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									  Chapter 6
Microbial growth


                   1
I. The requirements for growth

   可分物理因子及化學因子.
   物理 : temp, pH, 滲透壓.
   化學 : 水, C 源, N 源, 礦物質, O2 & 有機生
    長因子.




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    I-1. Physical requirements
     I-1-1. Temperature
   微生物依生長喜好溫度分 : 嗜冷菌
    (psychrophiles), 嗜中溫菌(mesophiles), 嗜
    高溫菌(thermophiles). 最大生長及最低生
    長temp. 之 range : 30oC.
   Minimum growth temp., optimum growth
    temp., maximum growth temp.
                                 Fig. 6.1

                                 Fig. 6.2

                                 Fig. 6.3

                                            3
                        50-60oC
                                  80oC or 80oC 
             25-40oC

                                  (hyperthermophiles)




Endospore
Organic compost piles

                                                 4
腐敗 : 長黴, 表面產生黏液,
     異味 or 奇怪顏色.




病原菌最適溫 : 37oC


                5
6
     I-1-2. pH
   最適範圍 : pH 6.5-7.5. 少數pH 4(如sauerkraut,
    pickles, cheeses)
   Acidophiles : 耐酸如煤礦區水中之chemoautotrophic
    bacteria, 能氧化 S  H2SO4, pH 1 下存活.
   Molds & yeasts : pH 5-6.
   pH 調至鹼性, 可抑制微生物生長.
   為防pH range變化過大, 可用chemical buffers調節.
    peptones & A.A., phosphate salts(不具毒性可供微生物
    生長所需之磷元素), 具buffer 功能.


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    I-1-3. Osmotic pressure

   Hypertonic sol’n : plasmolysis, 細胞質萎縮.
    如醃魚及濃縮加糖牛乳汁.                         Fig. 6.4
   Extreme halophiles : obligate halophiles,
    如 Dead Sea 中之微生物.
   Facultative halophiles.
   微生物生長之固態media : 1.5% agar.
   Hyoptonic sol’n : 漲破.


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9
    I-2. Chemical requirements
    1-2-1. Carbon

   生物體之結構骨架
   可合成有機物質
   化學異營菌 : 由能量獲得 C 源, 如 proteins,
    carbohydrates, lipids.
   化學自營菌 & 光合自營菌 : 由CO2獲得 C 源.




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    I-2-2. Nitrogen, sulfur & phosphorus
   Proteins : 大量 N 源, 少數 S.
   DNA, RNA & ATP : N & P.
   N : 佔cell 乾重 14%, S & P : 4%.
   N 源 : NH4+, NO3-, N2(cyanobacteria)
   Nitrogen fixation, symbiosis.
   共生固氮微生物 : Rizobium & Bradyrhizobium.




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   S : 硫蛋白質 & 維生素合成.
   S 源 : SO42-, H2S & 含 S 之 A.A.
   P : 核酸 & cell membrane 之phospholipid,
        ATP.
   P 源 : PO34-
   Ca, Mg & Ca : cofactor



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I-2-3. Trace elements

   Fe, Cu, Mo & Zn : cofactors




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        I-2-4. Oxygen
    Obligate aerobes      Table 6.1a
    Facultative aerobes     Table 6.1b
    Obligate anaerobes : Clostridium  tetanus & botulism.
    Toxitive oxygen :                     Table 6.1c
  1. Singlet oxygen : 存在於phagocytic cells.
    2. Superoxide free radical (O2-) :

         -     -          SOD
      O2 + O2 +      2H+              H2O2 + O2


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15
3. Peroxide anion (O2-2) :

    2 H2O2   catalase   2 H2O + O2

    H2O2 + 2H+     peroxidase   2 H2O

4. Hydroxy radical (OH) : 最具活性, 於細胞質中
   藉ionizing radiation 產生.

   Aerotolerant anaerobes : lactobacilli   Table 6.1d
   Microaerophiles Table 6.1e
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I-2-5. Organic growth factors

   Organic growth factors : 生物所合成之必
    需有機化合物, 直接由環境中獲得. 如
    vitamins(coenzymes)
   包括 : A.A., purines & pyrimidines.




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    II. Culture media
   實驗室中培養微生物所調配之營養物質稱
    culture medium, 於接種前須為無菌的.
   能於medium內or上方生長&繁殖之微生物
    稱culture.
   固態medium : agar (由seaweed所分離之一
    種複合多醣)
   Agar medium置於test tubes or petri dishes
    中培育. 固化於tube成某角度, 稱斜面(slants);
    固化為垂直方式, 稱深層(deep).

