Agilent seminar templete by pq16870o

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									     Sa
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     安捷伦科技



HPLC色谱柱选择与维护保养




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安捷伦HPLC色谱柱选择




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分离模式的选择                                    用硅胶的正相模式
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                       溶于正己烷
                                          用键合相的正相模式

                      溶于甲醇或甲醇/水           用键合相的反相模式
             溶于有机溶剂
                       或乙腈或乙腈/水
                                          用键合相的反相模式
分子量<2, 000             溶于四氢呋喃
                                          低分子凝胶渗透色谱

                                          用键合相的反相模式
              溶于水       非离子化
                                          抑制电离反相键合相色谱


   样品                                     离子对键合相的反相模式
                        离子化
                                           用硅胶的正相模式

                                            离子交换模式

             溶于有机溶剂                         凝胶渗透色谱

分子量>2, 000                                  凝胶过滤色谱

              溶于水                         大孔填料的离子交换模式

                                          用大孔填料的反相模式
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正相 &反相色谱
   正相吸附色谱
   极性:固定相 > 流动相

       固定相 - 极性
       流动相(己烷, 庚烷)- 非极性
       极性物质后出峰


   反相分配色谱
   极性:固定相 < 流动相

       固定相 - 非极性
       流动相(甲, 乙醇, 乙腈, THF, 二氯乙烷)- 极性
       非极性物质后出峰



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          柱填料基质
     高或低pH下, 硅胶会溶解   • 硅胶基质- pH 3~8

           化学修饰困难    • Al2O3 . nH2O - pH1~14

                     •
孔结构复杂, 孔径不均匀导致柱效不够高, 有 聚合物基质           - pH1~14
机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损




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C-18柱---性能影响因素
                 •硅胶纯度
                 •色谱柱尺寸
                 •颗粒形状
      物理性质
                 •粒径
                 •表面积
                 •孔径

       •键合类型
  化学性质 •碳覆盖率
       •封端

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C-18柱---性能影响因素
             色谱柱物理性质
硅胶纯度
     • 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度
色谱柱尺寸
     • 填料床的长度和内径
颗粒形状
     • 球型或不规则型
粒径
     • 平均颗粒直径,   通常3-10µm
表面积
     • 颗粒外表面和内部孔表面的总和,               以m2/gram表
示
孔径
     • 颗粒的孔或腔的平均尺寸,     范围80-300Å
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     C-18柱---性能影响因素

             色谱柱化学性质
键合类型
     • 单体键合 - 键合相分子与基体单点相连
     • 聚合体键合 - 键合相分子与基体多点相连
碳覆盖率
     • 与基体物质相连的键合相的量
封端
     • 键合步骤之后,   用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起
来




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   C-18柱---性能影响因素
  A类硅胶                                 B类硅胶 (高纯)
  Original ZORBAX SIL (1970s)          ZORBAX Rx-Sil (1987)
  由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表                     由于金属含量低, 硅羟基pKa高,
  面上金属含量高 (硅羟基的pKa低),                  碱性化合物不发生拖尾
  导致碱性化合物发生拖尾

                            金属浓度(ppm)
  二氧化硅            Na    K   Mg Al Ca Ti          Fe    Zr   Cu   Cr   Zn
  Zorbax Rx-SIL   10   <3   4    1.5   2    nd   3     nd   nd   nd   1
  Zorbax SIL      17   nd   nd   57    9    32   21    88   < 1 nd    88
  Nucleosil       56   N/ A N/ A nd    130 57    76    nd N/ A N/ A nd
  Hypersil        2900 N/ A 40   300   38   65 230 N/ A N/ A N/ A N/ A
  nd = 未检出


Zorbax Rx-SIL: 11种金属< 35 ppm (未检出其他杂质,                <1ppm); 99.995% 纯度的二氧化


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               ZORBAX®生产工艺
                                              • StableBond
                                              • Eclipse
                                                XDB
                                              • Bonus-RP
                                              • Extend
  硅胶

   +                                               粒径
                   D250oC                          1.8 µm
脲 (pH=2)                                           3.5 µm
                    O2
                                                   5.0 µm
   +                                               7.0 µm

 甲醛                 孔径
 CH2O                           ZORBAX Rx
                  80A & 300A
                                多孔硅胶微球

           安捷伦拥有此项溶胶-凝胶填料专利技术
                                  Agilent
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 C-18柱---性能影响因素

色谱柱尺寸 --- 对色谱分离的影响
  • 短柱 (15-100mm) - 运行时间短,          柱压低
  • 长柱 (150-250mm) - 分辨率高,          运行时间长


  • 窄径柱 ( 2.1mm) - 检测器灵敏度高
  • 宽径柱 (3-21.2mm) - 载样量高




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     C-18柱---性能影响因素
颗粒形状 --- 对色谱分离的影响
当使用黏度较大的流动相50:50=MeOH:H2O时
, 球型颗粒可以降低柱压, 延长色谱柱寿命
                                球形             不规则形
粒径 --- 对色谱分离的影响
较小的颗粒柱效较高, 但会引起柱压过高.
3.5µm粒径的常用于分离复杂的多组份样品,
而组份单一的样品多采用5µm的粒径




          1.8µm   3.5µm    5µm           7µm

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       C-18柱---性能影响因素
表面积 --- 对色谱分离的影响
高表面积对于多组份样品的分离具有较强的保
留能力, 柱容量和分离度. 表面积低的填料通
常能迅速达到平衡状态, 对于梯度淋洗尤为
重要
孔径 --- 对色谱分离的影响
大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞
留的时间, 达到充分分离, 改善峰形

样品 MW  4,   000,   选择 80Å 的孔径
样品 MW > 4,   000,   选择 300Å 的孔径



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    大孔径填料适用于大分子分析
*   大孔径300Å 全多孔色谱柱
    可用于分离蛋白质和多肽
    分子量虽小但hydrodynamic volume(水动力学体积)较大的分子
*   Poroshell 色谱柱
    高流速下,   高柱效分析大分子的蛋白质和多肽




