Manual Laboratorio

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					      INSTITUTO VANGUARDIA DE HERMOSILLO A.C.
               SECCIÓN PREPARATORIA




       MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE

             TEMAS SELECTOS DE BIOQUÍMICA

                      Semestre 08-1




     Nombre del alumno : __________________________


  Titular de la materia          Titular del laboratorio


Q .B. Magnolia D. Avilez L.    Q.B. Guadalupe Martínez F.




                                      Hermosillo, Sonora.
                  PRÁCTICAS A REALIZAR

PRÁCTICA Nº 1 :   PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS

PRÁCTICA Nº 2 :   ALMIDÓN

PRÁCTICA Nº 3 :   OBTENCIÓN DE GLUCÓGENO HEPÁTICO A PARTIR DE HÍGADO DE
                  POLLO

PRÁCTICA Nº 4 :   REACCIONES CARACTERÍSTICAS DE LOS LÍPIDOS

PRÁCTICA Nº 5 :   OBTENCIÓN DE LECITINA Y COLESTEROL A PARTIR DE HUEVO

PRÁCTICA Nº 6 :   PROTEÍNAS

PRÁCTICA Nº 7 :   ENZIMAS

PRÁCTICA Nº 8 :   OBTENCIÓN DE ACIDOS NUCLÉICOS A PARTIR DE CÉLULAS DE
                  HÍGADO (OPCIONAL)

PRÁCTICA N° 9 :   MITÓSIS (OPCIONAL)
                                   PRÁCTICA 1
                 PRUEBAS PARA IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS
                                  EN ALIMENTOS
                                 (en dos partes)

OBJETIVO :
Realizar las reacciones características para detectar carbohidratos en alimentos.

PROCEDIMIENTO :

I.- PRUEBA DE FEHLING

1. Tome 5 tubos de ensaye y numérelos.

2. Agrega pequeñas cantidades de las siguientes sustancias a cada uno de los tubos :
       tubo 1 : hígado picado
       tubo 2 : clara de huevo
       tubo 3 : leche
       tubo 4 : manzana rallada
       tubo 5 : papa rallada en agua

3.   Realiza la prueba de Fehling como se hizo en la práctica anterior (agregando 5 mL del reactivo de
     Fehling a cada tubo).

                 TUBO                           FEHLING
                 1. hígado picado
                 2. clara de huevo
                 3. leche
                 4. manzana rallada
                 5. papa rallada en agua

II. PRUEBA DEL LUGOL PARA EL ALMIDON

1. En un tubo de ensaye chico, añade 5 mL de agua de la llave y unas cuantas gotas de solución de yodo.
   Observe el color característico del yodo. Agrega unas cuantas gotas de solución de almidón y anota tus
   observaciones.
2. Numera cuatro tubos de ensaye pequeños.
3. Agrega a los tubos pequeñas cantidades de las siguientes sustancias.

         Tubo 1 : papa rallada en agua
         Tubo 2 : Manzana rallada en agua
         Tubo 3 : clara de huevo

4.   Agrega a cada uno de los tubos unas cuantas gotas de solución de yodo y anota tus observaciones en
     la tabla, escribiendo el signo (+) si la prueba es positiva y (-) si no lo es.
                TUBO                                     LUGOL
                tubo1 papa rallada en agua
                tubo 2 manzana rallada en agua
                tubo 3 clara de huevo




                              REACCIONES CARACTERÍSTICAS
                                         PARA
                           IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS


OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA :
Estudiar algunas propiedades de los carbohidratos.

PROCEDIMIENTO :

I .- PRUEBAS DE SOLUBILIDAD EN AGUA
1. Tome 5 tubos de ensaye y numérelos. Al tubo Nº 1 agrega una pequeña cantidad de glucosa
   (dextrosa), al tubo 2 sacarosa, al tubo 3 almidón, al tubo 4 miel de abeja y al tubo 5 agrega agua,
   este último tubo será el blanco.
2. Agrega agua destilada a los tubos, agita fuertemente y anota en la tabla con una (+) si es soluble y con
   el signo (-) si es insoluble.

   TUBO                                  SOLUBLE                         INSOLUBLE
   1 glucosa
   2 sacarosa
   3 almidón
   4 miel de abeja
   5 blanco

3. Separa dos porciones de cada tubo ya que servirán para efectuarles las pruebas siguientes .

II.- REACCIÓN DE FEHLING
1. Tome 5 tubos de ensaye y numérelos del 1 al 5.
2. Pipetee 5 ml de solución de glucosa al tubo 1 ; 5 ml de solución de fructosa al tubo 2 ; 5 ml de solución
     de sacarosa al tubo 3 ; 5 ml de solución de lactosa al tubo 4 y 5 ml de solución de maltosa al tubo 5.
3. Agregue 5 ml del reactivo de Fehling a cada uno de los tubos.
4. Coloque al mismo tiempo los 5 tubos en un baño de agua hirviendo y anote el tiempo.
5. Una vez que aparezca el precipitado color rojo ladrillo característico en la mayoría de los tubos (de uno
     a tres minutos), saque todos los tubos del agua y colóquelos en una gradilla.
6. Anote sus resultados, indicando cuales fueron los carbohidratos que dieron positiva la prueba y el
   tiempo en que apareció el precipitado en cada tubo. Los tubos con precipitado son los        que
   contienen carbohidratos reductores.
7. Una vez anotados sus resultados lave inmediatamente los tubos donde hubo preciptado, pues si se
   tarda, luego no se podrá quitar la mancha del precipitado.

IV.- REACCIÓN DE BARFOED

1.   Repita los pasos 2 y 3 de la reacción anterior.
2.   Agregue 5 ml del reactivo de Barfoed a cada uno de los tubos.
3.   Coloque al mismo tiempo los 5 tubos en agua hirviendo y anote el tiempo.
4.   Espere hasta 10 minutos, observando cuidadosamente la aparición de precipitados, y el tiempo en que
     esto sucede. Anote sus resultados indicando que tubos fueron positivos para la prueba. Estos serán los
     que contengan carbohidratos disacáridos.


