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							題目：細菌的鑑別染色法- 革蘭氏染色法（Gram stain）


目的：藉由此實驗讓學生練習細菌的鑑別染色方法，革蘭氏染色可將細菌區分為革蘭氏
   陽性菌及陰性菌。


原理：鑑別染色需要先將細菌熱固定於玻片上，利用四種化學藥劑：結晶紫為初染劑，
   使細菌著色，細菌呈現藍紫色；革蘭碘為媒染劑，加強結晶紫的染色效果；95%
   的酒精為脫色劑，脫去初染劑的顏色，也是關鍵步驟；番紅為複染劑，與初染呈
   對比顏色。因為細胞壁結構不一樣，革蘭氏陽性菌會被染成藍紫色，而革蘭氏陰
   性菌則被染成紅色。


材料：液態培養菌液（大腸桿菌 Escherichia coli 與枯草桿菌 Bacillus subtilis）、玻片、顯
   微鏡、試鏡紙、酒精燈、染劑（結晶紫、革蘭碘、95%酒精、番紅）                     。


實驗步驟：


1. 以試鏡紙將玻片擦乾淨，以簽字筆在玻片背面畫一個小圓圈。
2. 使用接種環取一點菌液（環部分形成一薄膜），塗抹於玻片中央，將接種環再燒紅滅
   菌。大腸桿菌（EC）與枯草桿菌（BS）分別取，於空氣中乾燥，熱固定（玻片背面
   用火烤一下） 。
3. 滴結晶紫覆蓋塗抹區，靜置一分鐘，以 RO 水輕洗。（在水槽邊操作）
4. 滴革蘭碘試劑染一分鐘，以 RO 水輕洗。
5. 以 95%酒精脫色，將玻片放傾斜，酒精逐滴滴下，勿脫色過頭，以蒸餾水輕洗。
6. 滴番紅試劑染染 45 秒，以蒸餾水輕洗。
7. 以吸水紙吸乾水分或陰乾，以 100 倍油鏡觀察。


附註：革蘭氏染色法四種化學藥劑的作用原理
   初染劑：結晶紫(Crystal violet)是一種鹼性溶劑，可與細胞壁中的胜肽聚醣緊密結
       合，使細菌染成藍紫色。
   媒染劑：革蘭碘液(Gram's iodine solution)，可與結晶紫結合形成不溶性複合物，加
       強結晶紫的顏色。
   脫色劑：95%酒精，酒精可溶解掉革蘭氏陰性菌細胞壁中外層的脂多醣（LPS）           ，
       而使的結晶紫釋出，使菌體成無色。革蘭氏陽性菌細胞壁之脂質含量低，
       酒精很難讓結晶紫完全釋出，因而保留了藍紫色，但若脫色時間太久也會
       導致菌體成無色。
   複染劑：番紅(safranin)可將脫成無色的革蘭氏陰性菌染成紅色，而革蘭氏陽性菌因
         保有初始的藍紫色，番紅無法將其再染色。


宜使用培養 16~24 小時之細菌。因菌齡老化，革蘭氏陽性菌之胜肽聚醣易失去保留初染
劑結晶紫的能力，而使的份菌體染呈藍紫色，部份呈紅色。