                               色谱柱填料孔径必须适合
                               待测物分子自由进出填料
                               孔, 与孔内表面的键合相
                               进行分离分配




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 300Å 孔径可改善蛋白质和多肽峰形
                         孔径,   分子量对峰宽的影响(梯度分离)
选择合适的             0.20

填料孔径分析            0.18    300SB-C18 (300Å)
大分子可获得            0.16    SB-C18 (80Å)
 最佳峰形
                  0.14
         PW 1/2

                  0.12

                  0.10

                  0.08

                  0.06

                  0.04

                  0.02

                    0




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                                         Technologies
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      300Å 孔径可改善大分子的峰形
色谱柱: 4.6 x 150 mm, 5 mm
流动相: 60% MeOH: 40% 0.1% 三氟乙酸
                          O                                               分子量虽小但 hydrodynamic volum
流速: 0.75 mL/min             CH
温度: RT
                             3
                               CHO                                        (水动力学体积)较大的分子
检测器: UV 282 nm         HC
                        3      CH2
                                  HC                                 CH
                                                                      3
                           O                    HC        HO 3   N
              HO                     CH2         3
                                 O             O          O           O       HO
                                                             O
                           OCH                                       CH
                                                                      3            CH3
                             3
                    OCH
                      3              CH    O          OH                            OH
                                      2                                   O
                                                                              CH
                                                                               3
                                     CH
                                      3
         SB-C3                             Tylosin(泰乐菌素)                                       300SB-C3
         (80Å)                                 MW. 926                                           (300Å)

       Pw 1/2 = 0.442                                                                          Pw 1/2 =0.125



 0                  5                                10
              Time (min)                                         0                         5                   10
                                                                                         Time (min)

          • 溶液中的分子尺寸决定适宜的色谱柱孔径
          • 窄的峰宽表明待测分子进入填料孔没有受到阻碍
                                                                        Agilent
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                                            17页


    C-18柱---性能影响因素
键合类型 --- 对色谱分离的影响
单齿键合:                      CH3

提高传质速率,   加快色谱柱平衡       O Si
                          CH 3        OSi
                            CH 3
                        O Si CH
双齿键合:                            3
                            CH 3      OSi
增加色谱柱稳定性,   增加色谱柱的载样       CH3
                        O Si
量                          CH3
                           CH  3      OSi
                         O Si CH 3
                           CH
                           CH
                               3
                                      OSi
                             3
                        O Si
                            CH3



                          Agilent
                       Technologies
                                     18页


     C-18柱---性能影响因素
碳覆盖率--- 对色谱分离的影响

高碳覆盖率:提高分辨率, 分析时间长
低碳覆盖率:缩短运行时间



封端 --- 对色谱分离的影响

封端:减轻待测组份与硅胶表面残留的酸
性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象
对于极性样品, 未封端与经过封端处理的
色谱柱在选择性上有明显差异



                         Agilent
                      Technologies
                                                                    19页


                    传统键合及封端技术

                                                             CH3
                              CH3
                                                        O    Si R
OH                        O   Si R                           CH3
              CH3                           CH3         OH
OH                        OH CH3                             CH3
     +   Cl Si R                     +   Cl Si CH3      O Si CH
OH                        OH CH3                               3
              CH3                           CH3              CH3
OH                        O Si R                             CH3
               C18,etc.
         R = C8,                            (TMS)
                              CH3                       O Si R


          固定相键合                            封端
          二甲基硅烷                          四甲基硅烷




                                            Agilent
                                         Technologies
                                         20页


安捷伦专利的空间位阻保护

                                  取代基:五个
                                  旁侧基团: 异丙基
                  键合相
               流失, 保留减弱




  另一个裸露的硅羟基 ,   潜在的拖尾因素


普通硅胶柱低 pH <2             Zorbax StableBond
不稳定, 发生水解               空间位阻保护---抗水解能力

                      Agilent
                   Technologies
                                               21页


               液相柱---保留值与pH的关系
色谱柱:Zorbax StableBond
C18
           4.6 X 250mm, 5um
部件号:880975-906
流动相:27%甲醇:73%磷酸
pH 2.5 & 2.6
温度:500C
流速: 1.0mL/min.

                  pH变化值                      RS变化值
                    0.1                        1.6




                                 Agilent
                              Technologies
                                                                                                       22页


                    液相柱---保留值与pH的关系
色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C8
      4.6 x 75 mm, 3.5 µm                   1       2       4         5
                                 pH
流动相: 44% 25 mM磷酸, pH 7.00 : 56% 甲醇
流速: 1.0 mL/min
                                                                                           7

温度: 25°C
检测: UV 250 nm
                                 7.00                   3                     6


样品:                   0.25 个pH   0      1           2              3                  4            5       6
1. ketoprofen                                                    Time (min)
2. ethyl paraben
3. Hydrocortisone                           1   2           4     5
4. fenoprofen
5. propyl paraben
                                 pH                                                       67

6. Propranolol
7. ibuprofen
                                 7.25                   3




                                 0      1       2                 3               4            5       6
                                                                Time (min)



                    • 可电离的组份的分离可能会随pH变化发生显著变化
                      —甚至很小的 0.05–0.25 个pH变化单位.