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II-1. Chemically defined media
  Table 6.2 & Table 6.2




                                 19
20
    II-2. Complex media
   異營菌(細菌 & 真菌)用complex medium
    培養.
   組成含yeast, 肉類 & 植物之抽出液, or
    protein 之分解物質(peptone). Table 6.4
   yeast, 肉類之抽出液含豐富維生素B & 礦
    物質.
   若complex medium 為液態則稱為「營養
    培養液(nutrient broth)」.


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22
II-3. Anaerobic growth media &
      methods

    因厭氧菌因O2存在而死亡, 故需使用特殊
     medium, 稱reducing media. 含sodium
     thioglycolate, 可與media之O2 binding.
    需使用特殊培養罐, 罐中氧氣以含sodium
     bicarbonate & sodium borohydride 之小包
     中加入數ml之H2O, 並將罐鎖緊. 反應可產
     生H2 & CO2, 罐中有palladium(Pd)之催化
     劑, 可將CO2 & H2  H2O . Fig. 6.5


                                            23
24
25
    II-4. Special culture techniques
   如Mycobacterium leprae : 於犰狳(armadillos)
    中生長.
   Syphilis spirochete, obligate intracellular
    bacteria(fickettsias), virus.
   Carbon dioxide incubator, candle jars , CO2
    試劑 : 獲得CO2 Fig. 6.7a & 6.7b
   於較高CO2生長較好之微生物稱「嗜高二氧
    化碳菌(capnophiles)」, 如Campylobacter.

                                             26
27
    II-5. Selective & differential media
  Selective media : 用來抑制所不要微生物之生長, 並
   促進所要分離微生物之生長.
1. 如 bismuth sulfite agar : 分離傷寒菌Salmonella typhi
   [G(-)]所設計. [此media能抑制G(+) & 大部分存於小
   腸之G(-), (S. typi 除外)]
2. Sabouraud’s dextrose agar : pH 5.6, 用於分離真菌之
   media.
3. Brilliant green : 可抑制G(+), 為brilliant green agar
   之成分, 選擇性培養G(-), 如Salmonella.



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  Differential media : 區分長在同一media上之微生
   物菌落.
1. Blood agar : 培養可破壞RBC之微生物, 如
   Streptococcus pyogenes.                       Fig. 6.8
2. Selsective & differential mixture media :
   Staphylococcus aureus, 含7.5% NaCl 之mannitol
   salt agar, pH 指示劑.
3. MacConkey agar : 含bile salts, crystal violet &
   lactose, 抑制G(+)之生長. 分辨Salmonella.
                                           Fig. 6.9

                                                            29
30
31
    II-6. Enrichment culture
   分離存在土壤及糞便中微生物 : enrichment
    culture, 對樣本中族群數量低之微生物而設
    計.
Table 6.5




                                 32
II-7. Obtaining pure culture

   Colony    Fig. 6.9
   獲得純菌種方法 : 平板劃線法(streak plate
    method), 為將滅菌之接種環伸入混合菌之
    培養液中, 取菌液於平板上劃線. Fig. 6.10




                               33
34
    III. Preserving bacterial cultures
   冷藏 : 短期間微生物之保存.
   Deep-freezing(-50oC~-90oC) & lyophilization
    (-54oC~-72oC, 高真空) : 長時間微生物之保存.




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IV. The growth of bacterial cultures
IV-1. Bacterial division
 微生物生長為數目之增加而非體積之增大, 細菌
  以二分裂(binary fission)繁殖.
 分裂步驟 :
                                    Fig. 6.11
 1. cell 增長及染色體DNA之複製.
 2. cell wall & cell membrane由複製之兩染
    色體DNA中間開始向內生長.
 3. 生長之cell wall相接, 形成 cross-walls.
 4. 形成兩個與親代完全一樣之cell.
 少數細菌行出芽(budding)繁殖.



                                                36
37
IV-2. Generation time

   細胞分裂 : 2n.          Fig. 6.12
   Generation time : cell 分裂所需之時間, 可
    因菌種 & 外在環境之不同而不同.
   大多數為 1~3 hr. E. coli : 20 min.




