Docstoc

5.1_sds-page

Document Sample
5.1_sds-page Powered By Docstoc
					5. SEPARACE A DETEKCE
       PROTEINŮ II
     5.1. SDS-PAGE

     Anna Kotrbová-Kozak
       Jana Vobořilová,
       Vlasta Fürstová,
        Tereza Kopská
SDS-PAGE
(= sodium dodecylsulphate-polyacrylamide
gel electrophoresis)

-metoda pro separaci proteinů dle jejich
velikosti
Jednotlivé kroky experimentu
*Příprava polyakrylamidových gelů
*Příprava vzorků pro SDS-PAGE
*Povaření vzorků při 95C po dobu 4 min.
*Aplikace vzorků na gel
*Vlastní elektroforesa probíhá při
konstantním napětí 200 V po 30-40 min
*Barvení gelu pomocí Coomassie Blue
*Odbarvení gelu MetOH/HOAc
*Identifikace myosinu a aktinu ve vzorcích
tkaně pomocí proteinového markeru
 Separace proteinů v akrylamidovém gelu

            1 2 3 4 5       6 7


                                  Myosin (těžký řetězec)




                                  Aktin
                                  Tropomyosin

                                  Myosin (lehký řetězec)

                                  Myosin (lehký řetězec)

                                  Myosin (lehký řetězec)



1. Marker        5. Aktin
2. Játra         6. Myosin
3. Srdce         7. Marker
4. Sval
-proteiny jsou tepelně denaturovány ve
vzorkovém pufru obsahujícím dodecyl sulfát
sodný (SDS)- zachována je tak pouze jejich
primární struktura
-denaturované proteiny mají vláknitý tvar a
stejný záporný náboj daný vazbou SDS –
migrace tedy závisí pouze na jejich
molekulové hmotnosti
Pohyb takto upravených proteinů v
elektrickém poli:
-proteiny mající negativní náboj se pohybují
směrem ke kladně nabité elektrodě
   Jak funguje SDS-PAGE?
                             s-s
•Negativně nabité
                                   SDS, zahřátí
proteiny se pohybují
ke kladné elektrodě                   Proteiny s
                                      SDS


•Menší proteiny se
pohybují rychleji
                         -
•Proteiny se rozdělují
 podle velikosti
(molekulové
hmotnosti)               +
Co obsahuje vzorkový pufr pro
SDS-PAGE?
*Tris pufr utváří vhodné pH
*SDS (dodecyl sulfát sodný) detergent
poskytující proteinům negativní náboj
*Glycerol vzhledem ke své vyšší specifické
hmotnosti zajišťuje klesnutí vzorku ke dnu
jamky v gelu po nanesení
*“Bromophenol Blue“ barvivo umižňující
sledovat průběh elektroforézy (pohyb čela v
gelu)
SDS-Polyacrylamide Gel
Electrophoresis (SDS-PAGE)
                                              CH3
                                              CH2

•SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) aniontový       CH2
                                              CH2
detergent                                     CH2
                                              CH2
   –solubilizuje a denaturuje proteiny        CH2
                                              CH2

   –dodává proteinům negativní náboj          CH2
                                              CH2

   Většina proteinů váže SDS ve stejném       CH2
                                              CH2
   poměru, asi 1,4 g SDS/g proteinu           O
                                          O           O
                                              S
                                              O
                                                  -
•Zvýšená teplota denaturuje proteiny

                                          SDS
Proč používat akrylamidový gel k
separaci proteinů?
   Akrylamidový gel: pevná a inertní matrix
   Ideální pro separaci proteinů
   Menší velikost pórů než u agarosy
   Proteiny jsou menší než
    intaktní chromoz. DNA


    Gel je vytvořen polymerací aktylamidu a N´,N´-
    methylenbisakrylamidu zahájenou volnýmí radikály
    vzniklými při rozkladu persíranu amonného.
Molekulová hmotnost proteinů
   velikost měřena v daltonech (Da) či kilodaltonech (kDa)
   Dalton       = jednotka atomové hmotnosti
                 = přibližně se rovná hmotnosti atomu
                 vodíku (1,66 x 10 -24 g)
                 = definován také jako 1/16 hmotnosti atomu kyslíku

   Průměrná aminokyselina = 110 Da

   Průměrný nukleotidový pár = 649 Da
Hlavní proteinové složení svalů
Protein              kDa          Function
titin                3000         center myosin in sarcomere
dystrophin           400          anchoring to plasma membrane
filamin              270          cross-link filaments into gel
myosin heavy chain   210          slide filaments
spectrin             265          attach filaments to plasma
   membrane
nebulin              107          regulate actin assembly
a-actinin            100          bundle filaments
gelosin              90           fragment filaments
fimbrin              68           bundle filaments
actin                42           form filaments
tropomyosin          35           strengthen filaments
myosin light chain   27           slide filaments
troponin (T, I, C)   30, 19, 17   mediate regulation of
    contraction
thymosin             5            sequester actin monomers
Imunochemická detekce proteinů
= WESTERN Blot Analýza
*transfer proteinů separovaných pomocí
   SDS-PAGE z gelu na membránu
*identifikace proteinu pomocí
   imunodetekce, tj. komplexu primární a
   případně sekundární protilátky
*vizualizace pomocí barevné reakce nebo
   chemiluminiscence
WESTERN blot (metoda detekce
proteinu):

-název vznikl jako slovní hříčka dle metody
Southern blot (technika detekce DNA)
zavedené Edwardem Southernem
-analogicky byl vytvořen také název pro
metodu NORTHERN blot (technika
detekce RNA
přez nesporné kvality Lysenkovy a Mičurinovy vědecké školy se sovětským vědcům nepodařilo
vyvinou vlastní metodu Eastern blotu

				
DOCUMENT INFO
Shared By:
Categories:
Tags:
Stats:
views:6
posted:2/25/2012
language:Latin
pages:15