The cell - PowerPoint by HC120313112849

VIEWS: 309 PAGES: 32

									        เทคนิคต่างๆ
ในการเพาะเลี้ยงเซลล์/เนื้อเยื่อสัตว์
             หัวข้อบรรยาย
   เทคนิคปลอดเชื้อ (Aseptic Techniques)
   เทคนิคการทา Subculture
   การโคลนเซลล์เดี่ยว (Single-cell Cloning)
   การแยกกลุ่มเซลล์ (Colony Picking)
   Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS)
   การคัดเลือกเซลล์โดยใช้ Magnetic Beads
   การศึกษาปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์ 2 ชนิด
               ่
    เทคนิคการเชือมเซลล์ (Cell Fusion)
   เทคนิค Cell Synchronization
 1. เทคนิคปลอดเชื้อ (Aseptic Technique)
 การมีการปนเปื้อนของเชื้อจุลินทรีย์มีผลเสียหลายอย่าง
                            ่
     ผลการทดลองคลาดเคลือน/เชื่อถือไม่ได้
    สารอาหารถูกใช้หมดเร็วกว่าปรกติ

    มีการปลดปล่อยของเสียออกมามากกว่าปรกติ

    ต้องทิ้ง culture นั้นไป

    สิ้นเปลืองงบประมาณและเวลา
              เทคนิคปลอดเชื้อ (ต่อ)

 วิธีป้องกันการปนเปื้อน
    การรักษาความสะอาดส่วนตัว
    ใช้ยาปฏิชีวนะ (antibiotics) ในอาหารเพาะเลี้ยง

    การฆ่าเชื้อบริเวณพื้นผิวที่ทางาน (UV, 70% alcohol)

    ใส่ใจในทุกขั้นตอนของการทางาน พยายามอย่าให้มีสิ่ง

     แปลกปลอมตกลงไปในอาหารหรือภาชนะเพาะเลี้ยง
     เมื่อพบการปนเปื้อน (contamination)
   ปิดผาภาชนะเพาะเลี้ยงที่มีการปนเปื้อนนั้นให้แน่น
   พ่นแอลกอฮอล์เพื่อฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ที่อาจลุกลามออกมาที่
    ปากภาชนะ
   ทิ้งภาชนะเพาะเลี้ยงที่มีการปนเปื้อนนั้นลงในถังที่แยก
    เฉพาะสาหรับ biohazard material เพื่อการกาจัดทิ้งอย่าง
    เหมาะสม
            2. Subculture Technique
 เมื่อเพาะเลี้ยงเซลล์/เนื้อเยื่อไปได้สักระยะหนึ่ง
    ความหนาแน่นของเซลล์จะมากขึน      ้
    สารอาหารจะถูกใช้ไปมาก

    ของเสียเกิดการสะสมในอาหารเพาะเลี้ยง

    สภาวะแวดล้อมไม่เหมาะต่อการเจริญเติบโตของเซลล์

    จาเป็นต้องมีการแบ่งเซลล์บางส่วนออกมาแยกเลี้ยงในอาหาร

     เพาะเลี้ยงใหม่ (เรียกว่าการทา subculture)
            ขั้นตอนการทา subculture
   ทาให้เซลล์หลุดออกจากภาชนะเพาะเลี้ยง และทาให้เป็น
    เซลล์เดี่ยวๆ
   Dilute เซลล์ในอาหารเพาะเลี้ยง
   นับจานวนเซลล์ (ใช้ hemocytometer หรือวิธีอื่นๆ)
   แบ่งเอาเซลล์มาตามจานวนที่ต้องการ (เช่น 1 ล้านเซลล์
    ต่อ T-75 flask) เพื่อนาไปเพาะเลี้ยงต่อไป
   เติม fresh medium
การแยกเซลล์ที่ได้จากการเพาะเลี้ยงให้เป็นเซลล์เดี่ยวๆ

    ทาลาย adhesion molecules โดยการย่อยด้วยเอนไซม์
     trypsin
    หรือยับยั้งการทางานของ adhesion molecules โดย
     การใช้ chelating agents เช่น EDTA
    หรือการทาให้เซลล์หลุดออกจากพื้นผิวโดยใช้แรงทาง
     กายภาพ
การนับเซลล์โดยใช้ Hemocytometer

                    The volume of
                    one quadrant
                    is known to be
                    0.1 ml
มาลองคานวณหาความเข้มข้นของเซลล์กันดีกว่า
 การนับเซลล์โดยใช้ Coulter Counter
Amp         Readout


         The counter
         detects change in
         electrical
         conductance of a
         small aperture as
         fluid containing
         cells is drawn
         through. The cell,
         a non-conducting
         particle, alters the
         effective cross-
         section of the
         conductive
         channel.