V.- REACCIÓN DE SELIWANOFF

1.- Coloque en la gradilla 3 tubos de ensaye y numérelos.

2.- Pipetee 1 ml de xilosa al tubo 1 ; 1 ml de glucosa al tubo 2 y 1 ml de fructosa al tubo 3.

3.- Agregue 5 ml de reactivo de Seliwanoff a cada uno de los tres tubos.

4.- Anote sus resultados en cuanto a aparición de color y tiempo. Aquellos tubos que den positiva la
reacción serán los que contengan cetohexosas.

CUESTIONARIO

1.   Investiga el fundamento de la reacción de Benedict y para que se usa .
2.   En base a las pruebas de solubilidad efectuadas diga si los siguientes carbohidratos se disuelven en
     agua :

1        Lactosa ____________________
2        Celulosa ___________________
3        Ribosa____________________
4        Maltosa ____________________
5        Galactosa __________________

3.   Deduzca si las siguientes sustancias darían positiva o negativa la prueba de Benedict :

1        Jugo de uva _________________________
2        Leche ______________________________
3        Sacarina ____________________________
4        Algodón ____________________________
5        Papa _______________________________
6        Hígado _____________________________
7        Jugo de fruta ________________________
8        Manteca ____________________________

5.   En que se diferencian las propiedades del azúcar común y de la miel.


6. Investiga el fundamento de la reacción de Fehling, de Barfoed y de Seliwanoff y para que sirven.

7.   En el laboratorio había unos frascos uno rotulado Fructosa otro glucosa y otro lactosa, pero al hacerse
     la limpieza se cayeron las etiquetas y ahora no se sabe cual es cual. Que pruebas se pueden hacer
     para etiquetarlos correctamente.
                                          PRÁCTICA Nº 2

                                               ALMIDÓN

OBJETIVO : Estudiar algunas propiedades del almidón.

FUNDAMENTO DE LA PRÁCTICA :

1.   Obtención del almidón :

La papa es un tubérculo que almacena gran cantidad de almidón, por lo que es muy sencillo obtenerlo de
esa fuente. Basta con raspar la papa para hacer una pulpa fina, y eliminar por filtración la parte gruesa
insoluble de celulosa, para obtener una buena suspensión de granos de almidón.

2.   Observación al microscopio :

Los granos de almidón son de tamaño microscópico, por lo que hay que hacer una preparación y llevarla a
observación al microscopio. Para observarlos mejor y, si es posible, hacer visibles sus capas concéntricas
se añade un poco de lugol, que es una mezcla de iodo con ioduro de potasio en agua, lo cual va a teñir
azul los granos de almidón.

3.   Temperatura de gelatinización :

El material de los granos de almidón es una mezcla de sustancias diferentes con estructuras y
propiedades distintas. Cuando el almidón se trata con agua hirviendo, el almidón de unas partes del grano
se solubiliza y sale del grano, quedando otra parte del almidón que permanece insoluble. Esta porción
insoluble de los granos, absorbe agua y se hincha para formar una esfera elástica, y toda la masa se
concierte en una pasta de almidón. Este proceso de gelatinización sucede siempre a una temperatura
definida, que es la que se pretende determinar en esta parte de la práctica.
NOTA : No confundir almidón soluble con amilosa y almidón insoluble con amilopectina, porque no es
correcto. Ambos almidones son mezclas de amilosa y amilopectina.

4.   Complejo Iodo-Almidón y su reversibilidad

La obtención de una sustancia colorida al reaccionar el iodo con el almidón se cree se debe a la formación
de un complejo de coordinación entre las miscelas de almidón y de iodo. Estas miscelas están formadas
por cadenas polisacáridas enrolladas en hélice. El iodo puede colocarse centralmente en estas hélices. El
color depende del largo de la sección lineal de la molécula de almidón. Por eso la amilosa pura, que es el
polisacárido exclusivamente lineal dará con el iodo el color más intenso de un azul profundo. La
amilopectina dará un color azul violeta mientras que el glucógeno que es la molécula más ramificada dará
un color café rojizo. La celulosa no da reacción de color con el iodo. Las dextrinas formadas por la
hidrólisis del almidón dan un color que varía de café rojizo a la ausencia de color, dependiendo del tamaño
de la molécula.
El color disminuye cuando la temperatura aumenta, hasta desaparecer por completo, y se intensifica al
bajar nuevamente la temperatura. Esto indica la formación y deformación de los complejos de
coordinación formados entre el iodo y el almidón. La reacción del iodo con el almidón nos sirve para
determinar el grado de hidrólisis del almidón.

5.   Hidrólisis del almidón :

El almidón es la reserva alimenticia de las plantas, pero las células para la obtención de energía no
pueden metabolizarlo, sino que es necesario que lo degraden por hidrólisis hasta sus constituyentes
monosacáridos o glucosas, para que estos puedan metabolizarse en los caminos energéticos. Las células
llevan a cabo la hidrólisis a través de procesos enzimáticos , pero en el laboratorio podemos llevarla a
cabo con ácido mineral, obteniendo el mismo resultado.
El curso de la hidrólisis se puede seguir de dos maneras. Por la desaparición de la reacción con el iodo a
medida que avanza la hidrólisis, o por la formación de azúcares reductores. Mientras mas hidrolizado este
el almidón, mas azúcares reductores habrá y menor será la reacción con el iodo hasta hacerse totalmente
negativa.


