Estrazione DNA genomico da Sangue Intero

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Estrazione DNA genomico da Sangue Intero Powered By Docstoc
					Estrazione DNA genomico
    da Sangue Intero
Componenti del Kit di Estrazione:

- Lysis / Binding Buffer
- Digestion Buffer
- Wash Buffer 1
- Wash Buffer 2
- Elution Buffer
- Proteinase K in storage Buffer
- Spin Columns
                         Descrizione
Indipendentemente dalla tecnica di estrazione usata, essa deve rispondere
a due requisiti principali: la resa (>4ug) e la purezza (A260/280>1,70), intesa
sia come presenza in soluzione dell’acido nucleico in esame, sia come
assenza di sostanze contaminanti che, legandosi ai reagenti in soluzione,
potrebbero modificare i risultati dell’esperimento successivo (PCR,
Sequenziamento, Restrizione…)

Il kit permette una rapida ed efficiente purificazione del gDNA (DNA
genomico di dimesioni comprese tra i 20-50 Kb) dalle cellule nucleate del
Sangue Periferico.

Il kit si basa sul legame selettivo del DNA alla membrana di silice in
presenza di Sali Caotropici, che creano ponte cationico tra il DNA e la
membrana.
          NB. Important Guidelines
• Maintain a sterile environment, pipette, tips and microcentrifuge tubes when
handling DNA to avoid any contamination from DNases

• Ensure that no DNases are introduced into the sterile solutions of the kit

• To minimize DNA degradation, perform lysate preparation steps quickly, and
avoid repeated freezing and thawing of DNA samples

• Handle all blood and tissue samples in compliance with established institutional
guidelines and take the appropriate precautions (wear a laboratory coat,
disposable gloves, and eye protection) when handling blood and tissue samples.

• When processing blood and tissue samples, the eluates collected during wash
steps contain biohazardous waste. Dispose the eluate and collection tubes
appropriately as biohazardous waste.
                            Percorso di Estrazione
Dopo aver scelto il campione biologico da cui estrarre il materiale genetico, il percorso di
   estrazione e purificazione prevede quattro fasi:

1.    Lisi delle cellule. La dissoluzione della cellula (distruzione della membrana) è una fase
     delicata in quanto risultato di due eventi contrastanti:
       rompere le membrane (cellulari e nucleari) del materiale di partenza
       non alterare gli acidi nucleici da analizzare.

2.     Separazione e recupero dell’acido nucleico dalla soluzione contenente il lisato
     cellulare.
       Un primo metodo (…antico) per effettuare tale operazione prevede l’uso di solventi
           organici (come fenolo o cloroformio), che consentono la separazione degli acidi
           nucleici dai contaminanti (proteine); successivamente, dopo centrifugazione, gli acidi
           nucleici vengono recuperati in soluzione acquosa.
       Sono stati ormai sviluppati protocolli chimici come la metodica di separazione che
           prevede l’adsorbimento del DNA sulla superficie di una matrice di gel di silice in
           presenza di sali caotropici (in commercio si trovano diversi kit di separazione basati
           su questo principio).

3. Eluizione gDNA: Si separa il gDNA adsorbito dalla resina adsorbente della colonnina,
   mediante lavaggio con soluzione (eluente) a bassa concentrazione salina.
                  Percorso di Estrazione


                     Membrana di silice




Proteinasi K +                 NB: Per     Eluente (Eluition Buffer o
Sangue Intero +                rimuovere   H2O) a bassa
Lysis / Binding                impurità.   concentrazione salina
Buffer
                                     Purification Protocol

1. Set a water bath or heat block at 55°C.
2. Add 20 μl Proteinase K to a sterile microcentrifuge tube.
3. Process blood samples: add up to 200 μl fresh or frozen blood sample to a sterile microcentrifuge tube
4. Transfer 200 μl of blood in PBS to the tube containing Proteinase K from Step 2.
5. Add 200 μl PureLink™ Genomic Lysis/Binding Buffer and mix well by vortexing to obtain a homogenous
solution.
6. Incubate at 55°C for 10 minutes to promote protein digestion.
7. Add 200 μl 96-100% ethanol to the lysate. Mix well by vortexing to yield a homogenous solution.
8. Add the lysate (~640 μl) to the spin column.
9. Centrifuge the column at 10,000 × g for 1 minute at room temperature.
10. Discard the collection tube and place the spin column into a clean PureLink™ Collection Tube
11. Add 500 μl Wash Buffer 1 prepared with ethanol (page 2) to the column.
12. Centrifuge column at 10,000 × g for 1 minute at room temperature.
13. Discard the collection tube and place the spin column into a clean PureLink™ collection tube
14. Add 500 μl Wash Buffer 2 prepared with ethanol (page 2) to the column.
15. Centrifuge the column at maximum speed for 3 minutes at room temperature. Discard collection tube.
10. Place the spin column in a sterile 1.5-ml microcentrifuge tube for eluition.
11. Add 25-200 μl of PureLink™ Genomic Elution Buffer to the column.
12. Incubate at room temperature for 1 minute. Centrifuge the column at maximum speed for 1 minute at RT.

The tube contains purified genomic DNA. Use DNA for the desired downstream application or store the
purified DNA at 4ºC (short-term) or -20°C (long-term).

				
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posted:3/6/2012
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