                                                   Agilent
                                                Technologies
                                              23页


液相柱---保留值与pH的关系
                             pH变化:
                          0.2个pH(7.0~7.2)
                           保留时间改变:
                        1.2分钟 (13.6~14.8分钟)




                           保留时间随pH
                             改变不明显




                          保留时间随pH改变
                         不明显(酸性环境中)



            Agilent
         Technologies
                                            24页


  液相柱---保留值与pH的关系
方法稳定区   方法波动区(pKa+1.5)              方法稳定区

中性组份


 酸性组份




碱性组份




                            Agilent
                         Technologies
                                            25页


液相柱---保留值与pH的关系

            Extend C18 pH 2~11.5



       Bonus-RP pH 2~9


    Eclipse XDB C18 pH 2~9


StableBond C18 pH 1~8




                                Agilent
                             Technologies
                                                                             26页

                   复杂组分的流动相pH选择技巧
           Extend-C18                                   Extend-C18
              pH 7    高pH下,             碱性成分的保留增加
                                                           pH 11
                                                                         7
                               7
               4                                         4
      2,   3
                                                    3
      1
                                                              5
                                                1
                   5
                                                    2                6
                              6



  0                    1. Maleate 马来酸盐
                       5   Time (min)       0      5      10 Time (min)
                       2. Scopolamine 东莨菪碱 pKa 7.6
色谱柱: ZORBAX Extend-C18
4.6 x 150 mm, 5 mm     3. PseudoEphedrine 假麻黄碱 pKa 9.8
流动相: 30% 缓冲液: 70%      4. Doxylamine 抗敏安(多西拉敏) pKa 9.2
                                                       待测物pKa+1.5以外
MeOH pH 7 缓冲液20 mM     5. Chlorpheniramine 氯苯吡胺pKa 9.1   的流动相pH
Na2HPO4 pH 11缓冲液 20 mM 6. Triprol内径ine 苯丙烯啶pKa 6.5
                                                       可保证方法的稳定性
TEA                    7. Diphenhydramine 苯海拉明 pKa 9.0
流速: 1.0 mL/min
温度: RT 检测器: UV 254 nm

                                                  Agilent
                                               Technologies
                                                       27页

           Zorbax色谱柱发展史
1973 ZORBAX SIL              发明专用于HPLC分离的球状、小颗粒硅胶(专利)
1977 ZORBAX ODS              单官能团, 单层键合相发明者之一
1978 ZORBAX column       首先推出色谱柱的质量信誉保证
1982 ZORBAX GF-250       改善了蛋白质尺寸分离的稳定性
1987 ZORBAX Rx-SIL       推出适合碱性化合物的HPLC分离的全新硅溶胶技术(专利)
1990 ZORBAX StableBond 增强了低pH条件下键合相的稳定性(专利)
1996 ZORBAX Eclipse XDB      双封端技术提高了中等pH条件下键合相的稳定性(专
     利)
1997 Zorbax LC/MS column     15和30 mm(3.5um)快速, 高分辨率, 高通量
     LC/MS色谱柱
1998 ZORBAX Bonus-RP         极性键合技术使碱性化合物的分离得到改善(专利)
1999 ZORBAX CombiHT          专为小规模组合化学样品制备设计的高通量色谱柱
1999 ZORBAX Eclipse dsDNA 用于分析双链DNA的多孔硅胶柱
1999 ZORBAX Carbohydrate     分析单, 双, 三糖和糖醇的专用柱
1999 Zorbax Extend C18 独特宽pH跨度, 高pH下使用的硅胶基质色谱柱(专利)
2001 Zorbax SB-aq            可在低pH下(1~8)使用100%水相的填料(专利)
2002 Zorbax Poroshell 300SB  蛋白质高速, 高效反相分离新填料
2002 ZORBAX 3.0mm 内径.        3-mm 柱径溶剂节省柱
2003 ZORBAX sub 2 micron     1.8um粒径的高通量, 超高速色谱柱 (5月1日上市)
2003 ZORBAX PrepHT       高通量全系列制备柱---分析柱向制备柱直接放大 (6月1日上市)
                                   Agilent
                                Technologies
                                                                                                                      28页

                       键合相-适用pH范围
StableBond,         Eclipse XDB,
                pH 1-8            pH 2-9 Bonus-RP,          pH       Extend-C18,                              pH 2-11.5
1. 使用空间位阻大的硅烷       1. 致密键合的二甲基烷基硅烷                                  1. 独特的双齿键合结构
2. 未-封端             2. 专利技术双 - 封端
                                         2-9                         2. 双封端
                                        1. 极性烷基固定相
                                        2. 使用空间位阻大的硅烷
                                        3. 三封端
低pH下, 分析酸性,          中等pH下, 分析酸性,       中等pH下, 分析酸性,                  中~高pH下, 分析酸性,
碱性和中性组分,             碱性和中性组分, 尤其        碱性和中性组分, 可用                   碱性和中性组分, , 尤
峰形优异, 柱寿命            碱性组分峰形优异, 柱        于100%全水相, 尤其极                 其碱性组分峰形优异, 柱
长                    寿命长                性组分峰形优异, 柱寿                   寿命长
                                        命长
                         CH3                 R    1                               C18                  C18
      R
                      O Si               O   Si           PG     R                    Si             Si
 O    Si                 CH3                 R1                                   O                   O
                          CH3
      R                                  CH3                                      Silica Support
                       O Si CH3          Si CH
                                                                     Silica-based 色谱柱 Packing with Alkyl/am内径e Stationary Phase
 OH                                             3
      R                   CH3            CH3
                                             R1
                         CH3
      Si              O Si                                                                        极性官能团
 O                                       O   Si           PG     R
      R
                         CH3                 R1
                          CH3            CH3
 OH                    O Si CH3                                                R1
                                         Si CH  3
      R                                  CH
                          CH3              3
                                             R1
 O    Si                 CH3                                                        Si
                      O Si               O   Si                                                             NH             O
                                                          PG     R                          R1
      R                                                                            O        1 1
                         CH3                 R1

                                                         Agilent
                                                      Technologies
                                                                                    29页

                            Zorbax 产品系列
                                     反相色谱柱


     低pH                          中pH                            高pH
            StableBond              Eclipse XDB        Extend
             空间位阻保护                     双封端         双齿键合+双封端


                                                                         Bonus-RP
  SB-C18              SB-CN       Eclipse XDB-C18 Extend-C18           空间位阻保护 + 三封端
80 A & 300 A       80 A & 300 A         80 A      80 A & 300 A             80 A
  pH: 1~8             pH: 1~8           pH: 2~9       pH: 2~11.5          pH: 2~9
                                                                                     可使用
                                                                                    100%水相
   SB-C8              SB-C3        Eclipse XDB-C8
80 A & 300 A       80 A & 300 A          80 A                             SB-AQ
  pH: 1~8             pH: 1~8           pH: 2~9                          空间位阻保护
                                                                           80 A
                                                                          pH: 1~8
  SB-苯基        Poroshell 300SB-C18 Eclipse XDB-苯基
   80 A            实心核多孔壳                80 A
  pH: 1~8             pH: 1~8           pH: 2~9


