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					 药物分析课件系列


第十一章       抗生素类药物分析

 Chapter 11 The Analysis of
         Antibiotics
                          INDEX
Contents
Fundamental Requirement
Section 1 introduction
Section 2 β-lactam antibiotics
Section 3 Aminoglycosides antibiotics
Section 4 Tetracycline antibiotics
Section 5 Quality research of Antibiotics
Summary
Content

The structures, properties, identification
and assay of β-lactam Antibiotics;
 β-内酰胺抗生素化学结构、性质、鉴别试验与含量测定;

The structures, chemical properties, and
assay of aminoglycosides and impurity tests
of streptomycin B and gentamycin
component C;
 氨基糖苷类抗生素结构化学性质、鉴别试验、含量测定及链霉
素B杂质检查庆大霉素C组分测定;
The structures, identification, special
impurity tests and assay of tetracyclines;

 四环素类抗生素化学结构性质、鉴别试验、含量测定及
盐酸四环素中特殊杂质检查;



 The quality research review of antibiotics
 抗生素类药物质量考察研究。
 .
Fundamental Requirements
掌握本类药物的化学结构特点理化性质,
主要鉴别试验及主要含量测定方法;
  Mastering the structures, physical and chemical
  properties, primary identification tests and assay
  methods of antibiotics.

了解典型抗生素有关杂质的分离研究进
展。
 Understanding the development of relevant
substance research for typical drugs.
   Section 1 Introduction

   Definition
  抗生素(antibiotics)是指某些微
生物代谢产生的,在很低的浓度即
可对某些生物的生命活动有特异抑
制或杀灭作用的化学物质。

   Classification
              青霉素及半合成   青霉素、氨苄西林、阿莫
    β-内酰胺类    青霉素类      西林、青霉素V
    抗生素       头孢菌素及半合   头孢噻吩钠、头孢氨苄、
              成头孢菌素类    头孢哌酮钠

                        金霉素、土霉素、四环素、
    四环素类抗生素             盐酸多西环素、盐酸美他
                        环素
抗                       链霉素、卡那霉素、
生   氨基糖苷类抗生素
素                       庆大酶素、新酶素
                        庆大霉素、新霉素

    大环内酯类抗生素            红霉素、麦迪霉素、
                        螺旋霉素
    氯霉素类抗生素             氯霉素、甲砜霉素


    其他抗生素               盐酸林可霉素、磷霉
                        素
  抗生素在质量控制上的特殊性.

生产的特殊性      性质的特殊性(稳定性差)



       质 量问题

化学纯度低, 三多:同系物多(G),异构体多(P),降解物
多(T)
抗生素理化测定法与微生物测定法的关系.

    微生物测定法:用抗生素对微生物的杀伤
和抑制程度为指标来衡量抗生素的效价
(potency).
     原理: 对数剂量和反应成直线,用管碟琼
脂扩散法.
     特点

  理化测定法:根据抗生素的结构特点, 利
用其特有的化学或物理化学性质及反应而
建立的方法.
  特点
 Section 2 β-Lactam Antibiotics

Structure and Characteristics




  β-内酰胺类抗生素是指分子中含有四个原子组成的β-内酰胺环
的抗生素。β-内酰胺环是该类抗生素发挥生物活性的必须基团,由四
个原子组成的,其分子张力比较大,化学性质不稳定,易发生开环
导致失活。
               青霉素族 penicillin                   头孢菌素族 aliporina
                                         RCOHN         S
                 RCOHN        S   CH3
    分子式
                                  CH3
structural                                         N
                          N                                   CH 2R
                                             O
formula              O            COOH
                                                       COOH


性质 character             青霉素族                     头孢菌素族
溶 解          度 分子中游离羧基能与无机碱或某些有机碱形成盐。其碱金属盐易溶于水,
solubility         有机盐难溶于水,易溶于甲醇等有机溶剂。
旋光性 optical          三个手性碳原子               两个手性碳原子
 rotation                  都具有旋光性、 可用于定性和定量分析

  紫外吸收             母核无紫外吸收
     UV          侧链酰氨基上具苯环                       母核有紫外吸收
  absorption     共轭系统则有紫外吸收

     稳定性       β-内酰胺环不稳定,与酸碱青霉素酶羟氨及某些金属离子(铜、铅、汞
   stability   和银)等作用时易发生水解和分子重排。 但在干燥条件下较稳定。
Identification test
钾钠盐的火焰反应 Flame reaction
  β-内酰胺类药品中许多为钾盐和钠盐,可
用此反应进行鉴别
 呈色反应 Color reaction
  1. 羟肟酸铁反应
     碱性环境中与羟胺作用β-内酰胺环破
  裂生成羟肟酸在稀酸中与高铁离子呈色 .
  2. 硫酸硝酸呈色反应
     头孢菌素类可与之反应呈色,机理多
  不明 .
3. 茚三酮反应
   α-氨基酸的反应,如氨苄西林
4. 与斐林试剂反应
   分子中具有(-CONH-)结构,可使碱性酒石
   酸铜还原显紫色, 如阿莫西林

