Se obtienen por cultivos de cepas seleccionadas de hongos Aspergillus oryzae o bacterias Bacillus subtilis by 203x8y1

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									 5.10.- PURIFICACION DE ENZIMAS A PARTIR DE ALIMENTOS (REVISIÓN
               DE ENZIMAS DE IMPORTANCIA EN ALIMENTOS)


     Esta sección mencionará algunos de los aspectos más relevantes de las enzimas cuyas
actividades son importantes en la conservación y procesamiento de alimentos o en la
producción de materias primas. Se revisarán a las enzimas que hidrolizan carbohidratos,
enzimas que hidrolizan proteínas, a las que hidrolizan lípidos y otras reacciones
enzimáticas que son importantes en sistemas alimenticios. En el cuadro se presenta
resumen de las aplicaciones más importantes de enzimas en alimentos.
     Aun cuando se sabe que las propiedades de las enzimas in situ pueden ser muy
diferentes a las de las enzimas puras estudiadas en el laboratorio, está plenamente
justificada la necesidad de tener preparaciones puras para hacer el estudio químico
completo de su actividad. En la actualidad se han cristalizado o purificado de manera
adecuada cerca de unas 200 enzimas (del posible total de unas 5000) y quizás en los
próximos años aumente de modo considerable este número.
     Para extraer las enzimas de las células que las contienen, a menudo es necesario
dividir finamente el tejido, por medio de un homogeneizador o una licuadora; los
tratamientos más enérgicos comprenden la molienda del tejido con arena el empleo de
vibraciones ultrasónicas, los procesos alternados de congelamiento y descongelamiento, la
autolísis , el desecado con calor o el empleo de solventes como la acetona, el éter y el
tolueno. El desecado con acetona y la producción de los llamados polvos acetónicos
constituyen un excelente ejemplo de rotura de la membrana celular y la obtención de un
material rico en enzimas y de fácil conservación. Cuando las enzimas están asociadas a
lípidos, como sucede con las enzimas mitocondriales, es ventajoso el tratamiento con
sustancias de tipo detergente o con butanol que disgregan la estructura lipoprotéica y
permiten la salida de las enzimas.
     La purificación de las enzimas con método de precipitación fraccionada recurre a
diversos procedimientos, el cambio de pH quita las nucleoproteínas y el material grueso,
con lo que se facilitan los pasos siguientes. Con el empleo del calor a veces se logra la
desnaturalización de material proteico inactivo.
     En otros casos se emplean solventes orgánicos como el etanol, muy utilizado para
separar diversas proteínas del suero sanguíneo y la acetona; o las sales, como el sulfato de
amonio, que es muy soluble en agua, por lo que se puede manejar a elevadas
concentraciones, y en general no ataca la estructura de las enzimas. La absorción fraccional
tiene gran utilidad para absorber gran material indeseable o para absorber la enzima y luego
desprenderla del material absorbente en una forma más pura; muy usado con este fin en el
gel de aluminio C.
     En los últimos años se han logrado adelantos notables en materia de fraccionamiento
proteico con el empleo de técnicas cromatográficas en columnas que se basan en
fenómenos de absorción, de intercambio iónico o de una verdadera "filtración molecular".
Se agrega a una columna con el material activo la solución de la enzima que queda fijada a
dicho material; se lava la columna con soluciones de sales, cada vez más concentradas o
con distinto pH, etc. , y se recogen los lavados en fracciones de volúmenes determinadas;
en alguna porción sale la enzima en estudio, en forma más pura.
     El paso final de la purificación es el de la cristalización de la enzima que debe
repetirse varias veces pues los primeros cristales suelen estar contaminados con otras
enzimas. A pesar de esto, la obtención de cristales no demuestra que la enzima esté 100%
pura, es solo obtención de una actividad específica de un valor constante ante las
recristalizaciones repetidas la que ofrece la seguridad de su pureza.
     El estudio de la pureza de una enzima comprende la aplicación de las técnicas
empleadas para el estudio de la pureza de las proteínas, el análisis por ultracentrífuga, el
análisis electroforético, etc. Sin embargo, aún es posible, si se somete la enzima a
fraccionamientos más sensitivos, como los de la electrofóresis en gel de agar, de almidón, o
de acrilamida demostrar que la enzima en cuestión puede estar formada por varias
proteínas, algunas de las cuales tienen la misma actividad enzimática, pero que por tener
propiedades físicas o estructurales diferentes se deben considerar como isoenzimas, y otras
que son proteínas que se han procesado a lo largo d todas las etapas de purificación.
     En general las enzimas se consideran especies químicas homogéneas y puras cuando
llenan requisitos como los siguientes: su actividad no debe aumentar después de que se la
recristaliza repetidas veces; su solubilidad no aumenta al elevar la cantidad de cristales de
la proteína problema que se pone en solución; tanto en el análisis realizado con la
ultracentrífuga como en los diversos métodos electroforéticos se encuentra un patrón de
movilidad único y persistente.