MATERIAL

Vaso de precipitado de 600 ml                                  Gradilla, 10 tubos de ensaye chicos
Vaso de precipitado de 250 ml                                  Mechero, tripié y tela de adbesto
Vaso de precipitado de 50 ml                                   Vidrio de reloj grande
Pipeta de 5 ml                                                 Termómetro
Agitador                                                       1 portaobjetos y 1 cubreobjetos

PROCEDIMIENTO
I.- OBTENCIÓN DE ALMIDÓN

1.   Pele una papa de tamaño mediano y ráyela con un rallador de queso para obtener una pulpa fina (esto
     debe hacerse lo mas rápido posible para evitar las reacciones de oscurecimiento).
2.   Agregue a la pulpa mas o menos el doble de su volumen de agua destilada, agite fuertemente unos
     minutos.
3.   Filtre con un pañuelo de tejido no muy cerrado, para eliminar la parte gruesa del tejido.
4.   Deje que el filtrado se asiente, lo que se asienta es el almidón. Una vez que haya terminado de
     asentarse, decante el agua sobrenadante. Agregue nuevamente una suficiente cantidad de agua
     destilada y agite fuertemente por unos minutos. Deje asentar y decante nuevamente. Repita este
     procedimiento una o dos veces mas.
5.   Después de la última decantación, extienda lo mas posible el almidón en un vidrio de reloj grande y
     deje que se seque.
6.   Una vez seco el almidón, pulverícelo y péselo para reportar la cantidad obtenida.
7.   Utilice este almidón para las partes II y III de esta práctica.

II.- OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO
1.   Con el almidón obtenido en la parte I, haga una suspensión de aproximadamente 2% en agua
     destilada (no necesita pesar)
2.   Caliente un poco de la suspensión, sin llegar a ebullición.
3.   Tome una gota de esta suspensión y colóquela en el centro de un portaobjetos. Añada una gota de
     lugol.
4.   Ponga el cubreobjetos sobre la preparación y presiones ligeramente para eliminar el exceso de agua.
     Seque los bordes con un poco de papel filtro.
5.   Observe la preparación al micorscopio con el objetivo seco débil. Dibuje algunos de los granos.

III.- TEMPERATURA DE GELATINIZACIÓN

1. Haga una suspensión de almidón al 5% (1 gr. en 20 ml de agua destilada)
2. Ponga la suspensión en baño de agua a ebullición, agitando constantemente.
3. Introduzca un termómetro a la suspensión de almidón para leer la temperatura a la cual la suspensión
   cambia su aspecto, del normal a uno gelatinoso.
4. Reporte esa temperatura como temperatura de gelatinización.

IV.- COMPLEJO IODO-ALMIDÓN

1.   Pipetee 5 ml de la solución de almidón soluble al 1% (ya preparada por el maestro), a un tubo de
     ensaye.
2.   Agregue 3 gotas de solución de iodo al 0.1 N. Si el color del complejo es tenue, agregue una gota mas,
     cuanto sea necesario para hacer el color del complejo lo suficientemente obscuro.
3.   Tomando el tubo de ensaye con pinzas, y teniendo mucho cuidado de que no vaya a saltar el contenido
     del tubo, caliéntelo directamente a la llama del mechero, y anote el tiempo requerido para la
     desapoarición TOTAL del color. Se debe obtener una solución completamente transparente.
4.   Lleve entonces el tubo de ensaye al agua de la llave para enfirarlo y anote el tiempo requerido para que
     aparezca nuevamente el color semejante al que tenía al principio.
5.   Anote sus resultados.

V.- HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN

1. Coloque en su gradilla 6 tubos de ensaye chicos y numérelos del 1 al 6.
2. Numere 5 portaobjetos.
3. En un vaso de precipitados de 50 ml coloque 25 ml de solución de almidón al 1% (de la ya preparada).
4. Añada 10 gotas de HCl concentrado y agite suavemente.
5. Con una pipeta tome un poco de esta solución y coloque una gota de ella en el portaobjetos 1 y tres
   gotas en el tubo 1 de la gradilla. Enjuague su pipeta con agua destilada.
6. Prenda el mechero y caliente la solución del vaso hasta que hierva procurando que el hervor no sea
   demasiado fuerte.
7. A la gota que puso en el portaobjetos 1, agregue una gota de solución de iodo. Se debe observar el
   color azul característico de la reacción positiva del iodo con el almidón.
8. Anote el tiempo en que la solución comienza a hervir. En ese momento tome con su pipeta otro poco
   de la solución y coloque una gota en el portaobjetos 2, y tres gotas en el tubo de ensaye 2. Enjuague la
   pipeta.
9. Agregue inmediatamente una gota de solución de iodo al portaobjetos 2 y observe si la reacción del
   iodo-almidón comienza a hacerse débil o negativa.
10. A los dos minutos de haber comenzado a hervir la solución repita la operación tomando un poco y
   dejando una gota en el portaobjetos 3 y tres gotas en el tubo 3. Agregue una solución de iodo al
   portaobjetos 3 y enjuague la pipeta.
11. Esta operación se repite de dos minutos en dos minutos, hasta que la reacción iodo-almidón se haga
   negativa, o sea que solo aparezca el color café del iodo y no el azul del complejo. En ese momento
   termine el calentamiento.
12. Agregue a cada tubo de ensaye 3 ml de la solución de Fehling.
13. Coloque todos los tubos al mismo tiempo en el baño de agua hirviendo.
14. Espere unos 5 minutos. Saque los tubos y colóquelos en su gradilla de acuerdo a su numeración, del
   1 al 6 o más si se necesitaron mas tubos. Observe el grado de reducción por la cantidad de precipitado
   rojo ladrillo en cada tubo.


                                           CUESTIONARIO


1.   Además de la papa, que otro tipo de material podríamos haber utilizado para aislar almidón y en ese
     caso que variaciones se deberían introducir al método.
2.   A que se le llama gelatinización del almidón ? Cuál es la explicación del fenómeno ?
3.   Cómo podemos medir el grado de hidrólisis del almidón ?
4.   Se podría determinar la presencia de glucosa y almidón que estuvieran mezclados en el mismo tubo de
     ensaye ? Cómo ?
5.   Para que se agrega la solución de lugol a la preparación de almidón cuando se va a observar al
     microscopio?
                                            PRÁCTICA NO. 3
                               OBTENCIÓN DE GLUCÓGENO HEPÁTICO DE
                                          HÍGADO DE POLLO
INTRODUCCIÓN

El glucógeno es el principal polisacárido de reserva de las células animales y al igual que la amilopectina
es un polisacárido ramificado de la D-glucosa con enlaces alfa-1,4 y alfa-1,6 en los puntos de ramificación,
pero es mucho más ramificado y compacto que ésta.

