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KlinFor Workshop B16 �Die neuen Tuberkulose Tests� by mnQS4mt

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									KlinFor Workshop B16 ‚Die neuen Tuberkulose Tests‘




             QuantiFERON®-Gold In Tube
                   T-SPOT.TB Test




                            Detlev Schultze
                   Dr. med. Dipl Biol. Leitender Arzt
    Institut für Klinische Mikrobiologie und Immunologie, St. Gallen
Lungen-Tuberkulose versus latente Infektion, CDC 2005
        Lungentuberkulose                    Latente Infektion
 •   TST oder y-Interferon positiv    •   TST oder y-Interferon positiv
 •   Röntgen Lunge positiv            •   Röntgen Lunge negativ
 •   Husten +/- Blut im Sputum
     +/- B-Symptomatik                •   Keine Symptome einer
                                          Tuberkulose
 •   Positiv
     Mikroskopie +/- PCR +/- Kultur   •   Proben ohne Erregernachweis
     aus respiratorischen Proben
Diagnostik der Lungen Tuberkulose




                                 Identifizierung mit PCR
                                    und Gensonden




               Reistenztestung
                                                           Adaptiert nach Handbuch
                 - Ethambutaol
                                                           Tuberkulose, Lungenliga
                 - Pyrazinamid                                     CH 2007
                 - Isoniazid
                 - Rifampicin
Diagnostik der latenten Tuberkulose




                     Tuberculosis-
                    Skin-Test (TST )



                    Interferon-
                      Gamma
                                       QuantiFERON-Gold
                      Release               In Tube
                   Assay (IGRA)            [Cellestis]



                                           T-SPOT.TB
                                       [Oxford Immunotec])
Vergleich IGRA - TST

Interferon-Gamma Release       Tuberculosis-Skin-Test (TST )
   Assay (IGRA)
 In vitro                        In vivo
 Spezifische Antigene            Weniger spezifische Antigene
 Keine Boosterung                Boosterung
 1 Patienten Visite +            2 Patienten Visiten
   Laborkosten
 Minimale Test-Variabilität    höhere Test-Variabilität
 Resultate in 2 Tagen          Resultate in 2 - 3 Tagen
 ESAT 6 und CFP10 im Interferon-Gamma Release Assay (IGRA)

                                            Mycobacterium-Genom:
Komplex mit                                   Region of Difference 1 (RD1)
CFP-10
und ESAT-6                                   codiert für ESX-1 Sekretionssystem zur
                                              Ausschleusung von Early Secretory Antigenic
                                              Target (ESAT-6) und Culture Filtrate Protein
                                              10 (CFP-10) aus Mycobacterium-Zelle
                                             vorhanden in Mycobacterium tuberculosis
                                             → Fähigkeit zur lokalen Ausbreitung und Lyse
                                              von Pneumocyten
                                             Deletion aus Mycobacterium bovis
                                               Virulenz Minderung
                                             fehlt in attenuiertem M.bovis –Stamm = Bacille
                                              Calmette-Guérin
                                             Rekonstitution in transgenem BCG Stamm
                                              → Virulenz Erhöhung
              EMBO Journal 2005 / Champion et al 2007 / Wards et al 2000 / Onyebujoh 2004
ESAT 6 und CFP 10 in Mycobacteriaceae

   Tuberculosis           Antigene       Environmental         Antigene
   complex          ESAT-      CFP-10    strains            ESAT-6   CFP-10
                      6
                                         M abcessus           -        -
   M tuberculosis    +           +       M avium              -        -
   M africanum       +           +       M branderi           -        -
                                         M celatum            -        -
   M bovis           +           +       M chelonae           -        -
   BCG substrain                         M fortuitum          -        -
     gothenburg       -              -   M gordonii           -        -
     moreau           -              -   M intracellulare     -        -
                                         M kansasii           +        +
     tice             -              -   M malmoense          -        -
     tokyo            -              -   M marinum            +        +
     danish           -              -   M oenavense          -        -
     glaxo            -              -   M scrofulaceum       -        -
                                         M smegmatis          -        -
     montreal         -              -   M szulgai            +        +
     pasteur          -              -   M terrae             -        -
                                         M vaccae             -        -
                                         M xenopi             -        -
T-SPOT.TB – Blutaufbereitung in Vacutainer CPT™ Röhrli

Enzyme-Linked Immunospot (ELISpot) Technologie

             Röhrli zentrifugieren

             Lymphocyten Bande aufnehmen

             Lymphozyten zählen und waschen

             Lymphozyten in 96-Platte

             TB Antigene zugeben

             Übernacht Inkubation
T-SPOT.TB – Spot Bildung



   Platte waschen
   Detektionsreagenz zugeben
                                  negativ
   60 min inkubieren
   Platte waschen
   Farbreagenz (Substrat)
    zugeben                       positiv
   Spots innerhalb 7 min
   Platte waschen und trocknen
T-SPOT.TB – Spot Zählung

   Mit blossem Auge und Vergrösserungsglas

   Alternativ mit automatisiertem ELISPOT imager




                                      Above: Automated T-SPOT plate reader
QuantiFERON®-Gold In Tube

                       Null      TB    Mitogen




     Interferon-y Spiegel                                    T-Zellen durch
     vor TB-Stimulation ?                                    Phythämagglutinin
                                                             stimulierbar?

