IDENTIFICACI�N YM EDICI�N DE LA RESPUESTA INMUNE

							IDENTIFICACIÓN Y MEDICIÓN
 DE LA RESPUESTA INMUNE
  RESPUESTA INMUNE HUMORAL

SEROLOGÍA
  suero     estudio

          “Ciencia de la detección de anticuerpos”



Medición de las interacciones Ag - Ac, con fines
 diagnósticos, a partir del suero de un animal.
Sensibilidad

Capacidad de una prueba para detectar animales “enfermos”
(VERDADEROS POSITIVOS) en una población “enferma”.

Ejs. BPA-ELISA-WESTERN BLOTTING-INMUNOFLUORESCENCIA



Especificidad

Capacidad de una prueba para detectar animales “sanos”
(VERDADEROS NEGATIVOS) en una población “sana”.

Ejs. IDGA- WESTERN BLOTTING
                        Animal

             ENFERMO            SANO

         +      Positivo      Falso positivo
               verdadero
Prueba




         -   Falso negativo     Negativo
                               verdadero
CLASIFICACIÓN DE PRUEBAS PARA MEDIR LA RESPUESTA INMUNE
HUMORAL




1. PRIMARIAS      Miden la cantidad de complejo Ag-Ac formado


                  Miden las consecuencias de la unión Ag-Ac in
2. SECUNDARIAS
                  vitro


3. TERCIARIAS     Miden las consecuencias o el efecto
                  protector de anticuerpos en el animal (in
                  vivo)
        Evolución de los anticuerpos contra Brucella abortus

      1800
      1600
      1400                       Ig M
      1200                                                                                                                   Post-infección
      1000
       800
                                                                                                                               Natural
       600                                                                       Ig G
       400
       200
         0
             0   30   60   90           0         0     0      0      0      0           0           0           0
                                      12        15    18     21     24     27          30          33          36



                           1800
                           1600
                           1400
                           1200
                                                                   Ig M
Post- Vacunación           1000
B. abortus cepa 19              800
                                600
                                400
                                200
                                                            Ig G
                                  0
                                            0    15   30     45    60     75      90           5           0       5     0       5     0
                                                                                             10          12      13    15      16    18
          Respuesta inmune humoral
               Brucella abortus

Isotipo   Cantidad    Presencia      Características

IgM       Abundante   Temporaria     Inespecífica ?
IgG1      Abundante   Continua       Específica
IgG2      Escasa      Discontinua    Específica
IgA       Abundante   Discontinua    Específica
         APLICACIONES EN R. A.
        BRUCELOSIS BOVINA
          Resolución 438/2006 del SENASA.


                                     Prueba
TAMIZ                           BPA – ELISA I

COMPLEMENTARIAS              SAT + 2-ME – FPA
                                    ELISA C
DEFINITORIA                           FC

VIGILANCIA                      PAL - ELISA I
EPIDEMIOLÓGICA
PRUEBAS INMUNOENZIMÁTICAS

ELISA


Fundamento: visualización de la cantidad de Ag-Ac formado a
través de marcadores ligados a enzimas, que en presencia del
sustrato específico, producen una reacción colorimétrica.



        ENZIMAS UTILIZADAS           SUSTRATO
        • PEROXIDASA                  • ortofenildiamina
        • Fosfatasa alcalina          • paranitrofenilfosfato
                  ELISA
               Tipos de pruebas




INDIRECTA       SANDWICH          COMPETICIÓN



detección de     detección de       detección de
ANTICUERPO        ANTÍGENO          ANTICUERPO
                             ELISA INDIRECTO




              Lavado              Lavado              Lavado

ANTÍGENO                 Suero         ANTIGLOBULINA
adsorbido              PROBLEMA          marcada con           SUSTRATO de la
 (reactivo)                            ENZIMA (reactivo)       enzima (reactivo)




Detección de ANTICUERPOS                                   CAMBIO DE COLOR
                     ELISA COMPETICIÓN
                                                                       COLOR
N
E
G
A
T
I          Lavado          Lavado           Lavado           Lavado
V
O
                     Suero             Ac             Conj. con    Sustrato
    Antígeno        Problema        monoclonal         enzima     cromógeno
                                                     peroxidasa
P
O
S
I                      Y                Y               Y               Y
T
I          Lavado              Lavado       Lavado            Lavado
V
O
                                                     AUSENCIA DE COLOR
                     VENTAJAS                               DESVENTAJAS