                                                     Agilent
                                                  Technologies
                      30页


安捷伦HPLC色谱柱维护保
       养




          Agilent
       Technologies
                                                                                   31页


           Zorbax色谱柱=高柱效 +长寿命
                             柱效
                      进样次数    #3       #4
                      1      6635     6138        色谱柱:        ZORBAX SB-C18
                      100             6857                    4.6 x 30 mm, 1.8um
                              6372                流动相:        60% 甲醇: 40 水
Norm.
                  2 200               6882        流速:         1mL/min
  50                          6381                温度:         室温
                      300             6895        检测:         UV 254 nm
                              6381
  40
                      400             6883
                              6294                        样品
                      500             6815
                                                   1.   尿嘧啶
            1                 6312
  30
                      600             6687 3       2.   苯酚
                              6236                 3.   4-Cl-硝基          4
                      700             6653              苯
  20                          6115                 4.   甲苯
                      800             6695
                              6221
  10                  900             6781
                              6300
                      1050     6810   6302
   0                  1300   6858     6528
                      2034   6823     6343
       0        0.5             1                1.5                 2               min


                                                  Agilent
                                               Technologies
                                                      32页
      色谱柱柱内体积和平衡时间
     色谱柱         柱内             平衡时间
      尺寸         体积               流速
     (mm)        (Vm)           1.0 mL/min
    4.6 x 50     0.5 mL           5 min
    4.6 x 30     0.3 mL           3 min
    4.6 x 15     0.15 mL          1.5 min
    4.6 x 150    1.54 mL          15 min

    色谱柱          柱内            平衡时间
     尺寸          体积              流速
    (mm)         (Vm)          0.2 mL/min     1.0
mL/min x 50
    2.1          0.10 mL          5 min      60 sec
    2.1 x 30     0.06 mL          3 min      36 sec
    2.1 x 15     0.03 mL          1.5 min    18 sec

         单次样品运行时间 = 分析时间 + 色谱柱平衡时间
         色谱柱平衡时间 = 10倍柱内体积 ÷ 流速

                              Agilent
                           Technologies
                                    33页

         清洗液相色谱柱

 冲洗色谱柱---用比流动相更强的溶剂


反相色谱柱
用以下溶剂至少各25mL冲洗色谱柱(分析柱)
• 不含缓冲盐的流动相
• 100%甲醇        正相色谱柱
• 100%乙腈
                用以下溶剂至少各50mL冲洗色谱柱(分析柱)
• 75%乙腈+25%异丙醇
                • 50%甲醇+50%三氯甲烷
• 100%异丙醇       • 100%乙酸乙酯
• 100%二氯甲烷 *
• 100%己烷*
*若使用己烷或二氯甲烷冲洗色谱柱, 则在重新使用反相
流动相以前, 必须用异丙醇冲洗色谱柱 !!!


                       Agilent
                    Technologies
                                                                                                              34页

                                               连接管线与接头
      1
                                               1
                                                                                      样品:
                   10 mL 柱外体积                                50 mL 柱外体积(管线) 1. 苯丙胺酸
                                                                                      2. 5-苯基-3, 6-二氧-2-哌嗪乙酸
                                                                                      3. Asp-Phe
                                                                                      4. 天冬甜素

                                                         3
               3                                     2                          色谱柱: StableBond SB-C18, 4.6 x 30 mm,
           2
                                                                        4       3.5 mm
                               4                                                流动相: 85% H2O with 0.1% 三氟乙酸 : 15%
                                                                                ACN
                                                                                流速: 1.0 mL/min
0.0       0.5    1.0     1.5       2.0   0.0       0.5    1.0     1.5   2.0     温度: 35°C
            Time (min)                               Time (min)



                     <0.12mm内径管线用于毛细管HPLC中<2.1内径色谱
                     柱
                     0.17mm内径管线用于分析型HPLC中2.1~4.6内径色谱
                     柱
                     0.25mm内径管线用于半制备型HPLC中9.4内径色谱柱
                     0. 5mm内径管线用于制备型HPLC中21.2内径色谱柱
                                                                                 Agilent
                                                                              Technologies
                                                                            35页


            HPLC常用的色谱柱接头
 Swagelok
安捷伦1100液相
                0.09 in. = 2.33 mm


                                   Waters
   Parker
                                                              0.13 in. =
              0.09 in. = 2.33 mm                              3.37mm


                                   Rheodyne
   Valco
                                                               0.17 in. =
               0.08 in. = 2.07 mm                              4.40mm

   Uptigh                              Troubleshooting LC Fittings,
                                       Part II. J. W. Dolan and P.
     t                                 Upchurch.
              0.09 in. = 2.33 mm       LC/GC Magazine 6:788 (1988)



                                          Agilent
                                       Technologies
                                          36页


HPLC常用的色谱柱接头
  螺母坡度不匹配,密封性差




如果伸出的管线长度过长,可能漏液
                                   死体积区




                 如果伸出的管线长度不够,可能产生死体积


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                                             37页


           活塞杆与密封圈

蓝宝石活塞杆           1/包装        部件号:5063-6586


活塞杆密封圈
(Vespel聚酰亚胺用于反相) 2/包装        部件号:5063-6589

*己烷对Vespel聚酰亚胺有溶涨作用
活塞杆密封圈
(聚乙烯用于正相)        2/包装        部件号:0905-1420




                           Agilent
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                                        活塞杆与密封圈

                                    2                                   2
塔板数 USP拖尾因子 (5%)                                                                      塔板数 USP拖尾因子 (5%)
1. 2235         1.72                          3                                       1. 3670     1.45
2. 3491         1.48                                                                  2. 10457    1.09
                                                                                 3    3. 10085    1.00
3. 5432         1.15         1
                                                                    1