                            T-Zellen durch ESAT-6, CFP-10,
                            TB7.7 stimulierbar ?
QuantiFERON®-Gold In Tube

1 Blut Entnahme und Vorbereitung für Test
  NULL    TB   Mitogen
                                                                        -Interferon stabil
                                                                         im Kühlschrank
                                                                        (+4°C) 8 Wochen
                          Inkubation 37ºC          Zentrifugation
      3x1ml Blut           16-24 Stunden             5-15 min



 Option 1: Versand Blutröhrchen innerhalb 16 Stunden an Labor, vor Inkubation.


 Option 2: Versand Blutröhrchen innerhalb 3 Tagen an Labor, nach Inkubation


 Option 3: Sammlung der Proben nach Zentrifugation, ans labor zur -Interferon Messung
 QuantiFERON®-Gold In Tube

2 γ-Interferon ELISA



                   Inkubation 120
                     min Raum-
                                                       Stop Lösung
                     Temperatur                                         Ergebnis-
  Plasma und                         Waschen und           und
                                                                       berechnung
   Konjugat                           Substrat         Extinktions-
                                                                         [IE/ml]
                                       Zugabe           Messung




 Durchführung 1-2 x pro Woche


 Positive Ergebnisse → Wiederholung im Doppel → Befund reproduziert
QuantiFERON®-Gold In Tube

3 Befundung
QuantiFERON®-Gold In Tube - versus - T-SPOT.TB test
QuantiFERON®-Gold In Tube - versus - T-SPOT.TB test
QuantiFERON®-Gold In Tube – Blutentnahme bis Plasmagewinnung

 Blutentnahme                                       Massnahme bei Abweichung

 Röhrchen-Füllung mit Blut bis Markierung = 1 ml,   Neues Röhrchen füllen
 Test validiert für 0.8-1.2 ml

 Transport                                          Beachten

 Lagerungsposition irrelevant                       vor 37°C Inkubation
                                                    → erneutes 5 sec- Mischen

 37°C Inkubation ?   - nein                         16 Stunden           17 - 27°C
                     - ja                           72 Stunden           17 - 27°C
                     - ja + Zentrifugation          8 Wochen             4°C

 Inkubation bei 37°C                                Massnahme bei Abweichung

 Röhrchenposition aufrecht – Kappe nach oben        Erneute Blutentnahme

 Plasmagewinnung                                    Massnahme bei Abweichung

 - Zentrifugation (5-15 minutes 1‘500–2‘200 g)      Gel hat Blutkuchen nicht vom Plasma
 - Sedimenation im Röhrchen abwarten und Plasma     getrennt → erneute Zentrifugation >2‘200g
   vorsichtig ohne Zellen abhebern
QuantiFERON®-Gold In Tube Interpretation – negative Mitogen Kontrolle
T-Zellen durch Mitogen (Phythämagglutinin) nicht stimulierbar → IFN--y <0.5 IE/ml

 Kollektiv mit unterschiedlichem Immunstatus           nicht stimulierbar (%)

 gesunde, immunkompetente Personen                     0.3

 Patienten mit Autoimmun-Erkrankungen (anti-TNF-a)     5.6

 Dialyse Patienten                                     6.8

 Präanalytik nicht beachtet                            → mangelnde Bildung IFN-y
                                                       durch …

 heftiges Schütteln der Röhrchen (5 sec) bis           … geronnenes Blut
 Schaumbildung                                         … ungelöste Antigene

 Temperatur 17 - 27°C für Lagerung-/Transport          … Verfall der T-Zellen
 Zeitintervall Blutentnahme bis Inkubation

 Inkubation Röhrchen für 16 - 24 Stunden bei 37°C.     … zu kurze Erwärmung

 Vorrats-Lagerung unbenutzter Röhrchen 4-27°C für 15   … Verfall TB Antigene / Mitogen
 Monate
Analytische Leistungsfähigkeit von IGRA’s
Problem
   Beurteilung Leistung der IGRA’s im Vergleich mit TST, ohne
    Gold Standard für die Latente TB Infektion ?

   TST ist kein Gold Standard, da weder 100% sensitiv noch
    100% spezifisch

   Ohne Gold Standard ist die direkte Ermittlung von Sensitivität
    und Spezifität der IGRA’s und des TST unmöglich

Hypothese
   Luftübertragung von TB wahrscheinlicher mit längerer Dauer
    sowie Enge des Kontaktes zu TB Patienten
    → Exposition korreliert mit IGRA Ergebnis
Analytische Leistungsfähigkeit von IGRA’s




Sensitivität in Probanden ohne TB, nach Ausmass Exposition

   TST = QFN Gold in tube = T-SPOT.TB
Analytische Leistungsfähigkeit von IGRA’s




Sensitivität in Probanden mit aktiver TB
 TST < QFN Gold in tube < T-SPOT.TB
Analytische Leistungsfähigkeit von IGRA’s




Spezifität bei sehr geringem Risiko einer TB Infektion

   TST <    QFN Gold in tube    =   T-SPOT.TB
Analytische Leistungsfähigkeit von IGRA’s




Prädiktiver Wert
    Risiko für Entwicklung aktiver TB bei Patienten mit
     IGRA Ergebnissen
     → unbekannt
     → langfristige Kohortenstudien notwendig

								
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