LA PRUEBA DEL ADN by Hbf8zy

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									          LA PRUEBA DEL ADN
   El ADN constituye el material genético de las células del
    cuerpo humano.
   Con un tipo de excepción, el ADN se encuentra
    exclusivamente en el núcleo de las células.
   En el genoma humano se estima que hay  40,000 ó más
    genes (trozos funcionales del DNA compuestos a su vez
    de 1,000 a 200,000 nucleótidos).
   Los nucleótidos forman un par de cadenas apareadas
    que toman la forma tridimensional de un doble hélix.
    Hay más de 3,000'000,000 de pares de bases que
    constituyen el genoma de una sóla célula humana.
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          LA PRUEBA DEL ADN
   Cada nucleótido del ADN está compuesto de tres
    subunidades: una base nitrogenada, una desoxiribosa y
    un grupo fosfato. Hay cuatro tipo de bases nitrogenadas
    en los nucleótidos del ADN: timina (T), citosina (C),
    guanina (G) y adenina (A).
   Es importante resaltar que así como hay regiones con
    función conocida o supuesta (los genes), sucede que casi
    la mitad del ADN del genoma humano consiste de
    regiones (intrones) con función hasta hoy desconocida y
    que tienen una secuencia de nucleótidos repetitiva en
    muchos casos pero con patrones hipervariables en
    muchas regiones del genoma.
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          LA PRUEBA DEL ADN
   Es precisamente de la hipervariabilidad (polimorfismo)
    de estas regiones del ADN de lo que se aprovecha para
    detectar diferencias (o semejanzas) entre un ser humano
    y otro, estudiando su ADN.
   Las regiones repetitivas pueden presentarse como
    tandas repetitivas cortas o largas. A esto se le llama
    VNTRs (variable number of tandem repeats) entre los que
    están los STR (short tandem repeats), que son las
    regiones hipervariables estudiadas para las pruebas
    modernas de paternidad.


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          LA PRUEBA DEL ADN
   Toda célula nucleada contiene 46 cromosomas (excepto
    los gametos : los espermatozoides y los óvulos, que tiene
    23 crmosomas cada uno.
   Los cromosomas son tan sólo la forma como la célula
    ordena su ADN combinándolo con proteínas.
   En el momento de la concepción, se necesita 46
    cromosomas para procrear un nuevo ser humano.
   En consecuencia una persona debe recibir exactamente
    la mitad de su material genético de su madre biológica y
    exactamente la otra mitad del padre biológico.

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          LA PRUEBA DEL ADN
   Está basada en un análisis exacto de los perfiles
    genéticos de la madre, del niño(a) y del presunto padre.
   Si se conocen los perfiles genéticos de la madre y de su
    hijo(a), el perfil genético del padre puede ser deducido
    con certeza casi total.
   Si no se hace la prueba a la madre, los perfiles del ADN
    del niño(a) serán comparados al perfil del ADN del
    presunto padre. La técnica utilizadas permiten obtener
    el mismo grado de exactitud (probabilidad de
    paternidad) en los análisis en que no se examina el ADN
    de la madre sino sólo el del hijo(a) y el del presunto
    padre.
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          LA PRUEBA DEL ADN
   El ADN se puede extraer a partir de una variedad de
    muestras:
   células epiteliales de la mejilla,
   glóbulos blancos de la sangre
   folículos pilosos
   células fetales (provenientes de líquido
    amniótico) en cultivo
   semen
   otras muestras biológicas(tejidos, etc)
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Validez de diferentes tipos de Muestra
        como fuentes de ADN

   Muestras 1-8     Excelentes.
   Muestras 9-15    Buenas o Regulares.
   Muestras 16-20   Regulares o Malas.
   Muestras 21-23   No aceptables.




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     Validez de diferentes
    tipos de Muestra como
        fuentes de ADN
   1. Hisopos de Muestras de la
    Mejilla.- Se necesita tomar
    muestras con dos hisopos
    estériles frotando
    vigorosamente el interior de
    las mejillas (un hisopo por
    mejilla). La idea es que de
    esta manera unas pocas
    células epiteliales puedan ser
    desprendidas y transferidas al
    hisopo. Este tipo de muestras
    permite resultados finales en
    sólo una semana.             LUIS ROSSI
    Validez de diferentes tipos de Muestra
            como fuentes de ADN
   2. Sangre Total.- La sangre total (generalmente venosa)
    funciona muy bien siempre y cuando la toma haya sido
    hecha recientemente y colectada apropiadamente en un
    tubo tipo vacutainer® que contenga el preservante
    apropiado.
   La sangre que ha de ser guardada por períodos largos
    debe ser refrigerada. Sólo en estas condiciones la
    muestra de sangre puede servir tan bien como una
    muestra de células de mejilla.