          0.0          0.5            1.0         1.5   0.0   0.5         1.0        1.5    2.0
                                 Time (min)                         Time (min)


                             更换前                                        更换后

          色谱柱: Bonus - RP 4.6 x 75 mm, 3.5 mm                       样品:
          流动相: 30% H2O : 70% MeOH                                   1. 尿嘧啶
          流速: 1.0mL/min 温度:室温                                       2. 苯酚
          检测器: UV 254nm                                             3. N, N-二甲基苯胺


                                                                  Agilent
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                   39页


检测器用灯




       Agilent
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                   40页


检测器用灯




       Agilent
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                   41页


检测器用灯




       Agilent
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                                                42页


      DAD的氘灯替代VWD的氘灯
1. DAD的氘灯替代VWD的氘灯
* 关闭灯电源, 冷却5min以上
* 将lamp设定的VWD configuration的灯类型改为2140-0590

2. 灯能量测试
* 以水为流动相
* 灯预热10min以上
* 在化学工作站Diagnosis状态下进行波长校准, 将紫外灯的使用时间归零




                                    Agilent
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                    样品溶剂溶解强度

                                                      1
色谱柱: ZORBAX StableBond SB-C8, 4.6 x 150 mm, 5 mm
流动相: 82% H2O : 18% ACN
进样体积: 30 mL
                       样品:
                                                              2
                             2   1. Caffeine (咖啡因)
 A. 样品溶剂        1                2. Salicylamide (水杨酰胺)                 B. 样品溶剂
  100% 乙腈                                                                  流动相



          0                      10             0                  10
                Time (min)                            Time (min)


   • 样品溶剂溶解能力强于流动相导致色谱峰峰形问题:裂分峰或宽峰



                                                   Agilent
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    中性分析时为何要使用缓冲液?
色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C8, 4.6 x 75 mm, 3.5 µm   流动相: 44% A : 56% 甲醇
流速: 1.0 mL/min      温度: 25°C              检测: UV 250 nm
样品: 1. ketoprofen 2. ethyl paraben 3. hydrocortisone 4. fenoprofen 5. propyl paraben 6. propranolol 7. ibup

            A = pH 7.0水                           A = pH 7.0         水+25 mM 磷酸缓冲液
    1, 4, 6, 7                                              1

                                                                2        4 5


                                                                                         7
                 2        5
                                                                                 6
                                                                     3
                     3


0       1        2        3       4           0        1        2           3        4       5
               Time (min)                                           Time (min)



    • 含缓冲液的流动相可改善保留, 分离和色谱峰峰形.

                                                         Agilent
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                                                                                                                 47页



                       增加缓冲液浓度减少拖尾
    10 mM 磷酸盐                                          25 mM 磷酸盐                         色谱柱:    ZORBAX Eclipse XDB-
                                                                                         C8
    pH 7.0                                             pH 7.0 USP Tf                             4.6 x 150 mm, 5 mm
                                    USP Tf
     1                                                                    1.1.41         流动相:    40% 磷酸盐缓冲液
                                    1.1.62                                                       60% ACN
                                    2.1.65
                                                          1
                                                                          2.1.50
         2
                                                                          3.1.33         流速:     1.5 mL/min.
                                    3.1.63
                                                              2
                                                                          4.1.39         温度:     40°C
               3                    4.1.77
                                    5.1.83                                5.1.36                样品:
                                                                          6.1.00                Tricyclic Antidepressants
                      4             6.1.12                        3
                                                                      4
                                                                                                (三环抗抑郁剂)
                                5

                                      6
                                                                                5               1. Desipramine(脱甲丙咪嗪
                                                                                                2. Nortriptyline(去甲替林)
                                                                                         6
                                                                                                3. Doxepin(多塞平)
                                                                                                4. Imipramine(丙咪嗪)
                                                                                                5. Amitriptyline(阿米替林)
                                                                                                6. TrImipramine(三甲丙咪嗪

0        2.5                    5.0          7.5   0                      2.5                   5.0
                   Time (min)                                               Time (min)


    • 在中等pH下, 离子强度较高, 能有效掩蔽硅羟基的二次作用减少拖尾

                                                                             Agilent
                                                                          Technologies
                                                                                                  48页


                TEA对碱性成分峰形的影响
                                           色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C8, 4.6 x 150 mm, 5 mm
                                           流动相: 85% 25 mM Na2HPO4 : 15% ACN
                                           流速: 1.0 mL/min. 温度: 35°C
        1
                 pH 7                                              1
                                                                           10 mM
                    No TEA                                                 TEA            USP TF 5%
                                          样品:                              3              1. 1.19
 USP TF 5%                                                             2
 1. 1.29
                2
                      3                                                                   2. 1.18
                                          1. Phenylpropanolamine (去甲麻黄碱)                  3. 1.20
 2. 1.33                                  2. Ephedrine(麻黄素)                    4
 3. 1.63                                  3. Amphetamine(苯丙胺)
                                                                                          4. 1.26
                                                                                      5
 4. 2.35                    4
                                      5   4. MethAmphetamine(脱氧麻黄碱)                       5. 1.14
 5. 1.57                                  5. Phenteramine (苯丁胺)




0.0         2.5                 5.0                       0            2.5                 5.0
                                                                         Time (min)
               Time (min)

                                                                 Agilent
                                                              Technologies
                                                                 49页


      竞争酸对酸性组分的峰形的影响

A:     pH 3           pH 3              pH 2.5
      5 mM        5 mM NaH2PO4       0.1% 三氟乙酸
     NaH2PO4         1% 乙酸
                                           色谱柱: ZORBAX StableBond
                                           SB-C18
                                                  4.6 x 150 mm, 5 mm
                                           流动相: 40% A: 60% ACN
                                           流速:    1.0 mL/min.
                                           温度:    室温

