WESTERN BLOT ALL V11 by 90Eo8VzF

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									      Molekulare Diagnostik




                   WESTERN BLOT
                   http://www.wiley.co.uk/reecegenes/animations.html
                   Ist die Bezeichnung für eine Methode,
                   bei der elektrophoretisch aufgetrennte
                   Proteine aus einem Trenngel auf ein
                   Trägermaterial übertragen werden um
                   dann z.B. mittels Antikörper nachgewiesen
                   zu werden.




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              „Although gel electrophoresis
                   is a relatively simple
                technique, it is not a trivial
                        procedure.“
                            David E. Garfin, Electrophoretic Methods


             (even more true for blotting...)

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               Nachweis von Proteinen aus

              •     Blut (z.B. Virusinfektion, Schwangerschaftstest)
              •     Zellen
              •     Geweben
              •     Harn ( Blasenentzündung)
              •     Lebensmittel (Toxine)




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                                               Übersicht
          1. Probenvorbereitung
          2. Elektrophorese
          3. Blotting
          4. Nachweis
                 4.1 Blockierung
                 4.2 Bindung primärer Antikörper
                 4.3 Waschschritte
                 4.4 Bindung sekundärer Antikörper
                 4.5 Waschschritte
                 4.6 Substratreaktion
          5. Kontrollen
          6. Weitere Tipps
          Anhang
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                                         Probenvorbereitung

       • Bestimmung der Proteinmenge mittels verschiedener
         Messmethoden möglich

                      1.) Bradford
                      2.) Biuret
                      3.) Christian Warburg (photometrische
                      Differenzmessung)




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                    Bradford (Comassie Blue)
       •     Triphenylfarbstoff
                  Absorptionsmax 465 nm (Rot)
       •     WW mit Protein in saurer Lösung
                  Absmax shiftet zu 595 nm (Blau):
                  Farbänderung durch Stabilisierung des Farbstoff-Anions mittels
                  hydrophober und ionischer WW mit dem Protein
       •     Farbstoff reagiert mit
                  Arginin!!!
                      Histidin, Lysin, Tyrosin, Tryptophan, Phenylalanin
       •     Messbereich 0,2-1,5 mg/ml
       •     Ungeeignet für kleine basische Polypeptide
       •     Detergenzien über 0,2 % stören die Messung (NaOH, SDS)
       •     Globulin für Eichgerade geeignet
       •     Nachteil: destruktiv!!!


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                                                               Biuret
    •    Biuret Reagenz enthält CuSO4 in alkalischer Lösung
    •    Cu++ Ionen bilden mit den Peptidbindungen einen blauen Komplex
    •    Messung bei 546 nm
    •    Messbereich 1-10 mg/ml
    •    Nachteil: destruktiv


                                         Warburg-Christian
     •     Proteine zeigen im UV ein Maximum bei 280nm (Tryptophan und Tyrosin)
     •     2. Max. bei 200nm, Peptidbindung und einige AA
     •     Nukleinsäuren zeigen Max. bei 260 nm
     •     Berechnung: 1,55*E (280)-0,76*E(260)=mg/ml
     •     Messbereich 1-10 mg/ml
     •     Vorteil: Proteine werden nicht zerstört und können für weitere Analysen
           verwendet werden.



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                                         Probenvorbereitung
       • (Bestimmung der Proteinmenge)
       • Denaturierung der Proteine
                  1% SDS (Sodiumdodecylsulfat)
                  Harnstoff
                  Mercaptoethanol
                  Dithiothreitol
                  andere SH-Verbindungen
       •     Erhitzen der Proteine (5-10 min auf 95°C)
       •     Einfärben der aufzutragenden Probe mit Comassie Blue
       •     Etwa 15-25 µg Protein/slot auftragen
       •     1µg Protein/Bande damit Bande sichtbar ist!