El glucógeno es abundante en el hígado, donde puede alcanzar hasta el 7% del peso húmedo, pero
también se le halla en músculo esquelético.

En las células hepáticas el glucógeno se encuentra almacenado en gránulos grandes que contienen
además las enzimas responsables de su síntesis y degradación.

El glucógeno puede hidrolizarse por la acción de alfa-amilasa que se encuentra en la saliva y jugo
pancreático, las cuales rompen los enlaces alfa-1,4 en las ramas exteriores del glucógeno para dar
glucosa, una pequeña cantidad de maltosa y un núcleo resistente llamado dextrina limite.

GLUCOGÉNESIS:

El glucógeno es la forma principal de almacenamiento de carbohidratos en los animales y corresponde al
almidón de las plantas. Se encuentra en proporción mayor en el hígado (hasta 6%) y en el músculo, donde
rara vez excede de 1%. Al igual que el almidón, es un polímero ramificado de la D-glucosa.

La función del glucógeno muscular es actuar como una fuente de fácil disponibilidad de unidades de
hexosa para la glucólisis dentro del propio músculo. El glucógeno hepático sirve en gran parte para
exportar unidades de hexosa para la conservación de la glucosa sanguínea, particular entre comidas.
Después de 12 a 18 horas de ayuno, el hígado casi agota su reserva de glucógeno.

El glucógeno muscular sólo disminuye de manera significativa después de ejercicio vigoroso prolongado.
Puede inducirse en almacenaje mayor de glucógeno muscular con dietas ricas en carbohidratos después
de la depleción por el ejercicio. Las enfermedades por almacenamiento de glucógeno son un grupo de
trastornos hereditarios que se caracterizan por movilización deficiente del glucógeno y depósito de formas
anormales del mismo.

OBJETIVO

Realizar el aislamiento del glucógeno a partir de hígado de pollo y su purificación, así como su
identificación como polisacárido ramificado mediante la reacción colorimétrica de lugol.

MATERIAL

       Vaso de precipitados 250 ml

       Balanza granataria.

       Mortero con pistilo.
      Tubos de centrifuga.

      Tubos de ensaye 13x100

      Centrifuga

      Pipetas graduadas de 1, 5, 10 ml.

      Arena de río lavada.

      Guantes.

      Lentes.

      Cubrebocas.

      Ácido tricloroacético al 5 y 10%.

      Etanol al 95% y absoluto.

      Cloruro de sodio al 5% y sólido.

      Ácido clorhídrico 1, 2, 4N y concentrado.

METODOS Y TECNICAS

  1. Matar el pollo durmiéndolo previamente con cloroformo y proceder a extraerle el hígado.

  2. Lavar el hígado al chorro de agua, pesarlo y cortarlo en pedazos pequeños, lavar nuevamente.

  3. Colocar los pedazos en un mortero previamente sumergido en hielo.

  4. Añadir TCA al 10% en proporción de 1 ml/gr. de tejido hepático y aproximadamente 0.5 gr. de
     arena lavada. Triturar hasta formar una pasta homogénea.

  5. Centrifugar el homogeneizado por 5 minutos a 2000 r.p.m.

  6. Decantar el líquido sobrenadante en un vaso de 1000 ml. Lavar el mortero con TCA al 5% y
     resuspender en este líquido el precipitado de la centrifugación.

  7.   Dejar reposar por 5 min. centrifugar nuevamente. Decantar y reunir los líquidos sobrenadantes.

  8. Añadir el sobrenadante 2 volúmenes de Etanol al 95% por volumen de sobrenadante, agitar la
     mezcla y dejar en reposo hasta que el glucógeno flocule; si esto no sucediera, añadir un poco de
     NaCl y colocarlo en baño María a 37º.C hasta la formación de flóculo y centrifugar 5 minutos a 200
     r.p.m.

  9. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 5 ml. de agua Reprecipitar con dos
     volúmenes de Etanol al 95% centrifugar nuevamente.

  10. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 5 ml. de agua precipitar con dos
      volúmenes de Etanol absoluto y centrifugar por 3 min.
  11. Decantar y suspender con la menor cantidad posible de Etanol, y pasarlo a un vidrio de reloj. Dejar
      secar.

  12. Pesarlo para evaluar el rendimiento.

  13. Realizar la prueba de lugol para su identificación.

CUESTIONARIO

  1. ¿Cuáles son los órganos encargados de conservar concentraciones constantes de glucosa y
     glucógeno.

  2. Enumere las glándulas endocrinas que intervienen en el equilibrio entre el glucógeno hepático y la
     glucosa sanguínea.

  3. Escriba la formula estructural del glucógeno.

  4. ¿por qué es importante que el animal al que se le va a extraer el hígado esté vivo en ese
     momento?

  5. En ¿qué? Ocasiones las concentraciones de glucógeno hepático son elevadas sin que haya daño
     hepático.

  6. Tiene fundamento el que se consuman muchos carbohidratos en los casos de patología hepática.

  7. ¿Cuál es la fuente más importante de glucosa endógena?

  8. ¿En cuáles tejidos se realiza la vía de la pentosa fosfato y para que se utiliza ésta vía?

  9. Mencione las concentraciones de glucógeno en los diferentes sitios orgánicos donde se
     encuentra.

  10. Patológicamente ¿cómo Se comporta la concentración de glucógeno en un hígado cirrótico?
                                           PRÁCTICA Nº 4

                        REACCIONES CARACTERÍSTICAS DE LOS LÍPIDOS

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA :
Efectuar pruebas con aceites y grasas de uso común y determinar sus características.

