat yang digunakan dalam
   kegiatan di laboratorium harus disterilisasi. Sterilisasi adalah
   suatu usaha atau tindakan untuk membebaskan alat atau media
   dari mikroba. Hal ini diperlukan agar mikroba yang ingin
   ditumbuhkan, diamati dan diisolasi terbebas dari mikroba lain.
   Suatu alat atau bahan dikatakan steril bila alat atau bahan
   terbebas dari mikroba, baik dalam bentuk sel vegetatif maupun
   spora. Dengan kata lain dalam bahan dan alat yang akan
   digunakan tidak didapatkan mikroba yang tidak diharapkan
   kehadirannya, baik yang menggangu atau merusak media.
   Sterilisasi terdiri dari beberapa cara. Pemilihan cara sterilisasi
   ditentukan berdasarkan sifat alat atau bahan yang akan
   disterilisasi dan tujuan sterilisasi.

   Bekerja dengan mikroorganisme membutuhkan teknis aseptis
   untuk mencegah ataupun mengurangi kontaminasi yang tidak
   diinginkan, karena setiap benda yang digunakan maupun pekerja
   dilaboratorium dapat menjadi kontaminasi.

5. URAIAN PROSEDUR
   1. Prosedur umum yang harus diperhatikan dalam teknik aseptis
      yakni :
      a. Disinfektan area kerja. Meja yang akan digunakan terlebih
         dahulu      diberi    disinfektan    untuk    membunuh
         mikroorganisme yang ada.
      b. Jarum oose. Pemindahan mikroorganisme dari kultur cair
         maupun padat ke medium lain membutuhkan jarum oose.
         Sterilisasi dari jarum oose ini dengan cara membakar
         jarum tersebut dengan api bunsen hingga berwarna
         merah. Sterilisasi ini dilakukan sebelum maupun setelah
         jarum digunakan.
      c. Mulut tabung. Sterilisasi pada mulut tabung reaksi atau
         erlenmeyer dapat dilakukan dengan membakar mulut
         tabung setelah tutup kapas dibuka dan sesaat sebelum
         menutup kembali.


                                 19
                         Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB


   d. Cawan petri. Sebelum cawan petri dibuka untuk
      melakukan inokukasi maupun setelah ditutup, tepi cawan
      petri didekat di api bunsen. Selama inokulasi, bagian
      cawan petri yang terbuka, didekatkan ke api bunsen
      untuk mencegah kontaminasi mikroba yang berasal dari
      udara.

2. Prosedur Sterilisasi
   A. Pembuatan Media dengan sterilisasi secara Aseptik
        Cara kerja:
      a) Media TPC, Nutrien Agar dan Potato Dextrose Agar
         ditimbang masing-masing 2 gram.
      b) Masing-masing media dilarutkan dalam aquades 100
         ml.
      c) Dilarutkan sampai mendidih.
      d) Masukkan dalam erlenmeyer dan ditutup dengan
         kapas.
      e) Semua bahan dan alat dimasukkan dalam autoklaf
         selama 15 menit dengan tekanan 1 atmosfir, dan
         dengan suhu 1210C.
   B. Sterilisasi dengan pembakaran
        Cara kerja:
      a) Nyalakan lampu bunsen, atur nyala api secara
         maksimal.
      b) Ambil jarum oose, bakar mulai dari bagian pangkal
         kawat oose secara perlahan menuju ujung kawat jarum
         oose. Pembakaran jarum oose ini dilakukan sampai
         kawatnya merah membara.
      c) Goreskan masing-masing jarum oose tersebut pada
         permukaan media padat dalam cawan petri.
      d) Inkubasi media tersebut pada 300C selam 48 jam.
      e) Amati mikroba yang tumbuh.
   C. Sterilisasi dengan Panas Basah Bertekanan Tinggi
      (autoklaf)
        Cara Kerja:
      1. Tutup tabung reaksi yang berisi media dengan kapas,
            beberapa tabung diikat jadi satu dan bagian tutupnya
            dibungkus dengan kertas payung. Sisakan satu tabung
            untuk tidak disterilkan.
      2. Isi autoklaf dengan aquades sampai permukaan air
            dibawah ansang autoklaf.
      3. Masukkan semua alat dan bahan kedalam autoklaf.