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    Validez de diferentes tipos de Muestra
            como fuentes de ADN
   3. Sangre de Cordón Umbilical.- La sangre del cordón
    umbilical funciona muy bien si llega al laboratorio en buenas
    condiciones. La sangre tomada de este modo toma igual de
    tiempo en procesarse que la tomada en tubos vacutainer®.
   4. Manchas de Sangre.- Las manchas de sangre que funcionan
    bien deben haberse tomado en unos papeles absorbentes que
    poseen unas sustancias que impiden la acción de enzimas
    degradantes sobre la sangre.
   5. Semen.- El semen debe llegar al laboratorio congelado en
    tubos apropiados si es de más de 24 horas. Si es una muestra
    reciente basta con el condón debidamente anudado y guardado
    en refrigeración hasta por 24 horas. Sin embargo, procesar el
    ADN de estas muestras toma un poco más de tiempo.
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            como fuentes de ADN
   6. Células Fetales tomadas vía Amniocentesis.- Estas
    células funcionan siempre bien como fuente de ADN fetal.
    Sin embargo, hay que considerar que se requiere ponerlas
    en cultivo durante una semana antes de procesarlas. La
    amniocentesis consiste en insertar una aguja fina a través de
    la pared abdominal de la madre gestante hasta penetrar
    dentro del útero. Se toma una muestra del líquido en el que
    flota el feto y es precisamente de este líquido que
    posteriormente se colectan algunas células fetales de donde
    se extraerá el ADN. Este procedimiento toma unos 10
    minutos y es realizado por el ginecólogo típicamente a partir
    de las 14 semanas de gestación.
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            como fuentes de ADN
   7. Células Fetales del Vello Coriónico.- Estas células
    también requieren ponerse en cultivo antes de ser
    procesadas.
   La muestra de vello coriónico es también un procedimiento
    ginecológico que se realiza aspirando una pequeña cantidad
    de tejido placentario primitivo (corion) mediante inserción
    desde la vagina. En este procedimiento se está tomando en
    realidad células placentarias exclusivamente pero que,
    puesto que son de origen fetal, corresponden
    exclusivamente al ADN del feto. La ventaja de esta técnica
    es que puede hacerse más temprano en el embarazo -
    típicamente a las 11 semanas.
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    Validez de diferentes tipos de Muestra
            como fuentes de ADN
   8. Tejido Fetal proveniente de Abortos.- El tejido fetal es una
    excelente fuente de ADN siempre que no se le haya expuesto
    previamente a la acción del formol (formaldehído al 37%). Se
    requiere una semana extra para procesar estas muestras.
   9. Condones o Preservativos de Látex.- El semen contenido en
    condones sirve muy bien como fuente de ADN. Es importante
    que el condón se mantenga en refrigeración luego de haber sido
    usado. Es importante notar que del material presente en
    condones usados en relaciones sexuales se puede derivar hasta
    dos tipos de ADN (los ADN de ambos miembros de la pareja).



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    Validez de diferentes tipos de Muestra
            como fuentes de ADN
   10. Manchas de Semen en Ropa.- Se requiere tiempo
    adicional para procesar estas muestras. Se sugiere refrigerar
    el pedazo de ropa lo antes posible.
   11. Tejidos provenientes de Exhumaciones.- Muestras
    exhumadas colectadas de tejido profundo del muslo o de
    médula ósea tomada del fémur suelen funcionar un 75% de
    las veces.
   12. Cordón Umbilical Seco.- Muestras tomadas del cordón
    umbilical seco funcionan el 50% de las veces y toman hasta
    varias semanas adicionales para procesarse.