             Alta sensibilidad y especificidad
  ELISA
                                                      Costo microplacas
             Rápido
             Reactivos estables                      Costo equipo automatización
             Resultado visual




                        APLICACIONES EN VETERINARIA


 Brucelosis           Bia                  Babesia              Cuantificación de
                                                                   inmunoglobulinas
 IBR                  Leucemia felina      Trichinella
 BVD                  Salmonella           Toxoplasma
 Peste porcina        Aftosa               Toxocara
 Aujesky              Estreptococos        Hormonas
 Newcastle            TBC                  Micotoxinas
PRUEBAS SECUNDARIAS
 La prueba a realizar depende de las
 características del Ag


 SOLUBLE            PRECIPITACIÓN



 PARTICULADO             AGLUTINACIÓN



 SUPERFICIE + COMPLEMENTO           FIJACIÓN DE
                                     COMPLEMENTO
  Comparación precipitación - aglutinación



Antígeno                   Anticuerpo                    Antígeno
SOLUBLE                                                PARTICULADO




     Formación de “retículo”            “Amontonamiento”


           PRECIPITACIÓN                AGLUTINACIÓN
                AGLUTINACIÓN

   Fundamento: un antígeno particulado (ejemplo:
bacterias, eritrocitos), al ser puesto en contacto con su
anticuerpo específico en proporciones óptimas, se une
por medio de enlaces cruzados. Este complejo de unión
  agruma, produciendo una reacción de aglutinación.
FENÓMENO DE ZONA O PROZONA



  Se produce cuando existe un marcado exceso de Ac con
respecto a los determinantes antigénicos de la partícula, de
tal manera que es poco probable que los dos sitios de unión
 de la Ig puedan unirse a dos determinantes antigénicos de
   dos partículas distintas, inhibiéndose de este modo la
aglutinación. Generalmente ocurre en las diluciones bajas de
                   sueros muy positivos.
                                                     Y
                                Proporción
                 YY
              + YY Y                            Y
 Antígeno
particulado    Suero problema                AGLUTINACIÓN
 (reactivo)
                                  Medio
                     AGLUTINACIÓN


         En PLACA                           En TUBO



Salmonella Brucella Micoplasma              Brucella



            BPA
                                 SAT+2-ME              PAL
            Aglutinación en placa: BPA
             Prueba del Antígeno Brucélico Acidificado



                            1. Suero problema   2. Antígeno específico
                                                       (reactivo)




Aglutinoscopio + placa de
         vidrio
             8 MINUTOS



3. Mezclar                           LECTURA E
                                  INTERPRETACIÓN


                          Con GRUMOS      Sin GRUMOS




                  AGLUTINACIÓN POSITIVA      Negativa
Aglutinación en tubo: SAT + 2-ME


   SAT (Seroaglutinación en Tubo)



                                      Se realizan en
       Ig M                    Ig G   simultáneo




   2- ME (2- Mercaptoetanol)
    En TUBO: SAT + 2- ME

                    2. Solución fisiológica fenicada (SFF)

1. Suero problema        3. Antígeno


                                                                              60 MINUTOS
 SUERO
 BPA (+)                                                                       SAT


               1/25          1/50           1/100            1/200   Título    37ºC-48 hs




                                                                               2-ME
2. Solución 2-ME
                  LECTURA e INTERPRETACIÓN




37ºC-48 hs




             POSITIVA     INCOMPLETA     NEGATIVA
      FIJACIÓN DE COMPLEMENTO


Fundamento: la activación (“fijación”) del complemento
por el anticuerpo unido al antígeno hace que se generen
complejos de ataque de membrana. Si el anticuerpo se
une a eritrocitos, éstos se destruyen y sobreviene
hemólisis.
         FIJACIÓN DE COMPLEMENTO
                        2 sistemas

   Sistema de PRUEBA                 Sistema INDICADOR


• Suero problema              • Eritrocitos
• Antígeno específico
                              • Hemolisina (Ac. anti eritrocitos)
• Complemento
  FIJACIÓN DE COMPLEMENTO

                                                         SIN
     Antígeno                       Eritrocitos
                                                      HEMÓLISIS

Y YY                   C
                                      Y               POSITIVO
Suero problema     Complemento   Ac antieritrocitos



                                                         Con
                                                       HEMÓLISIS

       -              C                   Y
  Suero problema
                                                       Negativo
APLICACIONES EN VETERINARIA