5.10.1 PAPAINA, BROMELINA


Enzimas que se aplican en la industria de la carne y derivados.

PAPAÍNA. Se obtiene por purificación del zumo lechoso (látex) coagulado, proveniente de
ligeras incisiones longitudinales que se practican en la superficie de los frutos bien
desarrollados, pero aún no maduros de la papaya (Carica papaya).

BROMELINA. Se obtiene por precipitación con acetona del jugo resultante de la presión
de los tallos recién brotados de la Bromeliácea, la piña (Ananas comosus, sativa).
FICINA. Se obtiene del látex coagulado proveniente de cortes o incisiones practicados en
los brotes de los tallos de la higuera (Ficus sp.). Se puede purificar la ficina por
precipitación con acetona o etanol, redisolución en agua, nueva precipitación con acetona y
desecación al vacío; con un rendimiento de unos 11-12 g de polvo a partir de 100 m1 de
látex (22).

PROTEASAS MICROBIANAS.

Se obtienen por cultivos de cepas seleccionadas de hongos (Aspergillus oryzae) o bacterias
(Bacillus subtilis).

Acción: Todas estas proteasas hidrolizan gran número de proteínas diferentes a través de
polipéptidos hasta aminoácidos; también desdoblan amidas y ésteres de aminoácidos.
pH óptimo: 4-8 (vegetal); 2-10 (fúngico); 6-2 (bacteriano).


Aplicación: Durante el proceso de maduración de la carne que sigue al de rigidez
cadavérica, las transformaciones autolíticas, causadas por sus enzimas proteolíticas
(catepsinas) suministran a la carne una textura blanda, jugosa, masticable, de sabor
agradable y apta para la cocción y digestión (41). Como esta maduración natural suele ser
prolongada (12 días), se puede acelerar artificialmente mediante la adición de proteasas
extrañas para así aumentar la ternura de la carne (meat tenderizer).


       Al atacar por proteólisis las fibras musculares y /o los componentes del tejido
conectivo (colágeno, elastina, actomiosina) se logra un relajamiento de los enlaces
peptídicos de las proteínas y con ello el ablandamiento de la carne.
       Siendo la papaína la enzima más usada para estos fines, existen también preparados
a base de mezclas de proteasas de origen tanto vegetal como también fúngico y bacteriano
que serían aún más eficaces.
       Estos ablandadores de la carne se pueden aplicar por pulverización, en la superficie,
con preparados enzimáticos secos, como, p. ej., una mezcla de 88%, de sal de comer (como
sustancia portadora); 4,5%, de almidón (para hacerla más espolvoreable); 4,5% de papaína
al 1:350, 2% de citrato de sodio cristalizado y 1% de glutamato de sodio, extracto de carne
y condimentos. También suelen agregarse polifosfato, glutatión o cisteína y ácido ascórbico
como estabilizadores.
       La aplicación puede efectuarse también por inmersión o por dispersión (spray) con
soluciones acuosas o hidroalcohólicas de 2 a 5% de la enzima. Después de 30 minutos y
hasta un máximo de 3 horas a la temperatura ordinaria debe procederse a la preparación
culinaria de la carne, como la cocción y el asado rápido (bisteques, escalopas) para evitar
que la superficie se vuelva pegajosa. En el caso de carne destinada a ser congelada, se
sumergen los trozos en solución de papaína, adicionada eventualmente de ácido láctico y
sal de comer, y después de 20 a 30 minutos se congela.
       Las proteasas, como la papaína, pueden aplicarse también premortem por inyección
en la vena yugular hasta 30 minutos antes de la matanza, con el objeto de aprovechar la
distribución homogénea de la enzima por efecto de la circulación sanguínea, aunque suelen
producirse hemorragias o edemas en órganos internos del animal vivo. Esto puede evitarse
por tratamiento previo de la papaína o ficina con álcali (pH 11-12), lo que las inactiva en
forma reversible. A veces se han observado también reacciones defensivas en el organismo
del animal vivo que inactivan la enzima inyectada. Este inconveniente no se presentará al
hacer la inyección postmortem, después de la matanza, en la arteria del animal desangrado,
pero aún caliente.
       También se ha propuesto inyectar premortem compuestos azufrados copio
metionina, cisteína, glutatión o sales inorgánicas azufradas, que serían capaces de aumentar
la actividad de las proteasas naturales del tejido muscular de la carne, las cuales
desdoblarían entonces las fibras musculares con efecto de tenderización de la carne.
       En la carne liofilizada la aplicación de estas proteasas tiene el efecto de facilitar la
rehidratación, al aumentar, por la proteólisis, la capacidad de fijación de agua.
También en los pescados tiene lugar, después de la pesca, una cierta maduración natural
que influye en su sabor y textura. Como en la proteólisis de esta maduración intervienen,
fuera de las enzimas del tejido muscular (catepsinas), también otras de origen
gastrointestinal, éstas no podrán actuar si el pescado es eviscerado antes del salado, p. ej.,
en la preparación de preservas. En estos casos una adición de proteasas fúngicas al liquido
del curado de los trozos fileteados puede ser útil, como también en la elaboración de
condensados solubles de pescado.
PAPAÍNA

