Rischio Chimico by vPVG3Lr

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									                 INDICE
•   Bromuro di Etidio
•   Trizol
•   Cloroformio
•   -mercaptoetanolo
•   Guanidina tiocianato
•   Dimetilsulfossido
•   Diaminobenzidina (DAB)
                                 Elettroforesi
L’elettroforesi in gel è il metodo standard utilizzato per separare, identificare e purificare
frammenti di DNA
Il gel può essere costituito da agarosio o da poliacrilamide

I gel di poliacrilamide sono usati per separare frammenti di DNA < 500 bp e hanno
un’elevata risoluzione, ma sono più difficili e pericolosi da maneggiare rispetto ai gel di
agarosio

I gel di agarosio sono semplici da preparare e sono tipicamente usati per separare frammenti
di dimensioni variabili da poche centinaia di basi a 20 kb. Vengono largamente utilizzati per
la maggior parte delle analisi routinarie su DNA/RNA


L’agarosio è un polimero di carboidrati estratto dalle alghe. Esso, se fuso e gelificato, forma
una matrice, la cui porosità dipende dalla concentrazione dell’agarosio
                              Reagenti
TBE: tampone più comunemente usato per l’elettroforesi
  T Tris,consente il mantenimento di un valore costante di pH della soluzione
  E EDTA, chela i cationi bivalenti, come il magnesio. Questo è importante,
       perché la maggior parte delle nucleasi richiede cationi bivalenti per
       funzionare
  B Borico che fornisce l’appropriata forza ionica al tampone

Bromuro di Etidio
  Uno dei coloranti più utilizzati è il bromuro di etidio, molecola organica
  aromatica planare, altamente tossica, cancerogena e mutagena, in grado di
  intercalarsi tra le basi azotate e di emettere luce arancio se eccitata da
  radiazione UV con  compresa tra 254 e 306 nm. Questo colorante è in grado
  di evidenziare quantitativi di acidi nucleici fino a 50 ng [Old e Primrose,
  1994]
     Agenti cancerogeni o mutageni
In base al Dlgs 626/94 si deve intendere per “agente cancerogeno” una sostanza
o un preparato che, in base alle disposizioni CEE (direttiva 67/548/CEE, direttiva
88/379/CEE) deve riportare la codifica R45 (può provocare il cancro) o R49 (può
provocare il cancro per inalazione)

Se la sostituzione dell’agente cancerogeno non e’ possibile, dovrà essere
utilizzato in un sistema chiuso; in tutti i casi e’ necessario accertarsi che
l’esposizione all’agente nocivo sia limitata

In base all’art. 64, qualora si usino agenti cancerogeni si devono applicare le
seguenti misure:
•Limitazione delle quantità nell’ambiente di lavoro
•Attuazione delle norme igieniche
•Massima riduzione possibile del numero di soggetti esposti
•Raccolta e smaltimento dei residui in condizioni di sicurezza
     Dispositivi di protezione individuali
•Occhiali

•Indumenti di protezione (camice)

•Guanti protettivi

•Maschere di protezione

L’operatore può proteggersi con mezzi di prevenzione individuale,
ma l’uso di questi non può sostituire l’uso di una cappa efficiente,
ma solo integrarlo, per diminuire ulteriormente il rischio di danni
                        Bromuro di Etidio
                   T+ Molto tossico

Proprietà fisiche e chimiche
Stato: Solido
Colore: Rosso scuro
Odore: Quasi inodore

Frasi-R: 22-26-36/37/38-68 Nocivo per ingestione. Molto tossico per inalazione.
                           Irritante per gli occhi, le vie respiratorie e la pelle.
                           Possibilità di effetti irreversibili
Frasi-S: 26-28-36/37-45    In caso di contatto con gli occhi, lavare
                           immediatamente ed abbondantemente con acqua e
                           consultare un medico. In caso di contatto con la pelle
                           lavarsi immediatamente ed abbondantemente con
                           acqua e sapone. Usare indumenti protettivi e guanti
                           adatti.