MATERIALES Y EQUIPO :

12 tubos de ensaye
2 vasos de precipitado de 100 ml
gradilla para tubos de ensaye
Varilla de vidrio
2 tapones de hule para tubos de ensaye
Mechero Bunsen
Soporte con anillo y tela de asbesto
Vidrio de reloj

SUSTANCIAS :

Manteca vegetal
Manteca de res y puerco
Aceite de cártamo
Aceite de girasol
Aceite de maíz
Mantequilla o margarina
Aceite rancio
Eter etílico
Cloroformo
Solución de sosa alcohólica al 20%
Reactivo de Yodo
Cloruro de mercurio
Etanol comercial
Acido clorhídrico concentrado


PROCEDIMIENTO

I.- PRUEBA DE SOLUBILIDAD

1. Tome cinco tubos de ensaye y numérelos cada uno y agregue una pequeña cantidad de manteca de
   res.
2. Agregue a cada tubo 5 ml del solvente en el orden indicado en la tabla ; agite vigorosamente y después
   anote la solubilidad relativa usando la siguiente clave : 0 insoluble ; 1 poco soluble, 2 muy soluble.
TUBO                    SOLVENTE               GRADO DE SOLUBILIDAD

1                       agua

2                       alcohol frío

3                       alcohol caliente

4                       éter etílico

5                       cloroformo


ANOTA TUS OBSERVACIONES : _______________________________________________


II.- SAPONIFICACIÓN

1. En un tubo de ensaye coloque una pequeña porción de manteca vegetal, añada 2 ml de agua
   destilada y caliente a baño María hasta que se funda la manteca.
2. Añadir 2 ml de sosa alcohólica al 20% y caliente en baño María hasta observar cambios. Saque el tubo
   y déjelo enfriar.
3. Utilizando una varilla de vidrio extraiga una porción y coloque en un vidrio de reloj. Observe y anote sus
   características de olor, color y tacto.




III.- PRUEBAS DE INSATURACIÓN DE LÍPIDOS

1.- Tome ocho tubos de ensaye y numérelos. A cada uno de los tubos agregue pequeñas porciones de
las siguientes grasas :
TUBO 1          ACEITE DE MAÍZ
TUBO 2          ACEITE DE CÁRTAMO
TUBO 3          ACEITE DE GIRASOL
TUBO 4          ACEITE DE OLIVA
TUBO 5          MANTECA DE RES
TUBO 6          MANTECA VEGETAL
TUBO 7          MANTECA DE PUERCO
TUBO 8          ACEITE RANCIO

2.- Agregue a cada tubo la cantidad mínima de cloroformo para disolver la muestra.
3.- Añada a cada tubo 5 gotas de solución de yodo y agite. Observe las soluciones obtenidas y la
velocidad relativa con que desaparece el color rosado. Haga una lista de las sustancias que ensayó en el
orden con que se desapareció el color rosa.
1. ________________________
2. ________________________
3. ________________________
4. ________________________
5. ________________________
6. ________________________
7. ________________________
8. ________________________




CUESTIONARIO Y EJERCICIOS

1.   Menciona 10 alimentos que contengan elevada proporción de lípidos

2.- Investiga la reacción de saponificación y el proceso de obtención de jabones a nivel industrial

3.- Escribe la reacción de lípidos (grasas neutras o triacilgliceroles) con el iodo.

4.- De acuerdo al orden de desaparición del color rosado en la prueba de insaturación con yodo ¿Cuál es
el lípido mas insaturado y cuál es el menos insaturado ?

5.- Que es la minarina ?

6.- Investiga como se lleva a cabo la hidrogenación para la obtención de mantecas vegetales.

7.- Investiga en que consiste el enranciamiento de un aceite
                                            PRÁCTICA No. 5

                             OBTENCIÓN DE LECITINA Y COLESTEROL
                                A PARTIR DE LA YEMA DE HUEVO


FUNDAMENTO DE LA PRÁCTICA

Se separará primero la yema del huevo por los medios manuales o mecánicos. En la yema se encuentran
las lecitinas en gran abundancia y además el colesterol en suficiente cantidad para hacer su aislamiento y
detección fácil.

Una vez separada la yema se hará una extracción general de lípidos con solventes orgánicos. Algunos
autores afirman que una mezcla clorformo-éter a partes iguales es el mejor solvente para la extracción de
los lípidos. En ésta práctica se usará una mezcla etanol-éter al 2 :1. Se aprovechará el hecho de que las
lecitinas son insolubles en acetona para obtener su fácil precipitación. Después de precipitar las lecitinas,
quedan en solución muchas otras clases de lípidos entre los cuales está el colesterol. Se hace entonces
una saponificación para separar la fracción saponificable y quedarse con la insaponificable donde se
encuentra el colesterol. Bastara entonces solubilizarlo bien y agregar agua para precipitarlo, ya que es
insoluble en agua. Se precipita en forma cristalina.


MATERIAL

PRIMERA PARTE

1 Matraz Erlen Meyer de 250 ml con tapón                 Vaso de precipitados de 250 ml
Probeta de 50 o 100 ml                                   Agitador
Embudo                                                   6 tubos de ensaye de 13x10
Vaso de precipitado de 250 ml                            Pipeta de 5 ml
Vaso de precipitado de 100 ml                            Probeta de 50 o 100 ml
Vaso de precipitado de 50 ml                             Baño María
Agitador                                                 Embudo
Baño María                                               Gradilla
Mechero, tripié y tela de asbesto                        Mechero, tripié y tela de asbesto