       La papaína que se extrae de la papaya es una enzima proteolítica, es decir, con
capacidad para digerir las proteínas de los alimentos. Similar a la pepsina, una enzima que
está en nuestro jugo gástrico, sus aplicaciones son en distintas áreas.
       La papaína se consigue por la extracción del látex, que es un líquido blanco
obtenido mediante cortes en los frutos inmaduros. Luego, en laboratorio, se separa la
enzima y se purifica hasta alcanzar un nivel óptimo de calidad para la comercialización y
uso. La enzima se usa en estado líquido y tiene una duración mínima de seis meses estando
refrigerada.
       La cualidad principal de la papaína es el uso como mejorador de las carnes,
(ablandamiento y aclaramiento), y el aclaramiento y evitación de sedimentación en las
cervezas por su acción en los enlaces de las proteínas. En la industria cosmética, se
aprovecha su poder desmanchador y cicatrizante.
       Además de sus usos en la industria de la carne y la cerveza, esta enzima es requerida
en áreas como la farmacéutica y la cosmética, donde se utiliza en la fabricación de cremas
desmanchadoras de la piel, que consumen aproximadamente un 10% de la producción
mundial, y van en alza.
       Por otra parte, la papaína es uno de los componentes utilizados por laboratorios
oftalmológicos para fabricar tabletas enzimáticas para la limpieza de lentes de contacto.
También forma parte de suplementos dietarios, debido a su capacidad de favorecer el
proceso digestivo, y de procesos de depuración de aguas.
       Paralelamente, se comienzan a descubrir otras aplicaciones de la papaína en
negocios como la industria textil, papelera, curtido de cuero, así como en procesos de
depuración de residuos líquidos y en investigación de química analítica. Entre los países
que la exportan se encuentran Chile, Tanzania, Uganda, Zaire, Sri Lanka, Tailandia e India.



BROMELINA

       La Bromelina es una enzima que degrada proteínas y que se extrae de la piña. Desde
tiempos inmemoriales ha sido utilizada por el hombre americano como efectivo agente
terapéutico. Tanto la medicina como la industria moderna utilizan este tipo de enzimas
vegetales siguiendo más o menos los mismos principios que nuestros ancestros.
       Los isleños bebían jugo de piña como una ayuda a la digestión y como cura para el
dolor de estómago, en especial luego de una abundante comida; las mujeres lo usaban como
agente de limpieza para mejorar la textura de su piel y los guerreros trataban las heridas con
la pulpa del fruto para ayudar a la cicatrización.
       En la actualidad, los bioquímicos dedicados a la extracción de compuestos de origen
vegetal han encontrado una explicación para estos variados usos: la planta de la piña es una
rica fuente de Bromelina, una enzima que ayuda a la digestión dado que puede hidrolizar
grandes moléculas proteicas a pequeños péptidos y aminoácidos.
       El jugo de piña proporciona un activo ingrediente a las lociones para el cuidado de
la piel, porque la bromelina que contiene destruye las capas externas, muertas o dañadas de
la piel quedando expuestas las capas internas más suaves. Este mismo efecto ha sido usado
para la eliminación de verrugas. También los isleños de Guadalupe hablan descubierto que
preparaciones concentradas removían el pelo del cuerpo, esta vez porque la romelina
hidroliza otra proteína: la queratina, constituyente esencial del pelo.
       Colón estaba más interesado en la guerra que en la cosmética, y se interesó
vivamente en las capacidades cicatrizantes de la bromelina, que agregaba a su capacidad
degradadora de tejido dañado una propiedad antiséptica, pues atacaba las bacterias dejando
la herida limpia y seca.