                                           样品:
                                           Ibuprofen(异丁苯丙酸) pKa 4.4

           Tf = 1.8       Tf = 1.0         Tf = 1.09


       • 乙酸和三氟乙酸均能作为竞争酸填加至流动相中
       • 三氟乙酸由于所需浓度较低, 可作为首选
                                         Agilent
                                      Technologies
                                                                         50页
 色谱柱技术 – 5988-6467EN             液相色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C8
 流动相对色谱的影响(TE40)                 色谱柱尺寸: 4.6 x 50 mm 3.5µm
                                 部件号: 935967-906

改变流动相配比方               UV: 254 nm       1.   尿嘧啶         1.   Uracil
 式, 可增加柱效              流速: 1 mL/ min.   2.   尼帕尔金丁酯      2.   Butylparaben
(提高灵敏度)                                 3.   萘           3.   Naphthalene
                       室温               4.   二丙基邻苯二甲酸酯   4.   Dipropylphthalate
                                        5.   苊           5.   Acenaphthene


                                        刻度混合: Dial-a-Mix
                                        A: 水 B: 甲醇, 用泵抽取50% B

                                        体积比混合: Vol/Vol
                                        250 mL水 + 250 mL甲醇, 用泵抽取
                                        100%混合液
                                        定容混合: Mix-to-Mark
                                        250 mL甲醇, 用水定容至500 mL,
                                        用泵抽取100%混合液

                                        预混合(重量比混合): Premixed (w/w)
                                        200 g甲醇 + 200 g水, 用泵抽取100%混
                                                      合液

                                            Agilent
                                         Technologies
                                   51页


           液相分析-小诀窍
1.    提高柱温,可增加柱效(提高灵敏度)
2.    减小柱内径,可增加柱效(提高灵敏度)
3.    缩短检测器响应时间,可增加柱效(提高灵敏度)
4.    减小柱外体积,可增加柱效(提高灵敏度)
5.    使用超纯硅胶,可增加柱效(提高灵敏度)
6.    使用高能量氘灯,可增加柱效(提高灵敏度)
7.    使用中孔透光氘灯,可增加柱效(提高灵敏度)
8.    改变流动相pH ,可增加柱效(提高灵敏度)
9.    改变有机相% ,可增加柱效(提高灵敏度)
10.   改变键合相 ,可增加柱效(提高灵敏度)
11.   改变有机添加剂 ,可增加柱效(提高灵敏度)
12.   改变流动相配比方式 ,可增加柱效(提高灵敏度)




                       Agilent
                    Technologies
                                                            52页
生化 –多肽- 5988-6316EN
升温对于反相 HPLC分离强疏水肽的影响 (B27)   液相色谱柱: ZORBAX StableBond-C18
Polypeptide                  色谱柱尺寸: 4.6 x 250 mm 5µm
                             部件号: 880975-902
 室温

 300C

 400C                          流动相:
                               A: 含0.05%三氟乙酸的水
                               B: 含0.05%三氟乙酸的乙腈
 500C                          2% B / min
                               进样量: 100µL (50µg的6M脲/5%乙酸)
                               UV: 210 nm
                               流速: 1 mL/min
 600C                          室温




                                    提高柱温,可增加柱
 700C                                效(提高灵敏度)




                                  Agilent
                               Technologies
目录P625                                                                               53页

    环保                                               液相色谱柱: Zorbax StableBond-C18
    除草剂: 柱温的影响                                       色谱柱尺寸: 4.6 x 150 mm, 5μm
    Herbicides: Effect of Column Temperature         部件号: 883975-902



                                               40℃                   1. 西玛津
                                                                     2. 敌草隆
                                                                     3. 扑灭津
                                                                     4. 扑灭净
                                                                     5. 异丙甲草胺
 样品:     除草剂
 流动相:    52/48 0.1 M乙酸钠/甲醇, pH 6
 流速:     0.45 mL/min                                  90℃
 温度:     40℃, 90℃
                                                                     1. Simazine
 检测:     UV
                                                                     2. Diuron
                                                                     3. Propazine
                                                                     4. Prometryn
                                                                     5.
         提高柱温,可增加柱                                                         Metolac
          效(提高灵敏度)                                                         hlor




                                                         Agilent
                                                      Technologies
目录P611                                                                       54页

    生物制药                                    液相色谱柱: Zorbax 300 StableBond-C3
    肽类/蛋白质: 升温对分离的影响                        色谱柱尺寸: 4.6 x 150 mm, 5μm
    Peptides/Proteins:                      部件号: 883995-909
    Effect of Elevated Temperature
    样品:      多肽                                     1. 亮氨酸脑啡呔 1     .       Leucine
    流动相:     A = 5: 95, 乙腈 : 水, 0.10%三氟乙酸 (V/V%)    2. 血管紧张素II        Enkephalin
             B = 95: 5, 乙腈 : 水, 0.085%三氟乙酸 (V/V%)   3. 核糖核酸酶A 2. Angiotensin II
    梯度:      在 20 min内 15-53%, 后运行时间 12 min         4. 牛胰岛素    3. Rnase A
                                                    5. 细胞色素C 4. Insulin(BOV)
    流速:      l.0 mL/min                             6. 溶菌酶     5. Cytochrome C
    温度:      室温 -60℃                                7. 肌红蛋白    6. Lysozyme
    检测:      UV 215 nm                              8. 碳酸酐酶    7. Myoglobin
                                                               8.          Carbonic
                                                                      anhydrase




                                                              提高柱温,
                                                              可增加柱效
                                                             (提高灵敏度)




                                                 Agilent
                                              Technologies
目录P611                                                                       55页

    生物制药                                            液相色谱柱: Zorbax StableBond-C8
    减小毛细管内径来提高                                      色谱柱尺寸: 150 mm, 5μm
    低浓度样品的检测灵敏度
                                             流动相:
    Reducing Capillary ID to Improve Sensitivity    60%乙腈/40%水
    for Concentration-Limited Samples        流速:    内径 0.3 mm-4 uL/min
                                                    内径 0.5 mm-10 uL/min
                                                    内径 1.0 mm-50 uL/min
                                                    内径 4.6 mm-1.0 uL/min
                                           温度:      室温
                                           检测器:     UV 254 nm
                                           样品:      200 ng联二苯 (100 nl)



