Fiche TP EXAO N�2 : ENZYMOLOGIE by B8RgL7F

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									Fiche TP EXAO N°2 : ENZYMOLOGIE

Influence de la température et du pH sur la cinétique enzymatique.



Suivi d’une cinétique enzymatique par Oxymétrie- la CATALASE


1 Introduction
La catalase est une enzyme présente dans le navet, elle catalyse la décomposition du peroxyde
d’hydrogène (H2O2) issu des oxydations cellulaires :
                               2 H2O2 ------------> O2 + 2 H2O

Après avoir extrait la catalase du navet, le dégagement d’O2 peut être mesuré par EXAO en utilisant
une sonde à oxygène.
En faisant varier la concentration de substrat (H2O2) à concentration d’enzyme constante, il est
possible d’étudier la cinétique enzymatique de la réaction ainsi que de mettre en évidence la notion de
complexe enzyme substrat.



2 Matériel nécessaire pour un poste
- 2 interface USBLINK (réf. PS-2100) ou 1 interface POWERLINK (réf. PS-2001)
- Sonde à oxygène (réf. PS-2108)
- pHmètre (réf. PS-2102)
- Sonde de température (PS-2125)
- Logiciel généraliste DATASTUDIO
- Enceinte cellulaire (réf. ENCYTO)
- Agitateur magnétique et turbulent
- Pipettes graduées (1ml et 25ml)
- 1 navet
- 1 broyeur (pour un groupe de TP)
- Matériel de filtration (des filtres à café peuvent suffire)
- H2O2 à différentes concentrations (0,125V - 0,25V - 0,5V – 1V – 2,5V – 5V)

3 Préparation
Découper un navet frais en morceau (sans l’éplucher) puis broyer dans un mixeur. Ajouter de l’eau
distillée (100 ml d’eau distillée pour 10 ml de jus de navet). Filtrer et conserver l’extrait au froid.
L’extrait peut être conservé une nuit au réfrigérateur.
Préparer les solutions d’H2O2 aux différentes concentrations précisées ci-dessus et conserver au
réfrigérateur.

Astuce : En conservant les solutions au froid, cela permet de retarder le démarrage de la réaction
enzymatique dans l’enceinte afin de prendre le temps d’observer le phénomène.
Préparer la sonde à oxygène comme indiqué sur sa notice. Il n’est pas strictement nécessaire de
l’étalonner pour cette expérience.



4 Manipulation
Verser 20ml de la solution contenant la catalase dans l’enceinte cellulaire. Placer le turbulent dans
l’enceinte. Lancer l’agitation (vitesse lente à moyenne). Fermer l’enceinte. Introduire la sonde à
oxygène dans l’enceinte.
Note : Il n’est pas nécessaire de boucher le second trou du bouchon car le dégagement d’oxygène lié à
la dégradation de l’H2O2 est suffisamment important pour négliger l’oxygénation liée à l’agitation.

Lancer les mesurer en cliquant sur le bouton “démarrer” de la barre de tâche.
Au bout de 70 secondes, injecter 0,5 ml de la solution d’H2O2 à 0,125V.
Il est possible de repérer le moment de l’injection en introduisant une note grâce à l’outil “Note”.
Observer l’évolution de la courbe pendant 2 minutes.
Recommencer la même opération avec les autres concentrations d’H2O2 (et bien entendu une nouvelles
solution d’enzyme à chaque fois).



5 Résultats

Exemple de résultats :
A l’aide de l’outil d’analyse, lire sur les courbes la quantité de dioxygène libéré 20 secondes après
l’introduction du substrat et de même après 40 secondes.
Tracer la courbe « vitesse de réaction en fonction de la concentration de substrat ».
L’option tableur du logiciel DATASTUDIO peut vous aider à tracer cette courbe, il suffit d’introduire
ces valeurs dans un tableau vierge puis d’effectuer un glisser coller des données vers un nouveau
graphique.



D’après les mesures la forme de ce graphique, on déduit la notion de complexe enzyme substrat.




, l’influence de la température et du pH sur la cinétique enzymatique.



2) Influence de la température
Système expérimental : équivalent à celui de l’expérience ci-dessus, une sonde de température va
permettre de mesurer la température.

Expérience : Faire varier la température à l’aide d’un bac à glace ou d’un bain-marie et observer
l’influence de la température sur la vitesse d’apparition du dioxygène.

3) Influence du pH
Système expérimental : équivalent à celui de l’expérience ci-dessus, un pH-mètre va permettre de
mesurer le pH.

Expérience : Faire varier le pH à l’aide d’une solution acide ou basique et observer l’influence du pH sur
la vitesse d’apparition du dioxygène.

								
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