Las aplicaciones terapéuticas


       Científicos modernos están investigando un amplio rango de aplicaciones para la
bromelina, muchas de las cuales se basan en los antiguos remedios.
       En primer lugar, la bromelina puede ayudar en el tratamiento de la trombosis
coronaria que se caracteriza por un bloqueo de los vasos sanguíneos por coágulos
estructurados por una proteína llamada fibrina. Los ataques al corazón son a menudo
causados por un bloqueo de los vasos sanguíneos que irrigan el corazón. Una situación
similar se observa en los accidentes vasculares cerebrales.
           La formación de coágulos sanguíneos es un proceso que ocurre -naturalmente en
individuos normales pero que está controlado por un delicado balance entre la formación de
coágulos y su degradación. La bromelina parece promover selectivamente la degradación
natural de coágulos de sangre, sin causar hemorragias, en sujetos que presentan bloqueos en
vasos sanguíneos.
           La sangre contiene una proteasa natural que degrada coágulos, llamada plasmina, la
cual debe ser activada desde su forma inactiva, el plasminógeno. Si este sistema natural no
está balanceado, los niveles de plasminas pueden estar bajos, permitiendo que los coágulos
persistan y bloqueen los vasos sanguíneos. Investigaciones realizadas por Steven Tanssing
en Hawai, han demostrado que la bromelina puede estimular la conversión de
plasminógeno en plasmina, lo cual permite des-hacer eficientemente los coágulos de
fibrina.
           La bromelina también presenta una propiedad "antitrombótica" mediante la cual
bloquea la conversión de protrombina en trombina, reduciendo de este modo la formación
de coágulos. El efecto antiinflamatorio de la bromelina está relacionado con este sistema.
Trabajos hechos por Taussing y Col. sugieren que la bromelina es una droga anti-
inflamatoria mejor que las drogas no-esteroidales, tal como lo es la aspirina. Mientras que
la aspirina inhibe la síntesis de todas las prostaglandinas, la bromelina es más selectiva e
inhibe la producción sólo de aquellas que aumentan la inflamación, sin afectar las antí-
inflamatorias. Por su parte, el trauma y el stress prolongado tienden a desplazar el balance
hacia las prostaglandínas proinflamatorias, proceso que es contrarrestado por bromelina que
tiende a restablecer el equilibrio perdido.
           A pesar de lo interesante que pueden parecer estos resultados, se requiere aun de
mayor información acerca del posible mecanismo de acción a través del cual la bromelina
actúa en el organismo.
           El efecto terapéutico de bromelina puede, de este modo estar dado por la actividad
proteásica o por otro componente del extracto del tallo, como son aunque parezca
paradojal, los inhibidores de proteasas".
           La bromelina, es un tipo de enzima proteolítica la cual puede ser separada del jugo
de los tallos de piña por precipitación en una solución de metanol. Esta ha sido
ampliamente conocida y usada en los diez años pasados. En la industria de alimentos, su
mayor aplicación es en el macerado o ablandado de la carne, en el enfriamiento de la
cerveza, en productos de proteínas solubilizadas, en desechos de pescados, así como
también, en la producción de proteínas hidrolizadas. También ha sido utilizado en
propósitos útiles tal como proteínas digestivas para desordenes internos. Los residuos de los
tallos de piña, como producto derivado del procesamiento de bromelina, pueden ser usado
como un aditivo en alimentos animales y como un medio para el cultivo de plantas tales
como orquídeas y plantas de té. Una apreciación del valor del citrato de calcio, producto
derivado de la refinación del ácido cítrico, también es un producto derivado en el
procesamiento de bromelina. Por lo tanto, la producción industrial de la bromelina tiene un
elevado valor aditivo.


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