                                                                       减小柱径,可增
                                                                       加柱效(提高灵
                                                                         敏度)




                                                        Agilent
                                                     Technologies
                                                             56页
色谱柱技术 – 5988-6454EN      液相色谱柱: ZORBAX StableBond-C18
使用小体积色谱柱对于检测器            色谱柱尺寸: 4.6 x 15 mm 3.5µm
响应时间的重要性 (TE32)          部件号: 831975-902


                            1.    尿嘧啶       1.   Uracil
            响应时间: 4.0秒      2.    乙酰水杨酸     2.   Acetylsalicylic acid
                            3.    N-乙酰苯胺    3.   Acetanilide

            响应时间: 2.0秒           流动相:
                                 乙腈: 1%甲酸=32: 68
                                 UV: 254 nm
                                 流速: 1.0 mL / min.
            响应时间: 1.0秒           30°C
                                 进样量: 5 µL



            响应时间: 0.5秒
                                 缩短检测器响应时间,可
                                 增加柱效(提高灵敏度)

            响应时间: 0.1秒



                              Agilent
                           Technologies
                                                            57页

色谱柱技术 – 5988-6428EN                液相色谱柱
不同硅胶类型比较 (TE1)

                      Zorbax Sil      1.   甲苯
                                      2.   N-苯甲酰苯胺
                                      3.   苯酚
                                      4.   苯甲醇
                                      1.   toluene
                                      2.   benzanilide
                                      3.   phenol
                                      4.   benzyl alcohol

                      Spherisorb      流动相:
                                      含0.05%甲醇的二氯甲烷




                      Zorbax Rx-Sil           使用高纯硅胶,
                                               可增加柱效
                                              (提高灵敏度)




                                      Agilent
                                   Technologies
                                                           58页

有机化学– 5988-6366EN         液相色谱柱: ZORBAX StableBond-C18
pH对苯胺取代物分析的影响             色谱柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5µm
(ORCH1)                   部件号: 883975-902


                     1.    对位甲氧基苯胺       1.   p-anisidine
           pH: 2.5   2.    间位苯甲胺         2.   m-toluidine
                     3.    3-氨基-苯甲腈      3.   3-amino-benzonitrile
                     4.    对位氯苯胺         4.   p-chloroaniline
                     5.    间位氯苯胺         5.   m-chloroaniline
                     6.    邻位氯苯胺         6.   o-chloroaniline

                     流动相
                     25mM磷酸: 甲醇=58: 42
                     流速: 1 mL/min
                     22°C



           pH: 7.0
                                改变流动相pH,
                                 可增加柱效
                                (提高灵敏度)




                             Agilent
                          Technologies
                                                    59页

生化 –肽– 5988-6293EN        液相色谱柱: ZORBAX 300 SB-C8
三氟乙酸浓度对于反相肽的分离的影响 (B10)   色谱柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5µm
Peptide                   部件号: 883995-906


0.05%三氟乙酸                     流动相:
                              A: 水和三氟乙酸
                              B: 乙腈和三氟乙酸
                              0 - 30% B (30 min.内)
                              流速: 1 mL/min
                              UV: 254 nm
                              进样量: 6uL
0.25%三氟乙酸                     十肽菌素标样S1-S5(疏水性有略微差异)
                              40°C




                                      改变流动相pH,
1.0%三氟乙酸                               可增加柱效
                                      (提高灵敏度)




                               Agilent
                            Technologies
                                                                 60页

食品分析– 5988-6360EN             液相色谱柱: ZORBAX NH2
流动相强度对单糖和二糖分离的影响 (FD4)        色谱柱尺寸: 4.6 x 250 mm 5µm
                              部件号: 880952-708

              乙腈/水
                         1.     果糖           1.    Fructose
              70/30      2.     葡糖           2.    Glucose
                         3.     蔗糖           3.    Saccharose
                         4.     Palatinose   4.    Palatinose
                         5.     海藻糖          5.    Trehalulose
                         6.     异麦芽糖         6.    Isomaltose

                                    流动相:
                                    乙腈/水如图
                                    流速: 1 mL/min
                                    示差折光检测器

              乙腈/水
              75/25
                                     改变有机相%,
                                      可增加柱效
                                     (提高灵敏度)




                                 Agilent
                              Technologies
                                                                      61页
                                               液相色谱柱: ZORBAX StableBond-CN
         色谱柱技术 – 5988-6468EN                   色谱柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5µm
         有机改性剂和pH对于选择性的影响 (TE5)                部件号: 883975-905
流动相:              1.   anisidine        1.   甲氧基苯胺
25 mM磷酸缓冲液        2.   m-toluidine      2.   间位苯甲胺
                  3.   4-cl-aniline     3.   4-氯-苯胺
流速: 1.0 mL/min.   4.   3-aminobenzonitrile
                                        4.   3-氨基苯甲腈
22°C              5.   3-cl-aniline     5.   3-氯-苯胺
                  6.   2-cl-aniline     6.   2-氯-苯胺
  42%甲醇 :58%缓冲液                       30%甲醇 :70%缓冲液

                           pH 2.6
                                                              改变有机相%,
                                                               可增加柱效
                                                              (提高灵敏度)




                             pH 3.0




                                                  Agilent
                                               Technologies
                                                                      62页
色谱柱技术 – 5988-6453EN      液相色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl
ZORBAX Eclipse系列色谱柱      色谱柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5µm
的选择性 (TE31)              部件号: 993967-912


           Zorbax Eclipse XDB-苯基                   1.     Uracil
                                    1.   尿嘧啶
                                    2.   苯酚        2.     Phenol
                                    3.   4-氯-硝基苯   3.     4-Cl-nitrobenzene
                                    4.   甲苯        4.     Toluene
                                    5.   萘         5.     Naphthalene

                                      流动相:
                                      甲醇 : 水=70: 30
            Zorbax Eclipse XDB-C8
                                      UV: 254 nm
                                      流速: 1.0 mL / min.
                                      室温