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    Validez de diferentes tipos de Muestra
            como fuentes de ADN
   13. Cepillos de Dientes.- Los cepillos dentales usados
    funcionan un 50% de las veces. Toman por lo menos una a
    dos semanas más para procesarse.
   14. Basurilla de Rasuradoras Eléctricas.- La basurilla
    colectada del interior de las rasuradoras eléctricas puede ser
    una buena fuente de ADN. Estas muestras toman unas dos
    semanas extras para procesarse.
   15. Tampones (tampax®) o toallas femeninas.- Pueden
    ser una excelente fuente de ADN. Hay que refrigerarlas
    apenas se recojan. Toman dos semanas extra para ser
    procesadas.

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    Validez de diferentes tipos de Muestra
            como fuentes de ADN
   16. Cabello Arrancado.- El cabello debería ser halado con
    suficiente fuerza como para desprender la raíz viva de las
    hebras de cabello. Se necesitaría unas 10 a 20 hebras bien
    tomadas para que se pueda obtener suficiente tejido. El
    proceso de estas muestras toma unas cuatro semanas.


   17. Colillas de Cigarrillo.- Las colillas que no han estado
    expuestas al ambiente por mucho tiempo suelen funcionar
    en muchos casos. Requieren algunas semanas adicionales de
    proceso.


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    Validez de diferentes tipos de Muestra
            como fuentes de ADN
   18. Orina.- Esto es para el caso en que se requiera examinar
    orina para hacer una comparación entre un individuo y su
    orina que se hubiera usado para dosar drogas ilícitas. La
    orina puede funcionar bien si sucede que contiene algunas
    células epiteliales renales y si la muestra se tomó en un
    recipiente estéril que es mantenido refrigerado.
    Desafortunadamente, cuando la orina - tomada para dosaje
    de drogas - es terminada de usar, los laboratorios suelen
    descartarla.




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    Validez de diferentes tipos de Muestra
            como fuentes de ADN
   19. Tejido Incluido en Parafina.- Esta es la forma como los
    patólogos suelen preparar las biopsias. Estos bloques de parafina
    son preparados para exámenes de microscopía y no para análisis
    de ADN. Sin embargo, hay familiares de personas ya fallecidas
    que los quieren usar como manera post-mortem de determinar
    paternidad. El preservante típicamente usado para fijar las
    biopsias suele ser formol (formaldehído al 37%). El formol
    causa entrecruzamientos covalentes inter e intramoleculares en
    el ADN. El formol inclusive es capaz de entrecruzar la enzima
    (que usamos para amplificar el ADN) contra el mismo ADN que
    estamos tratando de analizar. En consecuencia, es una mala
    fuente de ADN y se logra resultados exitosos en sólo un 25% de
    los casos y tan sólo luego de hasta meses de tratativas sin la
    seguridad de obtener un resultado final exitoso.
                                LUIS ROSSI
    Validez de diferentes tipos de Muestra
            como fuentes de ADN
   20. Papel Higiénico (o kleenex®) Usados.- Son mala fuente de
    ADN. Sin embargo, cuando están manchados con sangre y son
    transportados correctamente al laboratorio, sí funcionan con
    mucha frecuencia.


   21. Pelo Caído.- El cabello, vello o pelo corporal caído
    (telogénico) constituye cabello, vello o pelo que llegó al final de
    su ciclo de vida y se desprende del cuerpo de manera natural.
    Este tipo de cabello o pelo nunca funciona como buena fuente de
    ADN y se encuentra típicamente en: peines, cepillos de cabello,
    ropa, almohadas, sábanas, rejillas de desagüe de las duchas.
    Asimismo, el cabello cortado no funciona como fuente de ADN.
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    Validez de diferentes tipos de Muestra
            como fuentes de ADN
   22. Sangre Seca (podrida).- Las muestras de sangre tomadas en
    tubos no estériles, sin preservantes y mantenidas a temperatura
    ambiente por períodos extendidos de tiempo, definitivamente no
    funcionan. Cualquier ADN que se pueda extraer de dichas
    muestras estará tan degradado que sencillamente no podremos
    amplificar fragmentos suficientemente grandes como para ser
    analizados.
   23. Tejidos mantenidos en Formol.- Biopsias o tejidos
    colectados durante autopsias que hayan sido puestos en frascos
    con formol definitivamente no funcionan.
   24. Cenizas Fúnebres.- Los tejidos cremados definitivamente
    no funcionan pues en las cenizas fúnebres no hay ADN
    rescatable .
                               LUIS ROSSI
          LA PRUEBA DEL ADN
   Es la prueba de máxima validez científica para
    determinaciones de parentesco en el mundo.
   La confiabilidad es tan grande como la que le merezca a
    usted el laboratorio al que le confía la prueba. Su
    resultado es contundente.
   Para cada persona examinada se analiza mediante la
    técnica STR (short tandem repeats) un total de 13
    marcadores genéticos (loci de secuencias repetitivas
    tetraméricas) en varios cromosomas del ADN que
    corresponden al llamado CODIS.