5. 其他呈色反应: 如重氮苯磺酸呈色反应
沉淀反应Precipitation reaction

 1. 在稀盐酸中生成白色沉淀:
            加水溶解 加稀盐酸
 青霉素钾(钠)                 白色游离基沉淀


 2. 有机胺盐的特殊反应:
   A. 重氮化偶合反应: 如普鲁卡因青霉素
   B. 与三硝基苯酚的反应: 如苄星青霉素
        光谱法Spectroscopy
    1.   紫外分光光度法(UV)
      a. 最大吸收波长鉴定法
      b. 水解产物的最大吸收波长鉴定法
    2.   红外吸收光谱法(IR)
    3.   核磁共振光谱(HMR)

        色谱法Chromatography
    1.   薄层色谱法(TLC)
    2.   高效液相色谱法(HPLC)
   Assay
 Iodometric titration
  1. Principle:青霉素或头孢菌素分子不消耗碘,
     其降解产物消耗碘,例如青霉素族经水解后
     产生青霉噻唑酸可与碘作用,根据消耗的碘
     量计算青霉素的含量。
  2. Reaction process:
  3. Note:
     a. 一般认为碘与青霉素噻唑酸的作用以
        pH4.5温度24~26℃为最好;
     b. 青霉素的降解产物等杂质亦可消耗碘而影
        响测定结果,可以用未经水解的样品液
        作;
c. 在滴定近终点时放慢滴定速度,并强力
   振摇;如果滴定至终点时又反现蓝色,
   说明真正的终点尚未到达;
d. 由于每摩尔青霉素能吸收较多摩尔的碘
   (1摩尔青霉素能消耗8摩尔碘),故本
   法的灵敏度较高。
e. 需作标准品对照试验;
f. 严格按规定操作。
 本试验含量计算公式:


         VTo-VT       CS×D
  含量%=            ×          × 100%
         VSo-VS         W


式中:VTo、VSo:滴定供试品空白液和对照品
      空白液消耗的硫代硫酸钠液(0.02mol/L), ml;
   VT、VS:滴定供试品和对照品消耗的硫代
      硫酸钠液(0.02mol/L),ml;
   CS:对照品浓度,g/ml;
   W:供试品取样量,g;
   D:供试品稀释倍数。
 汞量法 (Mercurimetry)
  1. Principle: 青霉素分子不与汞盐反应,而
     其碱性水解产物青霉噻唑酸及继续水解生
     成的青霉胺都能与汞盐定量反应,根据消
     耗的汞盐量可以计算青霉素的含量。
         Hg2+ + 2R-SH         (RS)2Hg + 2H+
  2. Method (potentiometric titration)
     Indicator electrode: Pt; reference electrode:
     Hg-mercurous sulfate electrode;
     Standard solution:mercuric nitrate solution
     (0.02mol/L)
3. 讨论:
   a. 本次滴定只有一次突跃。但滴定
曲线上出现两个指示点,即两次突跃。
青霉素含量的计算系以第二次滴定终点
为依据,此时青霉素与巯基汞化物的摩
尔比为1︰1。

 b. 水解必须完全。溶液的pH值和反
应时间直接影响水解的完全程度,水解
如不完全,将使测定结果偏低。
  c. 本法的空白试验的做法与碘量法
类似,空白试验的目的也是为了消除供
试 品中可能存在的降解产物的干扰。

  d. 本法与碘量法比较主要优点是不
需要青霉素标准品作对照,汞盐滴定液
用EDTA标定即可。
 酸碱滴定法 (Acid/base titration)



 Principle: 青霉素或头孢菌素的β-内酰
胺环可被碱水解,此水解系定量完成,可
用于含量测定。

  如苯唑西林钠在水溶液中加过量的氢氧化钠
滴滴定液水解后,产生的青霉噻唑酸被中和,再
以盐酸滴定液滴定剩余的氢氧化钠液,以氢氧化
钠滴定液的消耗量求得苯唑西林钠的含量。
 UV

1. 铜盐法: 青霉素族抗生素在弱酸性下的降解产物
   青霉烯酸具有紫外吸收特征。青霉烯酸在
   320~360nm处有最大吸收,但此水解产物不稳定,
   可加Cu2+,与青霉烯酸形成较稳定的螯合物,在
   320nm处有最大吸收。
2. 汞盐法: 青霉素族抗生素在咪唑的催化下与氯化
   高汞能定量的反应转化呈相应的青霉烯酸硫醇
   汞盐,在324~325nm波长范围内有最大吸收。
  3. 羟肟酸比色法 青霉素族和头孢菌素族抗生
     素能与羟胺作用生成羟肟酸衍生物,在烯酸
     中与高铁离子生成红色络合物,在一定波长
     下测定吸收度而进行定量。