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                                           Elektrophorese
       • Trägermaterialien
             Papier
             Acetatfolien
             Agarose
             Polyacrylamidgel

       • Polyacrylamidgel (PAGE)
              Wanderungsgeschwindigkeit der Proteine abhängig von:
                     unterschiedlicher Ladung
                     unterschiedlicher Molekulargewichte
                     Porengröße des Gels (6%-15%)


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            SDS (Sodium dodecyl sulfate)
       • Anionisches Detergens

       • Bewirkt folgendes:
             Ladungsunterschiede werden aufgehoben
             Wasserstoffbrücken gespalten
             hydrophobe WW werden aufgehoben
             Aggregatbildungen von Proteinen verhindert
             Polypeptidfäden werden gestreckt
             Proteine aus Untereinheiten werden zu Monomeren

       • Proteine binden SDS in konstantem Verhältnis
              mit Disulfidbrücken: 70-100%
              ohne Disulfidbrücken: 140%


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                                       SDS Gelsysteme
                 Eindimensionale Gele
       •     Einheitliches Gelsystem (kontinuierliches Gel)
       •     Lämmli Gel (diskontinuierliches Gel)
                 Sammelgel zum Konzentrieren der Proben
                 Trenngel
       •     Gradientengele (Porengröße ändert sich linear oder exp)
       •     Mischgele (aus Polyacrylamid und Agarose)

             Zweidimensionale Gele
       • O´Farrell Gele:
             1. Dimension: Auftrennung nach ieP
             2. Dimension: SDS PAGE


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             Kontinuierliches Puffersystem
       • Gleiche Puffer für das ganze Elektrophoresesystem

       • Einheitliches Polyacrylamidgel

       • Nachteil:
             Proben müssen hochkonzentriert sein
             geringe Probenvolumina
             jede Bande ist so breit wie aufgetragene Probenbande




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             Diskontinuierliches Puffersystem

       • Verschiedene Puffer um pH-Gradienten und Spannungsgradienten
         zu erzeugen

       • Stabilisierung der Puffer durch verschiedene
         Polyacrylamidschichten:
              Sammelgel (weitporig, geringvernetzt)

                      Trenngel (engmaschig, Auftrennung der Proteine
                      nach Größe)




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                                                        Trenngel

       • Auftrennung im Trenngel allein nach Größe des Proteins

       • Nicht vergessen: Standard für Eichgerade!!!

       • Achtung: monomeres Acrylamid ist hochgiftig!!!




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                                        Färben der Gele
       • Zur Sichtbarmachung der Proteinbanden
       • Zur Kontrolle ob die Proteine gut gelaufen sind
       • Zur Kontrolle ob gleiche Mengen an Protein aufgetragen wurde.




                                  Entfärben der Gele
        • Damit Gel zum Blotten verwendet werden kann




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                                         Trouble Shooting:
                                          Elektrophorese
       • Prozentigkeit der Gele auf die Proteingröße
         abstimmen, evtl. Gradientengel probieren
               – 7,5 % Gele 40 – 200 kDa
               – 10 % Gele 30 – 100 kDa
               – 12 % Gele 15 – 90 kDa
               – 15 % Gele 10 – 70 kDa
               (Werte für SDS-PAGE)
       • Gellösungen partikelfrei; Salze komplett gelöst
       • Gel luftblasenfrei gießen


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           Trouble Shooting: Elektrophorese
           • Slots vorspülen (Gelbruchstücke/Salze)!
           • Gleiche Gesamtvolumina und möglichst
             gleiche Proteinmengen auftragen
           • Falls möglich Positivkontrolle mitlaufen
             lassen (gereinigtes Protein; positiver Extrakt)
           • Gel nicht zu schnell fahren, sonst smile-Effekt
             (Wärmeentwicklung!)
           • Große Gele kühlen
           • Nach Elektrophorese eine Standardlane mit
             Coomassie anfärben
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                                                           Blotten
       • Übertragung der Proteine von Gel auf Nitrocellulose (PVDF)
             Produktion einer Kopie des Gel, wobei die Proteine auf dem
             Filter immobilisiert werden.
       • Trennmuster bleibt am Filter erhalten
       • Nachdem welches Gel benutzt wurde, Erhaltung der
             Immunreaktivität
             Funktionellen Aktivität (z.B. Enzymaktivität)
       • Nach Transfer mögliche Behandlung der Proteine mit:
             Liganden
             Antikörper
             Enzymsubstraten
       • Präparative Reinigung des Proteins möglich (durch Ablösen von der
             Transfermembran)