                           LUIS ROSSI
          LA PRUEBA DEL ADN
   El CODIS, según las pautas del F.B.I., constituye el
    conjunto de marcadores del ADN que permite
    identificar singularmente a una persona como para que
    sus resultados sean comparables con el banco de datos
    de identificación de individuos de los EE.UU.
   Esta combinación especial CODIS hace que el perfil
    genético obtenible para un individuo arroje típicamente
    una probabilidad de repetición al azar en otro individuo
    de 1 en 1015 (ó 1 en 1,000,000,000,000,000 personas) .....
    [recordemos que en el planeta Tierra hay 5,500,000,000
    humanos vivos y tan solo la cuarta parte de ellos son
    hombres en edad fértil.] Es entonces una prueba
    CONTUNDENTE.              LUIS ROSSI
         LA PRUEBA DEL ADN
   Técnicamente la prueba puede arrojar un
    resultado negativo (exclusión de paternidad ) con
    un 100% de certeza o uno positivo (inclusión de
    paternidad ) con un 99.9999% de certeza.




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            LA PRUEBA DEL ADN
   Aquí debemos hacer la precisión de que si no se dice 100% sino
    99.9999% es por razones meramente estadísticas. Hay solo dos
    casos teóricamente posibles en que se podría decir que alguien
    sí es el padre con un 100 % de certeza:
    –   a) Luego de haber hecho el análisis a TODOS LOS
        HOMBRES DEL PLANETA y haber descartado a los
        demás.
    –   b) Luego de haber analizado todos y cada uno de los 4,500
        millones de nucleótidos de la molécula de ADN del padre
        presunto.
   Naturalmente, ambas proposiciones son en la práctica
    imposibles y un 99.9999999% de certeza estadística es entonces
    perfectamente satisfactorio.
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          LA PRUEBA DEL ADN
 Método STR para la Prueba de Paternidad por ADN
 Los STR (short tandem repeats) son loci (lugares del ADN)
  que consisten de elementos secuenciales cortos y repetitivos
   que fluctúan en tamaño (3 a 7 pares de bases de longitud).
  Estas tandas repetitivas son abundantes y están ampliamente
  distribuídas en el genoma (conjunto total del ADN) humano.
   Los STR sucede que son una fuente muy rica de
    marcadores muy polimórficos los cuales pueden ser
    detectados y amplificados mediante la técnica conocida
    como PCR (reacción en cadena de la polimerasa).