 BRUCELOSIS
  IBR
  DVB
  AFTOSA
  MOQUILLO CANINO
  TOXOPLASMOSIS
 POLARIZACIÓN FLUORESCENTE
            (FPA)
 Fundamento:
Se produce in vitro una reacción antígeno-anticuerpo,
  enfrentando el suero de un animal enfermo de
  brucelosis con una fracción de del antígeno de
  bruecella (cadena O), este complejo forma una masa
  grande que en suspensión gira mas lentamente .
  Además ese antígeno se conjuga con isotiocianato de
  fluoresceína (IFTC) y se hacen incidir distintos haces
  de luz. El complejo emitirá luz con distintos grados
  de despolarización en función de su velocidad de
  rotación.
         Aglutinación en tubo: PAL
     PRUEBA DEL ANILLO EN LECHE


 Fundamento: si en una muestra de leche se encuentra
  un anticuerpo específico, y se le agrega un antígeno
 particulado coloreado, ambos se unirán, formando un
complejo Ag-Ac que se adhiere a los glóbulos de grasa y
                 asciende con la nata
PAL


               2. Antígeno (reactivo)

1. Leche problema


                            LECTURA e INTERPRETACIÓN


      37ºC-1 hora




                                +       ++   +++   ++++
PRUEBAS MOLECULARES


        REACCION EN CADENA DE LA
              POLIMERASA




               HIBRIDOMA
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
               (PCR)

   Multiplicación de una secuencia de ADN
   específica y conservada de la especie a
    identificar, que puede ser visualizada y
                 cuantificada
   NUCLÉOTIDO


                   Base nitrogenada
Fosfato


          Azúcar
   ADN


                          AZÚCAR




                          FOSFATO




CADENA DE AZÚCAR
Y FOSFATO
                   BASE
   ADN


 OLIGONUCLEÓTIDOS (PRIMERS)

                A   T
 NUCLEÓTIDOS
                G   C


 POLIMERASA
             Polimerasa

             Primers



Primers
Polimerasa
                      ADN
100
                  Desnaturalización                 94º C
90                                                  1 min


80                                        Primers

      Extensión                                     72º C
70                                                  1 min
                      35 ciclos
60
                                      Hibridación   56º C

50                                                  1 min


40                  Polimerasa
30
                       dNTP
20
      Detección
Producto de PCR para identificar Brucella spp en
muestras de leche
Producto de PCR para caracterizar cepas de
   Brucella abortus en muestras de leche
                                                                       n=223
  ID            PCR           Cultivo    FC        ELISA-C   ELISA-I
  11       B. abortus silv.     -         +           +         +
  17       B. abortus silv.     -         +           +         +
  33       B. abortus silv.     -         +           +         +
  58       B. abortus silv.     -         +           +         +
  61       B. abortus silv.     -         +           +         +
 113       B. abortus silv.     -         +           +         +
 168       B. abortus silv.     -         +           +         +
 172    37 % con B. abortus silvestre se +
           B. abortus silv.     -         infectó con RB51
                                                      +         +
 189       B. abortus sanas se infectó con B. abortus +
        0,8 % de lassilv.       -         +           RB51      +
 242       B. abortus silv.   (p<0,0001) +
                                -                     +         +
 255       B. abortus silv.     -         +           +         +
1487       B. abortus silv.     -         +           +         +
 151   B. abortus silv – RB51   -         +           +         +
 157   B. abortus silv – RB51   +         +           +         +
 179   B. abortus silv – RB51   -         +           +         +
 228   B. abortus silv – RB51   -         +           +         +
 260   B. abortus silv – RB51   -         +           +         +
1380   B. abortus silv – RB51   -         +           +         +
 124    B. abortus RB51         -         -           -         -
Tipos de
PCR
   CON PRIMERS ANIDADOS

   ASIMÉTRICA

   INVERSA

   MULTIPLEX

   NESTED
VENTAJAS

   FIDELIDAD

   SENSIBILIDAD

   ESPECIFICIDAD

   AUTOMATIZACIÓN
    APLICACIONES

   Diagnóstico (virales- bacterianas- parasitarias- micóticas)

   Enfermedades hereditarias

   Enfermedades autoinmunes

   OncologÍa

   Medicina forense

   Arqueología
HIBRIDOMA
Selección
in vitro
en el medio
HAT