                             20
                         Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB


      4.  Tutup autoklaf dan kencangkan setiap mur pada
          penutupnya sampai kencang.
      5. buka klep pada pengatur tekanan uap air, dan
          biarkan sampai mendidih.
      6. Tutup klep tersebut setelah air mendidih dan media
          disterilkan selama 15 menit pada suhu 1210C dan
          tekanan 1 atmosfir.
      7. Setelah selesai sterilisasi maka matikan autoklaf dan
          tunggu sampai dingin.
      8. Buka autoklaf dan tunggu sampai media agak dingin
          (450C).
      9. Tuangkan media (PDA dan NA) pada cawan petri
          steril.
      10. Inkubasi media tersebut selama 48 jam dengan suhu
          380C.
      11. Amati pertumbuhan mikroba.

3. Isolasi Mikrobia dari Lingkungan
   Teknik isolasi/pemisahan dilakukan dengan berbagai cara,
   antara lain: melakukan pengenceran berseri dilanjutkan
   dengan mebiakkan pada media yang sesuai yaitu dengan
   metode cawan tung (pour plate) dan cawan gores (streak
   plate)
   Cara Kerja :
     1. Pembuatan Seri Pengenceran
          Bahan yang akan dijadikan sebagai bahan pembuatan
          isolat merupakan air rendaman yang berasal dari
          bahan kompos kampus yang telah diinkubasi kemudian
          direndam selama 7 hari, diambil sebanyak 5 ml
          kemudian secara aseptis masukkan ke dalam 45 ml
          aquades steril. Kemudian dilakukan homogenitas
          dengan memvortek sampel. Sampel yang telah
          homogen ini disebut dengan pengenceran 10 -1. Dari
          sampel ini diambil 0,1 ml dan dimasukkan kedalam
          cawan Petri steril dan ditambahkan dengan media yang
          sesuai. Dari pengenceran 10-1 diambil 1 ml dan secara
          aseptis dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi
          9 ml aquades steril dan dihomogenasi dengan vortek.
          Pengenceran ini disebut dengan pengenceran 10 -2. Dari
          pengenceran ini diambil 1 ml sampel untuk dimasukkan
          pada tabung reaksi berisi aquades berikutnya. Dan
          0,1ml dimasukkan kedalam cawan petri steril. Dengan


                             21
                    Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB


    cara yang sama akan didapatkan pengenceran 10-3 dan
    seterusnya sampai pada pengenceran 10-6.

2. Metode Cawan Tuang (pour plate)
    Masing –masing pengenceran berseri tersebut, diambil
    0,1 ml sampel dan dimasukkan dalam cawan petri
    steril. Untuk mengisolasi bakteri maka ditambahkan
    dengan media Nutrien Agar, sedangkan untuk
    mengisolasi jamur ditambahkan media Potato Dextrose
    Agar. Inkubasi dilakukan pada suhu kamar, untuk
    bakteri selama 24 jam sedangkan untuk jamur
    dilakukan inkubasi selama 3 x 24 jam.

3. Metode Cawan Gores (steak plate)
    Media Nutrien Agar dan Potato Dextrose agar
    dituangkan secara aseptis kedalam cawan petri steril.
    Biarkan memadat. Setelah media memadat, sampel
    dari pengenceran berseri diambil dengan menggunakan
    oose dan dilakukan teknik penggoresan. Sampel yang
    digores cukup satu oose. Sebelum berpindah dari satu
    kuadran ke kuadran berikutnya oose disterilkan
    terlebih dahulu, selanjutnya penggoresan dilanjutkan
    kembali .
    Dua metode ini dilakukan secara bergantian agar dapat
    diketahui metode mana yang dapat menghasikan
    banyak bakteri.

4. Penyimpanan Biakan Murni
     Biakan murni (isolat) yang diperoleh dari tiga tahap,
     selanjutnya dapat disimpan pada jangka waktu yang
     lama, dengan cara memindahkan kedalam media agar
     miring (slant agar) yang mengandung media yang
     sesuai (Nutrien agar atau Potato Dextrose agar).




                        22

								
To top