                             LUIS ROSSI
          LA PRUEBA DEL ADN
    Método STR para la Prueba de Paternidad por ADN
   Los alelos (tipos) de estos loci se pueden diferenciar unos
    de otros según el número de copias de la secuencia
    repetitiva contenida dentro de la región previamente
    amplificada mediante la técnica de PCR.
   Para distinguir uno de otro se separan los fragmentos
    mediante electroforesis (migración en un campo eléctrico
    sobre una superficie de un gel) sobre geles de poliacrilamida
    capaz de distinguir los fragmentos en función de sus
    tamaños diferentes. Luego estos fragmentos pueden
    visualizarse usando detección por radiactividad,
    fluorescencia o coloración con sales de plata.
                              LUIS ROSSI
          LA PRUEBA DEL ADN
    Método STR para la Prueba de Paternidad por ADN
   En este método se usa un método de detección por
    fluorescencia, que es una metodología rápida, no-radiactiva
    que puede usarse para evaluar muy pequeñas cantidades de
    ADN humano (un nanogramo, es decir, una milmillonésima
    de gramo de ADN).
   El análisis mediante el método STR es más tolerante que
    otros métodos cuando se usa plantillas de ADN degradadas
    puesto que los productos de la amplificación por PCR
    miden menos de 400 pares de bases en longitud, estas
    resultan ser mucho más pequeñas que las obtenidas
    mediante análisis vía AMP-FLP o VNTR.
                             LUIS ROSSI
          LA PRUEBA DEL ADN
    Método STR para la Prueba de Paternidad por ADN
   Además de estas ventajas, los loci STR escogidos por este
    método contienen alelos de longitudes discretas y separables.
    Esto permite la construcción de escaleras alélicas que contienen
    fragmentos de las mismas longitudes que muchos de todos los
    alelos conocidos para cada locus.
   El método STR tiene un poder de discriminación de un hombre
    entre cada 5,180'000,000 individuos.
   Es importante notar que si la población mundial actual es de
    unos seis mil millones de personas, y suponemos que de ellos
    poco menos de la mitad son hombres y que de ellos sólo una
    fracción es una subpoblación masculina en edad fértil, pues
    entonces el poder de discriminación es prácticamente absoluto.
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         LA PRUEBA DEL ADN
Método RFLP para la Prueba de Paternidad por ADN
 Este es un método usado aún por varios laboratorios
  para la determinación de paternidad por ADN. Sin
  embargo, es un método antiguo y - en la práctica - es
  tecnológicamente obsoleto. Hoy en día el método más
  preciso y exacto es el Método STR.
   Para efectos de información histórica el método RFLP
    consiste de:
   1) El ADN es extraído de los leucocitos de la sangre.




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          LA PRUEBA DEL ADN
Método RFLP para la Prueba de Paternidad por ADN
   2) El ADN de la muestra es cirtado en fragmentos, los que
    resultan ser de tamaños diversos, precisamente porque estos
    tamaños dependen de la diversidad y variabilidad genética de la
    muestra.
   El nombre RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphisms)
    significa que se usa la propiedad de las enzimas de restricción
    para cortar regiones específicas del ADN que sucede que son
    muy variables(hipervariables) de individuo a
    individuo(polimorfismo).
   3) Los fragmentos de ADN son colocados en una superfcie
    gelatinosa(gel de agarosa) con el propósito de someterlos a una
    separación en base a su  tamaño.
                               LUIS ROSSI
        LA PRUEBA DEL ADN
Método RFLP para la Prueba de Paternidad por ADN
4) Se sumerge el gel en una solución conductora y luego se
corre la electroforesis.
5) Puesto que el gel de agarosa tiene poros, los fragmentos
más pequeños de ADN migrarán hacia el ánodo(polo
positivo) más rápidamente que los fragmentos de ADN
más largos.
6) Los fragmentos de ADN así separados se transfieren
luego por adhesividad a una membrana de nylon(Southern
blott).


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          LA PRUEBA DEL ADN
Método RFLP para la Prueba de Paternidad por ADN
   7) La membrana de nylon contiene ahora covalente y
    firmemente adheridos los fragmentos de ADN en la misma
    posición en que migraron sobre el gel durante el proceso
    de electroforesis.

    8) Esta membrana de nylon es expuesta a sondas
    marcadas de ADN. Estas sondas son pequeños
    fragmentos sintéticos de ADN de secuencia conocida y
    que corresponden a zonas selectas de hipervariabilidad
    del ADN humano. Las sondas suelen estar marcadas con
    isótopos radiactivos o con sustancias fluorescentes (por
    tanto, emisoras de luz).


                            LUIS ROSSI
          LA PRUEBA DEL ADN
Método RFLP para la Prueba de Paternidad por ADN
   9) La membrana de nylon luego se coloca contra una
    película de rayos X (si se usó sondas radiactivas) o
    fotográfica (si se usó sondas fluorescentes), la cual luego
    es revelada.

    10) Las bandas que se observan en la película revelada son
    típicamente así:
   Madre Hijo(a) Padre Supuesto #1 Padre Supuesto #2




                               LUIS ROSSI
          LA PRUEBA DEL ADN
Método RFLP para la Prueba de Paternidad por ADN
   En este ejemplo, el padre supuesto # 1 es el verdadero
    padre. A esto se le llama inclusión y a esta prueba se le
    asigna un Índice de Paternidad (PI) el cual se cuantifica
    tomando en cuenta la probabilidad (ya conocida por
    estudios horizontales en grupos raciales definidos) de que
    un fragmento (alelo) de tal tamaño aparezca en un
    individuo cualquiera.
   11) El proceso se repite varias veces usando la misma
    membrana de nylon, pero exponiéndola a diversas sondas.
    Cada sonda identifica áreas diferentes del ADN (que
    mapean en regiones diferentes de diferentes
    cromosomas).