           Zorbax Eclipse XDB-C18            改变键合相,
                                              可增加柱效
                                             (提高灵敏度)




                                       Agilent
                                    Technologies
目录P613                                                                      63页

    生物制药                                        液相色谱柱: Zorbax Extend-C18
    三氟乙酸和氢氧化铵用于肽类                               色谱柱尺寸: 2.1 x 150 mm, 5um
    RP-HPLC\ESI-MS分离的选择性比较                      部件号: 773700-902
    Selectivity Comparison of TFA and
    NH4OH for Peptide RP-HPLC\ESI-MS Analysis
            流速:      0.25 mL/min.
                                                    三氟乙酸条件:
            温度:      25℃
            梯度:      5-60% B in 20 min.             A- 0.1%三氟乙酸水溶液
            LC/MS:   正离子, ESI- Vf 70V, Vcap 4.5 kV, B-0.085%三氟乙酸 80%的乙腈溶液
                     N2- 35 psi, 12 L/min., 300℃
            样品:      4μL (各50 ng)


                                                    改变有机添加剂,
                                                      可增加柱效
                                                     (提高灵敏度)




                                                 NH4OH条件:
                                                 A- 20 mM NH4OH水溶液
                                                 B- 20 mM NH4OH 80%的乙腈溶液



                                                    Agilent
                                                 Technologies
                                                                      64页

生化 – 肽 –十肽菌素 – 5988-6299EN        液相色谱柱: ZORBAX 300 SB-C8
酸对于反相肽的分离的影响(B16)                 色谱柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5µm
decapeptide                       部件号: 883995-906


                             1.    十肽菌素 S1     1.    decapeptide S1
 0.1% 三氟乙酸                   2.    十肽菌素 S2     2.    decapeptide S2
                             3.    十肽菌素 S3     3.    decapeptide S3
                             4.    十肽菌素 S4     4.    decapeptide S4
                             5.    十肽菌素 S5     5.    decapeptide S5

                             流动相:
                             A: 含相应的酸的水相
                             B: 含相应的酸的乙腈
                             0%-30% B(30 min.内)
                             进样量: 6µL肽标样
                             UV: 254 nm
 0.025 M H3PO4               流速: 1 mL/min
                             40°C
                                                    改变有机添加剂,
                                                      可增加柱效
                                                     (提高灵敏度)




                                       Agilent
                                    Technologies
                                                                         65页
 色谱柱技术 – 5988-6467EN             液相色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C8
 流动相对色谱的影响(TE40)                 色谱柱尺寸: 4.6 x 50 mm 3.5µm
                                 部件号: 935967-906

改变流动相配比方               UV: 254 nm       1.   尿嘧啶         1.   Uracil
式,可增加柱效                流速: 1 mL/ min.   2.   尼帕尔金丁酯      2.   Butylparaben
(提高灵敏度)                                 3.   萘           3.   Naphthalene
                       室温               4.   二丙基邻苯二甲酸酯   4.   Dipropylphthalate
                                        5.   苊           5.   Acenaphthene


                                        刻度混合: Dial-a-Mix
                                        A: 水 B: 甲醇, 用泵抽取50% B

                                        体积比混合: Vol/Vol
                                        250 mL水 + 250 mL甲醇, 用泵抽取
                                        100%混合液
                                        定容混合: Mix-to-Mark
                                        250 mL甲醇, 用水定容至500 mL,
                                        用泵抽取100%混合液

                                        预混合(重量比混合): Premixed (w/w)
                                        200 g甲醇 + 200 g水, 用泵抽取100%混合
                                                       液

                                            Agilent
                                         Technologies
                                                                          66页
                                    附录-1
倍数                                      前缀       符号
1,000,000,000,000,000,000 = 1018                 exa-     E
1,000,000,000,000,000 = 1015            peta-    P
1,000,000,000,000 = 1012                         tera-    T
1,000,000,000 = 109                     giga-    G
1,000,000 = 106                                  mega-    M
1,000 = 103                             kilo-    K
100 = 102                               hecto-   H          mg/mL = 1,000 ppm
10 = 101                                         deka-    da
0.1 = 10-1                              deci-    d
0.01 = 10-2                             centi-   c
0.001 = 10-3                            milli-   m
0.000 001 = 10-6                                 micro-   u
0.000 000 001 = 10-9                    nano-    n
0.000 000 000 001 = 10-12                        pico-    p
0.000 000 000 000 001 = 10-15           femto-   f
0.000 000 000 000 000 001 = 10-18                atto-    a


ppm ( part per million) = mg/kg, ug/g, ng/mg, pg/ug, mg/L, ug/mL, ng/uL
ppb ( part per billion) = ug/kg, ng/g, pg/mg, ug/L, ng/mL, pg/uL

ppt ( part per trillion) = ng/kg, pg/g, fg/mg, ng/L, pg/mL, fg/uL
                                                  Agilent
                                              Technologies
                                            67页
                  附录-2

            反相HPLC常用缓冲液
 pH < 2.5
            缓冲液       pKa       pH范围
 磷酸 0.1%    磷酸盐pK1    2.1       1.1~3.1
三氟乙酸 0.1%   柠檬酸盐pK1   3.1       2.1~4.1
            甲酸盐       3.8       2.8~ 4.8
            柠檬酸盐pK2   4.7       3.7~5.7
            乙酸盐       4.8       3.8~5.8
            柠檬酸盐pK3   5.4       4.4~6.4
            磷酸盐pK2    7.2       6.2~8.2
            羟甲基甲胺     8.3       7.3~9.3
            氨         9.2       8.2~10.2
            硼酸盐       9.2       8.2~10.2
            甘氨酸       9.8       8.8~10.8
            1-甲基-哌啶   10.3      9.3~11.3
            四氢化吡咯     10.5      9.5~11.5
            二乙胺       10.5      9.5~11.5
            三乙胺       10.7      9.7~11.7
            磷酸盐pK3    12.3      11.3~13.3



                                Agilent
                             Technologies

								
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