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39
IV-3. Logarithmic representation
      of bacterial population

   Fig. 6.13




                                   40
IV-4. Phase of growth

Fig. 6.14




                        41
    VI-4-1. The lag phase
   接種初期, 菌數並未增加 or 只增加很少之
    階段稱「遲滯期(lag phase)」.
   微生物並非蟄伏其體內正密集涉及DNA &
    enzyme 合成之代謝反應.




                             42
     VI-4-2. The log phase
   當細胞開始分裂, 即進入log phase or exponential
    growth phase.
   Cell 之複製於此期具最高活性, generation time於
    此期最小. 最適工業生產.
   此期cell對不良環境敏感, 如radiation & 抑菌物質
    (penicillin).




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    IV-4-3. The stationary phase
   此期微生物生長速率下降死去之cell相當
    於新合成之cell, 兩者維持一balance
   存活cell 中之代謝速率下降, 此一balance
    狀態稱 stationary phase.




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    IV-4-4. The death phase

   若cell死亡之速率 > 生成速率, 則cell 進入
    death phase or logarithmic decline phase.

              Chapter 7 將探討微生物之死亡




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IV-5. Direct measurement of
      microbial growth
 Cell 數目常以容量(ml) or 重量(g)單位中之
  數量表示.
 Serial dilutions

 10-6ml 酸乳發現70個細菌 7 x 107 cells/ml




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    IV-5-1. Plate counts
   最常用之測量方法
   優點 : 所測量之數目為活菌數
   缺點 : 耗時
   根據三個假說 : 每一個cell均能生長分裂而
    形成single colony, 原始之接種是均質的,
    且未有凝集cell存在.
   為確保平板上之菌數能落於同一平板, 以
    serial dilution處理sample. Fig. 6.15

                                         47
48
 Pour plate method     Fig. 6.16a

 Spread plate method   Fig. 6.16b




                                     49
50
    IV-5-2. Filtration
   若sample中之菌數非常低, 如湖中or泉水
    中之菌數, 此時可用filtration計數之. Fig. 6.17
   100ml sample  thin membrane filter 
    solid media  culture
   常用於食品 or 水中coliforms 之測定.




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52
    IV-5-3. The most probable number
            method(MPN)
   依據統計原理.
   適用於無法於solid media 中生長之微生物
    培養(如化學自營硝化微生物).
   亦適用於利用液態鑑別培養基鑑定微生物
    (如水樣中能發酵乳糖產酸之coliforms).
   MPN 為統計方法, 為有95%之機會微生物
    會落於某個菌數範圍, 而MPN所指即為該
    最確數.                  Fig. 6.18


                                      53
54
    IV-5-4. Direct microscopic count
 菌液  slide  microscopy 觀察
 計數牛乳中細菌 : Breed count method,
  0.01 ml sample  1 cm2 slide  oil immersion
  objective lens 觀察
 Petroff-Hausser cell counter : 直接顯微鏡術 Fig. 6.19
 1. Slide 中有一定容量之淺凹槽, 蓋玻片覆蓋其上.
 2. Sample 加入該槽中.
 3. 算方格之菌數並求得平均值後乘上一常數,即得
    每ml中之菌數.
缺點 : 具移動力之菌種很難計數之, 無法辨別死菌 &
       活菌, sample中需含高濃度之菌量(約107/ml).
優點 : 菌種不需培養, 若時間為最大考慮, 則此方法常
       被使用.
 Electronic cell counters : 亦具同樣省時之優點.         55
56
IV-5-5. Estimating bacterial numbers by
        indirect methods
IV-5-5(1). Turbidity

     測量之儀器為光譜儀(spectrophometer) or
      比色計(colorimeter)
     Photoelectric cell  Fig. 6.20
     Percentage of transmission
     Absorbance, optical density(OD)
     濁度測量, sample至少要有106/ml菌數.



                                     57
58
    IV-5-5(2). Metabolic activity
   間接方法
   假設某些代謝產物如酸 & CO2 產生之量與
    菌數有直接之相關性.
   原理 : 利用微生物分析法(microbiological
    assay), 藉由酸產生評估vitamin於sample中
    之含量.




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IV-5-5(3). Dry weight

   用於絲狀微生物如黴菌之測量
   方法 : 將真菌由培養液中移出, 過濾多餘物
    質, 置入稱重瓶及玻璃乾燥器中乾燥.
   細菌乾重之測量亦採同樣步驟, 一般用離
    心法(centrifugation)將菌體離心下來.




           ~ The end !! ~
                             60

								
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