    12) Los diferentes Índices de Paternidad se multiplican
                              LUIS ROSSI
    entre sí (pues estadísticamente se trata de eventos que
        LA PRUEBA DEL ADN
Explicación de los Resultados de Paternidad
 Los resultados se pueden explicar en una de 2
                    maneras:
   1. El padre presunto es excluido como padre
    biológico del niño(a).
    2. El padre presunto no puede ser excluido
    como padre biológico del niño(a) y esto se
    alcanza cuando la probabilidad de paternidad
    es de más de 99.9%


                       LUIS ROSSI
        LA PRUEBA DEL ADN
Explicación de los Resultados de Paternidad
 –   Los resultados luego detallan los patrones del ADN
     de los individuos a quienes se ha sometido a
     prueba.
 –   Todos los seres humanos tienen dos marcadores
     genéticos (ó "cifras" para efectos de esta
     explicación), para CADA sistema de ADN
     analizado. Un marcador genético fue heredado de
     la madre y el otro marcador genético
     obligatoriamente fue heredado de su padre
     biológico.


                         LUIS ROSSI
          LA PRUEBA DEL ADN
 Explicación de los Resultados de Paternidad
 Ejemplo de Exclusión.-
   Sistema    Madre   Hijo   Padre Presunto Índice de
                                             Paternidad

   D9S302      33     33        31            0.00
   9q31-33     30     32        30
   Puesto que tanto la madre como el hijo ambos tienen el
    marcador genético "33", conocemos que el hijo heredó el
    "33" de su madre. Por tanto, obligatoriamente el marcador
    genético "32" DEBE haber sido heredado de su padre
    biológico.
    Entonces, observando la cuarta columna veamos los
    marcadores genéticos del padre presunto: Él no tiene un
                              no puede ser el padre biológico.
    "32"; en consecuencia, élLUIS ROSSI
    El índice de paternidad para este sistema es 0.00 y, por
          LA PRUEBA DEL ADN
 Explicación de los Resultados de Paternidad
 Ejemplo de Inclusión.-
   Sistema        Madre Hijo Padre Presunto       Índice de
                                                   Paternidad
   D9S302         37      33       35.2           8.37
   9q31-33        33      30       30
   La madre contribuyó el marcador genético "33" a su hijo.
    Por tanto, obligatoriamente el marcador genético "30"
    DEBE haber sido heredado de su padre biológico.
   Entonces, observando la cuarta columna veamos los
    marcadores genéticos del padre presunto: Él sí tiene un
    "30"; en consecuencia, él ADN en este sistema sí cuadra y,
    por tanto el padre presunto PUEDE ser el padre verdadero.
                             LUIS ROSSI
    El índice de paternidad es un indicador de qué tan común
          LA PRUEBA DEL ADN
Explicación de los Resultados de Paternidad
   Es importante resaltar que para que el padre presunto NO
    sea excluido, TODOS los sistemas de ADN probados
    deben cuadrar. Y se debe probar tantos sistemas de ADN
    como sean necesarios hasta obtener una Probabilidad de
    Paternidad mayor que 99.9%.

    Considerando que en este caso se trata de eventos
    estadísticos mutuamente excluyentes, los índices de
    paternidad obtenidos para cada sistema se deben
    multiplicar entre sí … a esto se le llama el CPI (Índice de
    Paternidad Combinado).


                              LUIS ROSSI
         LA PRUEBA DEL ADN
Explicación de los Resultados de Paternidad
   Puesto que la Probabilidad de Paternidad es una
    expresión estadística del llamado Índice de Paternidad
    Combinado (CPI), para que la probabilidad de paternidad
    sea diferente que cero (y, por tanto, mayor que 99.9%),
    ninguno de los números en la columna de Índice de
    Paternidad deberá ser igual a cero.




                            LUIS ROSSI

								
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