                   Utilizzare il reagente sotto cappa chimica
                         Frasi-R Frasi-S
• Sono chiamate frasi R alcune frasi convenzionali che descrivono i rischi
  per la salute umana, animale ed ambientale connessi alla manipolazione di
  sostanze chimiche
• Sono chiamate frasi S alcune frasi convenzionali che descrivono i consigli
  di prudenza cui attenersi in caso di manipolazione di sostanze chimiche
• Sono frasi codificate dall'Unione Europea nella direttiva 88/379/CEE.
• Ad ogni frase è associato un codice univoco composto dalla lettera R
  seguita da un numero. Ad ogni codice corrispondono le diverse traduzioni
  della frase in ogni lingua ufficiale dell'Unione Europea.
• È previsto dalle attuali normative che ogni confezione di prodotto chimico
  rechi sulla propria etichetta le frasi R e le frasi S corrispondenti al prodotto
  chimico ivi contenuto.
                       Bromuro di Etidio
Evitare la contaminazione personale anche con l’uso di dispositivi di protezione
personale (camice, guanti)


I residui non devono essere dispersi nell’ambiente, ma sottoposti ad
ossidazione, o assorbimento su resine o carbone attivo. Il responsabile del
laboratorio deve scegliere una zona in cui potrà essere maneggiata tale
sostanza


 La zona scelta dovrà essere segnalata in modo visibile. Tutte le operazioni che
richiedono l’impiego del bromuro di etidio dovranno essere effettuate entro l’area
evitando così contaminazioni di altre porzioni dell’ambiente lavorativo.
                            Accorgimenti
Per la preparazione del gel di agarosio, qualora sia possibile, bisogna utilizzare
materiale monouso:
•Sciogliere l’agarosio in una beuta di vetro
•Versare il contenuto in un contenitore di plastica monouso

Sotto cappa chimica:
•Aggiungere il Bromuro di Etidio utilizzando puntale con filtro, che, dopo
l’utilizzo deve essere gettato in contenitori appositi non perforabili presenti
sotto cappa
•Fare attenzione a non sporcare la pipetta con il colorante durante questa
operazione
•Richiudere il contenitore di plastica
•Gettarlo nell’apposito contenitore per lo smaltimento dei rifiuti fornito
dall’Azienda
Durante tutta la preparazione del gel controllare che i guanti siano puliti per
evitare qualsiasi tipo di contaminazione
                   Alternativa al BrEt (1)
Ove sia tecnicamente possibile e’ obbligatorio sostituire eventuali
agenti cancerogeni in uso, con altre sostanze o prodotti non nocivi o
meno nocivi

Il blu di metilene rappresenta una alternativa al bromuro di etidio
quando la concentrazione di acidi nucleici non è un fattore critico.
L'unico vantaggio è rappresentato dalla scarsa tossicità della
molecola utilizzata [Old e Primrose, 1994]



                  R 22: Nocivo in caso di ingestione


A temperatura ambiente si presenta come un solido blu scuro quasi inodore
                Alternativa al BrEt (2)
• SYBR Green II RNA Gel Stain:è un colorante intercalante che si lega al
  prodotto di PCR producendo un segnale molto intenso

• Il prodotto non è codificato conformemente alle direttive CEE/norme sulle
  sostanze pericolose perché non contiene componenti pericolosi
    – Sulla pelle: non ha effetti irritanti
    – Sugli occhi: non irritante
    – Sensibilizzazione: non si conoscono effetti sensibilizzanti


• Nella manipolazione osservare le misure di sicurezza usuali impiegate
  nell’utilizzo di sostanze chimiche
                                 Trizol
• Reagente utilizzato per le estrazioni di RNA da sangue in toto, da cellule e
  da tessuto
• Permette l’estrazione contemporanea di DNA e di proteine dalla fase
  organica
• Soluzione monofasica di fenolo e guanidina isotiocianato

Il prodotto è classificato ed etichettato secondo Direttiva 1999/45/CE

Classificazione
   Indicazione di pericolo
         T Tossico

  Frasi “R”
R34-Provoca ustioni
R26/27/28-Molto tossico per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione

                  Utilizzare il reagente sotto cappa chimica
                             Cloroformio
               Stato fisico; Aspetto:
               Liquido incolore, con odore caratteristico


R22:       Nocivo per ingestione
R38:       Irritante per la pelle
R40:       Possibilità di effetti cancerogeni- prove insufficienti
           (Direttiva2001/59/CE della commissione
R48/20/22: Nocivo: pericolo di gravi danni alla salute in caso di esposizione
           prolungata per inalazione ed ingestione
S(02):     (conservare fuori della portata dei bambini)
S36/37:     Usare indumenti protettivi e guanti adatti




                   Utilizzare il reagente sotto cappa chimica
                  ß-mercaptoetanolo
Utilizzo: Estrazione di RNA totale da cellule eucariotiche


                                    T+ Molto Tossico
                                    N Pericoloso per l’ambiente



  R22: Nocivo per ingestione
  R24: Tossico a contatto con la pelle
  R34: Provoca ustioni

  Forma: Liquido
  Colore: Incolore
  Odore: Forte


       Utilizzare il reagente sotto cappa chimica
                        ß-mercaptoetanolo
     ACCORGIMENTI

Essendo molto pericoloso, in caso di contatto cutaneo (corrosivo, assorbito
attraverso la pelle), utilizzarlo sempre indossando camice, guanti protettivi e
verificare che durante i singoli passaggi non si verifichi contaminazione degli stessi.