 高效液相色谱法HPLC
  填充剂:十八烷基硅烷键合硅胶     中国药典
  流动相:磷酸氢二钠、枸橼酸溶液   测定头孢唑
  检测波长:254nm          林钠
  保留时间:7.5min
  分离度:>4
  内标溶液:乙酰苯胺
  测定法:内标法
  计算:按内标法计算
      第三节 氨基糖甙类抗生素
   Section 3 Aminoglycosides antibiotics

  本类抗生素的化学结构都是以碱性环己多
元醇为甙元,与氨基缩合而成的甙,故称为氨
基糖甙类抗生素(aminoglycosides antibiotics)。


链霉素 (Streptomycin)
Structure and properties
                NH
           HN C NH2                                 CH2OH
                                               O
     HO
                    O                    O             OH
                         O          OH
H2 N C N            OH             CHO       HN     OH
       H
     NH     OH               CH3              CH3

      streptidine       streptose        N-methyl-L-glucosamine


                               streptobiosamine
1. Characteristics
     链霉素的构成为一分子链霉胍和一分子
   链霉双糖胺结合而成的碱性甙。
     链霉素分子中有三个碱性中心,可与无
   机酸或有机酸形成可溶于水的盐,临床上多
   用其硫酸盐。

2. Properties
     酸性条件下,链霉素水解为链霉胍与链
   霉双糖胺,进一步水解则得到N-甲基-L-葡萄
   糖胺。弱碱性条件下能使之水解为链霉胍及
   链霉双糖胺,但继之即将链霉糖部分分子重
   排为麦芽酚(maltol),这一性质为链霉素所特有,
   可用于鉴别。
Identification Tests
 Ninhydrin reaction
 Elson-Morgan reaction
   链霉素经水解,产生N-甲基葡萄糖胺,在碱性溶
 液中与乙酰丙酮缩和成吡咯衍生物,与对二甲氨基苯
 甲醛的酸性溶液反应即生成红色缩合物。
 Maltol reaction
   链霉素在碱性溶液中,链霉糖经分子重排使环扩
 大形成六元环,然后消除N-甲基葡萄糖胺,再消除链
 霉胍生成麦芽酚(α-甲基-β-羟基-γ-吡喃酮)。麦芽酚可
 与铁离子在微酸性环境中形成紫红色配位化合物。
 Sakaguchi reactoin
     本品水溶液加氢氧化钠试液,水解生成链霉胍。
 链霉素B杂质检查

  BP(1993)规定了链霉素B的检查项目。
甘露糖链霉素称作链霉素B,它是链霉素分
子中N-甲基葡萄糖胺的C4〞位上的羟基连接
一个D-甘露糖组成的。

 含量测定Assay

    目前各国药典仍采用微生物检测法。
庆大霉素(Gentamycin)
 Structure and Characteristics
  1. Structure
  2. Characteristics
     庆大霉素是由绛红糖胺、脱氧链霉胺和加洛糖
   胺缩和而成的甙。
     庆大霉素有五个碱性中心,其碱性相似。能与
   无机酸或有机酸形成可溶于水的盐,多用硫酸盐。
   3. Property
     硫酸庆大霉素水中易溶,在乙醇、丙酮、氯仿
   或乙醚中不溶。对光、热、空气均较稳定,水溶液
   稳定,pH2~12时,100℃加热30min活性无明显变
   化。
     庆大霉素在紫外无吸收。
 鉴别反应Identification
 1. 茚三酮反应 Ninhydrin reaction
        本品与链霉素一样具有氨基糖甙类
    结构,羟基胺类和α-氨基酸的性质,可
    与茚三酮生成蓝紫色缩和物。
 2. Elson-Morgan reaction
        与链霉素一样,经水解后也产生N-
    甲基葡萄糖胺(加洛糖胺)在碱性溶液中
    与乙酰丙酮缩和成吡咯衍生物,与对二
    甲基苯甲醛的酸性醇溶液反应,生成红
    色缩和物。
3. 紫外分光光度法Ultraviolet spectroscopy
   庆大霉素分子中无共轭双键系统,故在紫
   外区无吸收。
4. 薄层色谱法TLC
5. 高效液相色谱法HPLC
6. 红外光谱法IR
7. 硫酸盐反应Sulfate reaction
检查-庆大霉素C组分测定
  庆大霉素C1、C2、C1a对微生物的活性
无明显差异,但其毒副作用和耐药性有差异,
导致各组分的多少影响产品的效价和临床研
究。
  中国药典(2000)、USP(24)和BP(1993)均
采用高效液相色谱法,JP(13)采用薄层色谱
法和薄层微生物显像法测定各组分的含量。
含量测定Assay
 目前各国药典仍用微生物检定法。
      第四节 四环素类抗生素
       Section 4 Tetracyclines
    本类抗生素在化学结构上,都具有氢化四
骈苯环,故统称为四环素族或四环素类(tetrac-
yclines)抗生素。