                         http://www.wps.com/about-WPS/WPS/coulter-counter.JPG
3. การโคลนเซลล์เดี่ยว (Single-cell Cloning)
   ใช้วิธี limiting dilution
                                           X
   5 cells/ml                         X

   แยกเลี้ยงใน 96-well plate     X     X

   0.1 ml/well
   ส่องดูด้วยกล้องจุลทรรศน์
   เลือกเฉพาะ well ที่มีเซลล์
                                 96-well Plate
    เดียว
  4. การแยกกลุ่มเซลล์ (Colony Picking)


                + trypsin   หรือ

Cloning Rings
                                              ่
                                   การเลือกกลุมเซลล์
                                   โดยใช้ pipette tip
  5. Fluorescence-
      Activated
     Cell Sorting
       (FACS)
            เซลล์ย้อมด้วย
            Fluorochrome-labeled
            monoclonal antibodies

http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/FACS.gif
http://www.gsf.de/Forschung/Institute/zs/common/principle123.gif
  การใช้ FACS ในการหาจานวนเซลล์ในแต่ละประชากร
  วิธีที่ 1                            วิธีที่ 2




แกน X = ความเข้มของ fluorescence1   แกน X = ความเข้มของ fluorescence
แกน Y = ความเข้มของ fluorescence2   แกน Y = จานวนเซลล์
6. การคัดเลือกเซลล์
โดยใช้ Magnetic
Beads                  เซลล์ติดฉลากด้วย
                       antibody และ
                       magnetic beads




            แม่เหล็ก
7. การศึกษาปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์ 2 ชนิด
 ใช้วิธีการเพาะเลี้ยงเซลล์ 2 ชนิดร่วมกัน (co-culture
  technique) แล้วสังเกตปฏิสัมพันธ์ที่เกิดขึ้น
    ปฏิสัมพันธ์แบบที่ต้องอาศัยการสัมผัสกันโดยตรงของเซลล์
     (contact-dependent interaction)
                                                ้
    ปฏิสัมพันธ์แบบที่อาศัยการหลั่งสารออกมากระตุน

     (paracrine interaction)
                               อยากรู้ว่าประชากรเซลล์ 2 ประชากร
                                ที่เราสนใจมีปฏิสัมพันธ์กันแบบใด
          ปฏิสัมพันธ์ของเซลล์ 2 แบบ




Contact-dependent signaling      Paracrine signals are released
requires cells to be in direct   by cells into the extracellular
membrane-to-membrane contact     medium in their
with each other.                 neighborhood and act locally.
การศึกษาปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์ 2 ชนิด โดยใช้
       Transwell Co-culturing System




   ใช้ทดสอบว่าปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์ที่สังเกตเห็นนั้น
    เป็นแบบ contact-dependent หรือ paracrine
                 http://www.corning.com/lifesciences/cell_culture/images/transwell%20diag.gif
ตัวอย่าง Transwell Culture Systems




           http://www.drzeydanli.com.tr/docs/cellculture/transwell/transwell.html
              8. เทคนิค Cell Fusion
 Cell fusion เป็นการรวมตัวของเซลล์ 2 เซลล์ เข้าเป็น
  เซลล์เดียว เรียกเซลล์ที่ได้ว่า “heterokaryon”
 ระยะเวลาที่ heterokaryon จะมีชีวิตอยู่ได้ขึ้นอยู่กับชนิด
  ของเซลล์ที่นามาใช้ในการทา cell fusion
 Cell fusion เป็นเทคนิคที่ทาให้มีหลักฐานสนับสนุนว่า
  โปรตีนบนเยื่อหุ้มเซลล์สามารถเคลื่อนที่ไปมาในแนว
  ระนาบได้
การใช้เทคนิค cell fusion เพื่อพิสูจน์ว่าโปรตีนที่อยู่บนเยื่อหุ้มเซลล์
สามารถเคลื่อนที่ไปมาบนระนาบของเยื่อหุ้มเซลล์ได้
                                                        Campbell and Reece, 2002
                 Cell Fusion (ต่อ)
 และเป็นเทคนิคที่ใช้ในการระบุว่ายีนที่สนใจอยู่บน
  โครโมโซมใด
 Heterokaryons มักจะสูญเสียโครโมโซมบางแท่งไป (ไม่มี
  ความเสถียรทางพันธุกรรม)
 Mouse-human hybrid cells มักจะสูญเสียโครโมโซมของ
  เซลล์มนุษย์
 ตัวอย่าง: hybrid cells ที่มีโครโมโซมมนุษย์แท่งที่ 11
  เท่านั้นที่สร้างฮอร์โมน insulin ของมนุษย์ได้
                สรุปว่ายีนอินซูลินของมนุษย์อยู่บนโครโมโซมแท่งที่ 11
  การทา Cell Fusion
                   ใช้ inactivated virus หรือ
                    สารเคมี polyethylene glycol
                   เปลี่ยนแปลงคุณสมบัติของ cell
                    membranes ให้ fuse กันได้ง่าย
                    (เพิ่ม membrane fluidity)
                   คัดเลือก fused cells โดยการ
                    เพาะเลี้ยงใน selective medium