PROCEDIMIENTO

OBTENCIÓN DE LECITINA

1.   Separe la yema de huevo y vacíela en un Erlen meyer de 250 ml. Hágalo con cuidado, de preferencia
     en el lavabo, procurando siempre la limpieza. La clara se descarta.
2.   Añada 50 ml de alcohol etílico y 25 ml de éter. Tape el Erlen Meyer y agite con cuidado durante dos
     minutos, destapando de tiempo a tiempo para desalojar cualquier presión que pudiera desarrollarse.
     Deje reposar la mezcla por 10 minutos, agitando suavemente de tiempo en tiempo.
3.   Filtre sobre papel Whatman 1 humedecido con etanol y doblado en forma de zig zag.
4.   Pase el residuo que quede en el papel filtro a otro Erlen Meyer y añada 10 ml de etanol y 5 ml de éter.
     Agite suavemente y deje reposar por 5 minutos.
5.   Filtre nuevamente esta última extracción y combine los filtrados. El residuo se descarta.
6.   Evapore el filtrado hasta sequedad en baño de agua hirviendo, en un vaso de precipitados lo mas
     ancho posible. Si usa mechero NO SE ASOME para ver si ya está terminando la evaporación, para
     ese use unas pinzas grandes y con ellas saque el matraz y así haga su observación.
7.   Disuelva el residuo en 10 ml de éter.
8.   Lentamente y con agitación suave vacíe esa solución a un vaso de precipitados que contenga 30 ml de
     acetona. Siga agitando con cuidado hasta que las partículas de lecitina cruda precipitada se adhieran
     entre sí formando una bolita.
9.   Filtre para separar la lecitina y guarde por separado la lecitina y el filtrado para usarlos en las siguientes
     partes de la práctica. Si la lecitina formó una bolita mas o menos firme, no habrá necesidad de filtrar,
     bastará con decantar.

OBTENCIÓN DE COLESTEROL

1.   Evapore el filtrado de la sección anterior, en baño de agua hirviendo hasta que se haga una pasta (el
     residuo no debe oler ni a éter ni a acetona). Enfríe.
2.   Añada 15 ml de la solución de potasa alcohólica al 10 %. Agite y caliente la solución hasta que se
     concentre hasta sequedad. Enfríe.
3.   Añada 50 ml de éter y agite bien. Filtre por si hay algún precipitado de jabón.
4.   Evapore el filtrado hasta sequedad.
5.   Añada 5 ml de alcohol etílico y caliente en baño María por dos minutos. Transfiera la solución a un tubo
     de ensaye.
6.   Centrifugue por 5 minutos.
7.   Transfiera el sobrenadante, después de la centrifugación, a un tubo de ensaye. Este sobrenadante
     contiene colesterol en solución. Ahora añada gota a gota, agua destilada a la solución, hasta que no
     aparezca más precipitado. Deje reposar por 15 minutos y centrifugue.
8.   Descarte el líquido por decantación. (puede centrifugarse el residuo cristalino de colesteril, disolverlo en
     2 ml de alcohol aliente y volver a precipitarlo, añadiendo gota a gota agua. Esto dará un colesterol un
     poco mas puro). Deje secar los cristales de colesterol.


CUESTIONARIO

1. Investigue bibliográficamente las estructuras completas de la lecitina y el colesterol.
2. Investigue bibliográficamente la estructura de la membrana celular y cómo están en ella los lípidos que
   la forman (fosfolípidos, glucolípidos y colesterol)
3. Investigue que es y cómo se obtiene el éter de petróleo.
                                             PRACTICA Nº 6
                                                PROTEÍNAS

OBJETIVO: Efectuar pruebas físicas y químicas características de la albúmina de
             huevo.

MATERIALES Y EQUIPO

Mechero Bunsen                                            Un huevo
5 tubos de ensaye medianos                        Solución de NaOH al 10% y 2
13 tubos de ensaye chicos                                 Solución de CuSO4 al 0.05%
Pinzas para tubo de ensaye                        Solución de ninhidrina al 0.1%
2 Goteros                                                 HNO3 concentrado
Soporte con anillo y tela de asbesto              Ácido acético
3 vasos de precipitado                            Sol. Saturada de NaCl
Papel indicador                                   Sol. de HgCl2 al 10%
Termómetro                                                Sol de acetato de plomo al 10%
Gradilla para tubo de ensaye                      Sol de ferrocianuro de potasio al 10%
Probeta de 25 ml                                          Alcohol etílico comercial
Embudo de filtración
Gasa de uso medicinal



PROCEDIMIENTO :

I.- SOLUBILIDAD

1. Tome 4 tubos de ensaye medianos y en cada uno adicione 1 ml de clara de huevo fresco.
2. A cada tubo añada 5 ml de cada una de las sustancias anotadas en la tabla de solubilidad y agite.
3. Anote en la columna de solubilidad, de la tabla antes mencionada, la solubilidad relativa en cada tubo,
    de acuerdo a la siguiente clave : 0 insoluble, 1 poco soluble, 2 muy soluble.


                                         TABLA DE SOLUBILIDAD

TUBO                     SOLVENTE                         SOLUBILIDAD RELATIVA

1                        agua fría

2                        agua caliente

3                        suero fisiológico
4                       Sol. De NaOH 25%


4. En un vaso de precipitado de 100 ml ponga 10 ml de clara de huevo y añada 40 ml de agua destilada ;
    agite y filtro colocando en el embudo un pedazo de gasa doblada como material filtrante. El filtrado se
    denominará solución A ; úselo para los experimentos siguientes.

II. PRUEBAS COLORIDAS

A. REACCIÓN DE BIURET

En un tubo de ensaye ponga 1 ml de albúmina de solución A, 1 ml de solución de NaOH al 1% y unas
cuantas gotas de solución de CuSO4 al 0.05% hasta observar cambios. Anote sus observaciones :


B. PRUEBA DE LA NINHIDRINA

En un tubo de ensaye vierta 3 ml de la solución A y cinco gotas de una solución de ninhidrina al 0.1% ;
caliente hasta ebullición y enfríe. Anote sus observaciones.


C. PRUEBA XANTOPROTEÍCA

En un tubo de ensaye vierta 2 ml de solución A y agregue unas cuantas gotas de HNO 3 concentrado.
Caliente suavemente y deje enfriar. Anote sus observaciones.