 化学结构与性质

  结构Structure

  性质Character
Structure
            R R`        R'' R''' H    N(CH3)2
                                            OH


                                            CONH2
                                OH
            OH      O        OH   O

      Name              R       R′       R〞         R’’’
   tetracycline         H       OH       CH3        H
 chlortetracycine       Cl      OH       CH3        H
 oxytetracycline        H       OH       CH3        OH
   doxycycline          H       H        CH3        OH
   metacycline          H            =CH2           OH
1. 两性化合物Amphoteric compound;其盐酸盐
   易溶于水,并溶于碱或酸性溶液中;
2. 结晶性物质,在水中结晶者,均含有结晶水;
3. 旋光性Optical rotation;
4. 差向异构化性质Epimerization —— 差向四环
   素;
5. 酸性降解 Acid degradation—— 脱水四环素;
6. 碱性降解 Base degradation—— 异四环素;
7. 中性降解 Neutral degradation—— 紫红色缩
   和物;
8. 与金属离子形成配位化合物。
鉴别试验Identification

  i.    浓硫酸反应Con. Sulfuric acid
  ii.   三氯化铁反应Ferric chloride reaction

        盐酸四 盐酸金 盐酸土 盐酸多 盐酸美
名称
        环素  霉素  霉素 西环素 他环素
        蓝色变
浓硫酸
    深紫色 为橄榄 朱红色              黄色    橙红色
反应
        绿色
三绿化
    红棕色 深褐色 橙褐色              褐色          -
铁反应
iii. 氯化物反应Chloride reaction 本类抗生素
     多用盐酸盐,可与硝酸银在酸性条件下生
     成氯化银白色沉淀。
iv. 紫外分光光度法UV 本类抗生素分子内含
     有共轭双键系统,在紫外光区有吸收。
v. 荧光法Fluorescence 本类抗生素分子内
     含有共轭双键系统,在紫外光照射下能产
     生荧光,它们的降解产物也具有荧光。
vi. 薄层色谱法TLC 四环素类抗生素的薄层
     色谱多采用硅藻土作载体,为获得较好得
     分离,在粘合剂中加有聚二乙醇400、
     甘油以及中性的EDTA缓冲液。EDTA
     可以克服因痕量的金属离子存在而引
     起的脱尾现象。本类抗生素及其降解
     产物在紫外光(365nm)下产生荧光的性
     质,可用与检出斑点并以标准品对照
     进行鉴别。
 vii.其他方法Other method 红外光谱法及
     高效液相色谱法

盐酸四环素中特殊杂质检查( Impurity
test in tetracycline)
含量测定Assay
 比色法Colorimetric method
 高效液相色谱法 HPLC
 第五节       抗生素类药物的质量考察研究
Section 5 Quality Research Review of Antibiotics

 青霉素中致敏杂质的分离制备
 凝胶过滤法Gelfiltrationmethod
 GDX104柱色谱GDX104column chromatography

 杂质的研究Research of impurity
  1. 光谱法Spectroscopy
   Penamaldate法测定青霉噻唑基团――青霉素
  过敏反应主要抗原决定簇
   紫外光谱分析UV
   红外光谱分析IR
2.    色谱法Chromatography
     薄层色谱法TLC
     高效液相色谱法HPLC
     气相色谱法GC
     凝胶过滤色谱法 Gelfiltrationmethod chromatography

3.      生物法Biological method
      电泳法Electrophoretic method-圆盘电泳分析
        免疫法Immunizing method-豚鼠被动皮肤过敏试验
     (PCA试验)
  Type      Typical drugs   Property      Identification   Assay

           Anoxicillin                    Flame
                            dissolved     reaction;
           Ampicillin                                   Iodometric
Penicillin                  in water;     Color
           Piperaxillin     optical       reaction;     Mercurimetric,
                            activity;     precipitation Acid/base
                                          reaction;     Titration;
                            UV
                            absorption;   Spectroscopy; UV;
          Cefradine                                     HPLC
Cephalos-                   unstability   Chromatogra
          Cefalexin
 porine                                   phy
          Cefadroxil
                           Identific-
    Type       Property                      Assay
                             ation
                          Ninhydrin
                          Elson-Morgan
                          Maltol
                          Sakaguchi
Streptomycin Solubility                  Bioanalysis
             Isomers
             UV           Ninhydrin
                          Elson-Morgan   HPLC
             stability    TLC

Gentamycin
Editors:
           Qiang Fu

           Hongqin Ke

           Qiang Li

				
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posted:3/25/2012
language:English
pages:45