http://biology.kenyon.edu/slonc/bio3/2000projects/marshall_g/my_cell_fusion.JPG
                    Hybridoma
 เป็นเทคนิคที่ใช้ในการผลิต monoclonal antibody

 เป็น cell fusion ระหว่าง B lymphocyte กับ
  “immortal” B lymphocyte tumor (myeloma)
 เซลล์ hybridomas มีคุณสมบัติผสมของทั้ง 2 เซลล์ คือ
  เพาะเลี้ยงได้นานและสามารถผลิตแอนติบอดีได้
 Selective medium ที่ใช้คือ HAT medium
  (hypoxhantine, aminopterin and thymidine)
Hybrid cells are recovered through their ability to survive in HAT (hypoxhantine, aminopterin and
thymidine; so-called Littlefield's medium: Science 145: 709, 1964) whereas the parent myelomas
die in this medium because of mutation at the Tk1 (thymidine kinase 1, chromosome 11) or Hprt
(hypoxhantine guanine phosphoribosyl transferase, X chromosome) loci.

                                                 http://nfs.unipv.it/nfs/minf/dispense/immunology/somcellfus2.jpeg
       9. เทคนิค Cell Synchronization
 คือการทาให้เซลล์อยู่ในระยะเดียวกันของ cell cycel

    วิธี mitotic “shake-off”
    วิธี blockade (ได้แก่ S-phase inhibition และ Nutritional

     deprivation)
 มีประโยชน์คือใช้ศึกษา cell cycle progression และการ
  ทา karyotype
                  Mitotic Shake-off
 เซลล์ที่กาลังแบ่งเซลล์อยู่ในระยะ mitosis จะมีลักษณะกลม
  และเกาะกับพื้นผิวที่ใช้เพาะเลี้ยงอย่างหลวมๆ
 การเคาะหรือเขย่าภาชนะเพาะเลี้ยงเบาๆ (shaking off) จะ
  ทาให้เซลล์กลุ่มนี้หลุดออกมา
 ใช้ได้ผลดีกับ CHO cells และบาง sublines ของ HeLa cells
                          o
 การ incubate เซลล์ที่ 4 C, 0.5-1 ชั่วโมง, แล้วนากลับเข้าตู้
  บ่ม 37 oC เป็นเวลา 2-3 ชั่วโมง จะช่วยเพิ่ม yield
              DNA systhesis inhibition
   หยุด cell cycle ไว้ที่ S-phase
   ใช้ Thymidine, hydroxyurea, cytosine arabinoside,
    aminopterin, etc.
   ผลข้างเคียงคือเซลล์ส่วนหนึ่งจะตายไป และเซลล์
    บางส่วนไม่ถูก block
http://www.med.unibs.it/~marchesi/cellcycle.gif
                Nutritional Deprivation
 หยุด cell cycle ไว้ที่ G0-phase
 ทาได้โดยการเลี้ยงเซลล์ในอาหารเพาะเลี้ยงที่ไม่มี serum
  หรือ isoleucine เป็นเวลา 24 ชั่วโมง
 จากนั้นเติมสิ่งที่ขาดหาย เซลล์จะเริ่ม cell cycle อีกครั้ง
 ได้ผลดี (>80% synchrony) ในครั้งแรก
    ครั้งที่ 2 ได้ประมาณ 60% synchrony
    ครั้งที่ 3 ไม่ได้ผล

								
To top