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                               Vorteile des Blottens
       •     Qualitative Bestimmung des Proteins
       •     Quantitative Bestimmung des Proteins
       •     Präparative Reinigung
       •     Indentifizierung (z.B. mittels Antikörper: Immunoblotting)
                  direkter Nachweis
                           Enzym konjugierte Antikörper (HRP, ß-Gal..)
                           anders markierte Antikörper (Gold, Biotin,
                           Luminiszenz)
                  indirekter Nachweis
                           ein bereits gebundener, spezif. Antikörper wird
                           durch einen Sekundärantikörper (ebenfalls
                           markiert) nachgewiesen.



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                 Bestimmung der Transfereffizienz

                  – Anfärben des Gels mit Coomassie Blau
                    oder Silber (=> nicht geblottete Proteine)
                  – Anfärben einer Referenzspur der Membran
                    mit
                          • Ponceau S Rot (schnell, aber nicht sehr
                            sensitiv)
                          • Amidoschwarz (2-5fach sensitiver als Ponceau)
                          • India Ink
                          • Coomassieblau (nur für PVDF empfohlen)

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             Protein-Nachweis: Blockierung
    • Blockierungsreagenzien (in TBS oder PBS):
           –    Milchpulver (fettarm, 1 – 5 %)
           –    BSA (3 – 5 %)
           –    Casein (1 - 3% für NC, 0,5 – 1,0 % für PVDF)
           –    Ovalbumin (1 %)
           –    Gelatine (3 %, nur NC)
           –    0,05 – 0,1 % Tween 20 (nur PVDF)
           –    Wenn Antikörper gegen Phosphorelierungen eingesetzt
                werden kein BSA oder Milchpulver verwenden
    • Mind. 0,3 ml Blockierungslösung pro cm² Membran;
      für 1 h bei RT (oder ÜN 4°C)

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                          Bindung primärer Antikörper

       • 0,5 – 10 µg/ml primärer AK in
         Blockierungslösung verdünnen (0,3 ml/cm²
         Membran) – optimale Konzentration des
         AK austesten (Kompromiss zwischen
         Signalstärke und Hintergrund)!
       • 1 (– 2) Stunden inkubieren, je nach
         Affinität und Konzentration des AK


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                                                  Waschschritte
           • Abhängig von der Affinität des AK und
             auch der Spezifität kann/muss mehr
             oder weniger stark gewaschen werden
                  – Polyklonale Seren sind weniger anfällig
                    gegenüber zu starkem Waschen
                  – Monoklonale Seren zeigen weniger
                    Kreuzreaktivitäten




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                 Bindung sekundärer Antikörper

           • Vom Hersteller empfohlene
             Konzentration vom sek. AK in
             Blockierungslösung einsetzen (mind.
             0,3 ml/cm² Membran)
           • 0,5 - 1 Stunde inkubieren




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      Molekulare Diagnostik



                                              Substratreaktion
           • Meerrettich-Peroxidase (HRP)
                  – Sehr schnelle Reaktion; nimmt schnell ab
           • Alkalische Phosphatase (AP)
                  – Reaktion beginnt langsamer, hält dafür
                    länger an; ist insgesamt stärker
           • Chemoluminineszenz ca. 10fach
             sensitiver als Colorimetrie


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      Molekulare Diagnostik


                                Vergleich HRP – AP
                                Chemolumineszenz

                                                               a) AP-Substratblatt
                                                               b) AP-Substrat flüssig
                                                               c) HRP-Substrat


                                                               Die Fläche unter der
                                                               Kurve ist proportional
                                                               zur Schwärzung des
                                                               Films!




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                          Summary-Western Blot
       • Technik zum Nachweis von Proteinen
              Qualitativ
              Quantitativ
              Präparativ
       • Häufige Anwendung in der Diagnostik
              Viren
              Bakterien
              Allergene
              Hormone
       • Einfache Methode




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