A la solución anterior añádale unas cuantas gotas de NaOH hasta que la solución sea básica. Use papel
indicador. Anote sus observaciones.




III. PRUEBA CON SALES METÁLICAS

1. El una gradilla coloque 8 tubos de ensaye chicos, numérelos y en cada uno de ellos vierta 2 ml de la
   solución A. A los tubos impares añádales dos gotas de ácido acético hasta que el medio sea
   ligeramente ácido. Use papel indicador. En los tubos pares no añada nada, ya que la albúmina en su
   estado natural es ligeramente básica.
2. A los tubos (1) y (2) añádales 10 gotas de solución saturada de NaCl ; a los tubos (3) y (4), 2 gotas de
   solución de HgCl2 al 10% ; a los tubos (5) y (6), 2 gotas de solución de acetato de plomo al 10% y a
   los tubos (7) y (8) añádales 2 gotas de solución de ferrocianuro de potasio al 10%.
3. Anote en la tabla con un signo (+) la presencia de un precipitado o el signo (-) en caso de no haberlo.

TUBO            MEDIO ÁCIDO          TUBO               MEDIO BÁSICO          SOL. DE SAL
                                                                          AGREGADA
1                                      2                                       NaCl
3                                      4                                       HgCl2
5                                      6                                       Acetato de Pb
7                                      8                                       Ferrocianuro de K


OBSERVACIONES :




IV. EFECTO DEL CALOR

1. En un tubo de ensaye mediano añada 3 ml de la solución A y colóquelo en un vaso que contenga agua
    para calentar en baño María.
2. Introduzca un termómetro en el baño de agua y caliente lentamente.
3. Anote la temperatura a la cual la proteína empezó a coagular.

V. EFECTO DEL ALCOHOL ETÍLICO

1. En un tubo de ensaye mediano añada 3 ml de la solución A y agregue 5 ml de alcohol etílico comercial.
Anote sus observaciones

CUESTIONARIO

1. Que son las proteínas termoestables y termolábiles
2. Calcula el costo actual de 1 Kg de proteína en los siguientes alimentos :
a) Carne de res
b) Carne de puerco
c) Leche
d) Frijol soya
e) Pescado
f) Frijol
g) Maíz
3. Investiga los fundamentos de todas las reacciones coloridas que se realizaron aquí.
                                           PRÁCTICA Nº 7
                                             ENZIMAS


OBJETIVOS :
    Observar la acción de la amilasa de la saliva.
    Explicar la influencia de la temperatura sobre la actividad de la amilasa.




MATERIAL Y EQUIPO                       SUSTANCIAS

Mechero                                 Solución de almidón al 1% en una sol 0.005M de NaCl
Soporte con anillo                      Suspensión de almidón
Tela de asbesto                         Solución de Iodo
13 tubos de ensaye medianos             Reactivo de Benedict
4 vasos de 100 ml
1 gotero

PROCEDIMIENTO

DIGESTIÓN DE ALMIDÓN MEDIANTE LA AMILASA DE LA SALIVA

1. Coloque 25 ml de una solución de almidón al 1% en un vaso de precipitados de 100 ml y en otro vaso
     de 100 ml coloque 25 ml de una suspensión al 1% de almidón.
2. Tenga disponibles algunos tubos y la solución de iodo.
3. Obtenga dos porciones de saliva de la misma persona, de 1 ml cada una viértalas en dos tubos de
     ensaye diferentes.
4.   En un baño María, cuya temperatura se procura mantener a 38º C, coloque los dos vasos de
     precipitados y los dos tubos de ensaye. Después de 3 o 5 minutos vierta el contenido de cada tubo en
     su vaso correspondiente.
5.   En intervalos de 1 minuto, saque separadamente de cada vaso de precipitados 1 ml de la solución y
     mézclela con una gota de solución de yodo colocada en un tubo de ensaye. Después de 10 minutos
     efectúe las pruebas cada 5 minutos.
6.   Anote en la tabla un signo (+) o un signo (-) si la solución o suspensión de almidón da positiva o
     negativa la prueba del lugol en cada tiempo (es positiva cuando cambia a azul).
7.   Cuando en ambos vasos se haga negativa la prueba del lugol, efectúe la prueba de Benedict con el
     residuo de cada uno de los vasos.
Tiempo Tanscurrido                     Solución de almidón                     Suspensión de almidón
(minutos)

       1

       2

       3

       4

       5

       6

       7

       8

       9

       10

       15

       20

       25



II.- EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA AMILASA

1. Marque 3 tubos de ensaye medianos       del 1 al 3 y coloque en cada uno de ellos 15 ml de solución de
   almidón al 1%.
2. Coloque el tubo 1 en un baño de hielo, el tubo 2 en un vaso de precipitado con agua a 38º C y el tubo 3
   en un baño de agua a 70º C.
3. En otros tres tubos de ensaye coloque respectivamente 6 ml de una solución de saliva, preparada
   disolviendo 0.5 ml de saliva en 25 ml de agua destilada. Coloque cada uno de los tubos con saliva en
   cada uno de los baños mencionados hasta alcanzar la temperatura de equilibrio.
4. Cuando esto ocurra cierta las soluciones de saliva en la solución respectiva de almidón y mézclelas
   bien.
5. Inmediatamente saque 1 ml de la mezcla de cada tubo y efectúe la prueba del lugol. Anote el signo (+)
   o el signo (-) en la tabla según sea el caso. A esta primera prueba le corresponderá el tiempo cero.
6. Efectúe la prueba cada 2 minutos y después de 10 minutos, efectúelas cada 5 minutos anotando en la
  tabla los signos ya convenidos en el punto anterior.
 TIEMPO                 0º C                   38º C                    70º C
 (minutos)

        0

        2

        4

        6

        8

        10

        15

        20

        25



CUESTIONARIO

1. Que reacción cataliza la amilasa de la saliva ?



2. Base a la primera tabla de resultados diga en que forma el almidón es mas fácil de digerir.




3. Explique los resultados de la prueba de Benedict efectuados al contenido de los vasos




4. Investiga los nombres de 5 enzimas y diga su reacción específica
5. De acuerdo con los resultados de la segunda tabla, deduzca cual es la temperatura óptima de acción
   de la amilasa.