Utilizzare sempre puntali con filtro

Al termine dell’utilizzo, prima di chiudere la cappa chimica, verificare che il
contenitore utilizzato per lo smaltimento dei rifiuti sia chiuso per evitare dispersione
degli odori perché

Il ß-mercaptoetanolo è molto pericoloso in caso di inalazione (corrosivo per i
polmoni)
           Guanidina tiocianato

            Nocivo

Frasi-R
R20/21/22: nocivo per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione
R32: a contatto con acidi libera gas altamente tossici
R36/38: irritante per gli occhi e la pelle

Frasi-S
S14: conservare lontano da acidi (forti)
S23: non respirare i vapori
S36/37: usare indumenti protettivi e guanti adatti
                       Dimetilsulfossido
     Impieghi

Preparazione della soluzione di congelamento per criopreservazione:
     –   Linee cellulari
     –   Sospensioni linfocitarie
     –   CSEP
     –   BM
                         Dimetilsulfossido
                    Xi Irritante

Frasi di Rischio
R36: Irritante per gli occhi
R37: Irritante per le vie respiratorie
R38: Irritante per la pelle

Frasi di Sicurezza
S23:     non respirare i fumi
S26:     in caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente ed
         abbondantemente con acqua e consultare un medico
S36/37: Indossare indumenti protettivi e guanti adatti
                       Dimetilsulfossido
                         Limite di esposizione personale
Non è stato definito alcun limite di esposizione

                     Dispositivi di protezione individuale
Protezione respiratoria: nessuna raccomandazione specifica
Protezione degli occhi: utilizzare gli occhiali di sicurezza
Protezione delle mani: utilizzare guanti adatti
Protezione della pelle: indossare indumenti protettivi adatti

            Misure da adottare in caso di versamento accidentale
Precauzioni individuali: evitare il contatto con la pelle, gli occhi e gli indumenti
Metodi di pulizia: raccogliere quanto possibile in un recipiente pulito per lo
                  smaltimento. Sciacquare i residui con molta acqua
                Diaminobenzidina (DAB)
La morfologia è il principale criterio per la diagnosi di LAL e per la
differenziazione dalle LAM

Non sempre l’osservazione della morfologia delle cellule è sufficiente
per inquadrare con esattezza l’origine linfoide o mieloide della
leucemia perciò su di uno striscio di sangue midollare viene testata la
reazione della PEROSSIDASI

La PEROSSIDASI è un enzima che appartiene alla classe delle
ossidoriduzioni, cioè catalizza l’ossidazione di un substrato
rimuovendo due atomi di idrogeno che vengono a combinarsi con una
molecola di acqua ossigenata. Nel nostro caso il substrato è la
DIAMINOBENZIDINA
               Reazione di ossidoriduzione
Per azione della perossidasi contenuta nei lisosomi cellulari, la DAB si riduce
formando un precipitato di colore giallo-bruno:



                                 Perossidasi
                     + H2O2                                          + 2 H2O


    DAB (ossidato)                                   DAB (ridotto)



Risultano positive a questa reazione le cellule che, sul vetrino, assumono una
pigmentazione granulare giallo-bruna e ciò accade per le cellule della linea
promielocitaria e monocitaria. Quando queste cellule sono presenti con una
percentuale < 3% si valuta la leucemia di origine linfocitaria
                                            DAB
                     Xn Nocivo


Frasi-R                                      Detergente consigliato:
R40: possibilità di effetti irreversibili    acqua eventualmente con l’aggiunta di detersivi

Frasi-S                                      Manipolazione
S36/37: usare indumenti protettivi e         Indicazioni per una manipolazione sicura:
        guanti adatti                        Non sono richiesti provvedimenti particolari

Proprietà fisiche e chimiche                 Stoccaggio
Forma: Liquido                               4°C
Colore: Chiaro                               Non conservare a contatto con ossidanti
Odore: Inodore
                                 DAB
ACCORGIMENTI

• Utilizzare il reagente sotto cappa chimica

• Utilizzare pasteur monouso e puntali con filtro

• Versare lo scarto in contenitori appositi per lo smaltimento dei rifiuti
  tossici facendo attenzione a non inalare eventuali aerosol

• Lavare la vetreria con abbondante acqua e detersivi

								
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