6. En que consiste la desnatruralización de una enzima ?
                                             PRÁCTICA 8

                  EXTRACCIÓN DE ACIDOS NUCLEÍCOS A PARTIR DE
                              CÉLULAS DE HÍGADO

OBJETIVO : Extraer los ácidos nucleicos (DNA y RNA) a partir de células de hígado.

MATERIALES :
Homogenizado de hígado fresco
Probeta graduada
3 vasos de precipitado de 50 ml
1 vaso de precipitado de 100 ml
Parrilla de calentamiento
Pinzas para vaso
Acido tricloroacético
Solución de ácido clorhídrico al 10%
Alcohol etílico al 95%
Embudo
Papel filtro
Porta objetos
Cubre objetos
Microscopio
Lentes de seguridad

PROCEDIMIENTO

   1. PRECAUCIÓN : Póngase los lentes de seguridad y déjeselos puestos hasta el paso 12. Mida
      10 ml de homogeneizado de hígado en una probeta.
2. Pase el homogeneizado a un vaso de precipitado de 100 ml.
   3. Agregue 10 ml de ácido tricloracético al 15% y mezcle bien con un agitador.
   4. Filtre y transfiera el material que quedo en el papel filtro hacia un vaso de precipitado de 50ml.
   5. Agregue 15 ml de cloruro de sodio al 10% y mezcle bien.
   6. PRECAUCIÓN : Tenga cuidado al utilizar cualquier fuente de calor.
Llene hasta la mitad el vaso de precipitado de 100 ml con agua. Prepare un baño de agua colocando el
vaso en la parrilla de calentamiento. Caliente el agua a ebullición.
   7. Utilizando las pinzas, coloque el vaso de 50 ml en el baño de agua y caliente por 10 minutos.
   8. También utilizando las pinzas, remueva el vaso que contiene la mezcla y deje que enfrie.
   9. Filtre la mezcla hacia un vaso de 50 ml.
   10. Lentamente agregue alcohol etílico al 95% refrigerado. El filtrado deberá inclinarse de tal manera
      que el alcohol fluya por las paredes del vaso de precipitado.
   11. Observe la el precipitado lechoso que se forma. Es el ácido nucleico de las células de hígado.
   12. Recolecte los hilos de ácido nucleico con un agitador de vidrio y coloque parte de ellas en un porta
      objetos.
   13. Observe los hilos de ácido nucleico en el microscopio en 10X y luego en 40X
También se puede identificar el tipo de ácido nucleico (DNA y RNA) adicionándolo a un volumen igual de
ácido clorhídrico concentrado. Coloque la mezcla en un baño de agua hirviendo por 10 minutos. Agregue
varias gotas del reactivo de difenilamina y hierva en el baño de agua por otros 5 minutos. Observe
cualquier cambio de color. Si los hilos de ácido nucleico se tornan verdosos, el RNA es abundante. Si los
hilos se tornan morados, el DNA es abundante.



CONCLUSIONES Y ANALISIS :

1.   Describa la apariencia de los hilos de ácidos nucleicos.

2.   Describa el procedimiento que usarías para extraer ácidos nucleicos a partir de un steak .
                                            PRÁCTICA Nº 9
                                               MITOSIS
                                              (opcional)

OBJETIVO:

Observar las fases de la mitosis en células de la raíz de una planta examinando el área meristemática de
la punta de la raíz de una cebolla.


MATERIALES :

Pica dientes
Bulbo de cebolla
Vaso de precipitado
Navaja de doble filo
Colorante acetocarmin
Lentes de seguridad
Mechero Bunsen
Porta objetos
Cubre objetos
Lápiz
Toallas de papel
Microscopio


PROCEDIMIENTO

1.   Inserte 4 o 5 pica dientes en un bulbo de cebolla. Suspenda el bulbo de cebolla en un vaso de
     precipitado que contenga agua, de tal forma que la parte inferior del bulbo siempre este sumergido en
     agua. Las raíces deberán crecer libremente.
2.   Cuando las raíces hayan crecido aproximadamente 1 cm, quite el bulbo del agua y recorte las puntas
     de la raíz utilizando una navaja. ¿Porque se están utilizando las puntas de las raíces ? ?
3.   Coloque las puntas de las raíces en un vaso de precipitado con colorante acetocarmín.
     PRECAUCIÓN : Use los lentes de seguridad. Caliente suavemente pero no permita que hierva.
     ¿Cual es el propósito del calentamiento ?
4.   Saque las puntas de las raíces del colorante. Corte una rebanada delgada de cada una de cada una
     de las puntas. Prepare un montaje húmedo de una o mas rebanadas.
5.   Utilizando el borrador de un lápiz, presione suavemente el cubre objetos y pegue la punta de la raíz al
     porta objetos. Asegúrese de no presionar demasiado ya que el cubre objetos puede quebrarse.
     Remueva cualquier exceso de colorante con una toalla de papel.
6. Observe la preparación en el microscopio. El colorante acetocarmín debe haber teñido los
   cromosomas de color rojo o rosa. Busque las células en las diferentes fases de la mitosis. Muchas
   células pueden mostrar actividad mitótica.
7. Dibuje las células y rotule cada fase de la mitosis. Asegúrese de localizar todas las fases de la división
   celular.


ANALISIS Y CONLCLUSIONES

1.- Estudie sus diagramas y describa que está ocurriendo en cada fase de la mitosis.

2.- Describa la posición y forma de los cromosomas durante la metafase.

3.- Explique el significado de la mitosis. Que clase de células se dividen por mitosis ? ?

				
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posted:2/25/2012
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