03 Agarose gel electrophoresis by CH1sAC6

VIEWS: 5,758 PAGES: 10

									                                      ปฏิบัติการที่ 3
      การแยก DNA โดยวิธี Agarose Gel Electrophoresis
วัตถุประสงค์
        เพื่อทราบหลักการ และวิธีการในการแยก DNA ด้วยวิธี Agarose gel electrophoresis

บทนา
1. โครงสร้างและหน้าที่ของ DNA
                                                                     ่
          Deoxyribonucleic หรือ DNA เป็นสารพันธุกรรมทาหน้าทีควบคุมและถ่ายทอดลักษณะต่างๆ
ของสิ่งมีชีวิต         โดย       DNA        จะประกอบด้วยหน่วยย่อยพื้นฐานที่เรียกว่า       nucleotide
ที่ประกอบด้วยโมเลกุลฟอสเฟต น้าตาลเพนโตส และ Nitrogenous base 1 ตัว ซึ่ง base จะมีอยู่ 4
ชนิดคือ adenine (A), guanine (G), cytosine (C) และ thymine (T) ลักษณะโครงสร้างของ DNA
ประกอบขึ้นจากสายชุด nucleotide 2 สายที่มาพันเข้าด้วยกันเป็นลักษณะเกลียวคู่หรือบันไดเวียน โดยมี
                                                              ึ
base ที่เรียงรายอยู่ตามสายแต่ละสาย แต่ละสายทาหน้าที่ยดจับระหว่างสายทั้งสองด้วยพันธะไฮโดรเจน
และปรากฏว่าสายส่วนที่มี A จะจับคู่สร้างพันธะกับ T และส่วนที่มี G จะจับคู่ C
ซึ่งการจับคู่กันนี้เรียกว่าเป็นเบสคู่สม (complementary base pair) (รูปที่ 1) และแต่ละส่วนบนสาย
                                                                ้
DNA นี้เองที่เป็นที่อยู่ของ “ยีน” (gene) ซึ่งเป็นส่วนที่บรรจุขอมูลสาหรับการสร้างโปรตีนชนิดใดชนิดหนึ่ง
โดยยีนที่ต่างกันก็จะมีตาแหน่งที่อยู่และการเรียงลาดับของ base บนตัวมันแตกต่างกันไป




รูปที่ 1 องค์ประกอบและโครงสร้างของ DNA การจับคู่กันของเบสคู่สมของสาย DNA
สองสายทาให้มีลักษณะเกลียวคู่กลับทิศทาง (ภาพจาก www.barascientific.com,
whyfiles.org/034clone/dna.html )
3/2 การแยก DNA โดยวิธี Agarose gel electrophoresis



2. หลักการของ Electrophoresis
                                                                ี
           Electrophoresis เป็นเทคนิคที่ใช้แยกโมเลกุลของสารที่มประจุออกจากกันโดยใช้กระแสไฟฟ้า
โดยให้สารที่มีประจุนั้นเคลื่อนที่ผ่านตัวกลางชนิดหนึ่งในสารละลาย
                              ่
สารที่ประจุต่างกันจะเคลื่อนทีไปในทิศทางตรงกันข้าม
นอกจากประจุแล้วอัตราการเคลื่อนที่ยังขึ้นอยู่กับขนาด                                  รูปร่างโมเลกุล
                                ่
แรงเคลื่อนไฟฟ้าและตัวกลางทีใช้ด้วย โมเลกุลของ DNA ประกอบด้วยหมู่ฟอสเฟตจานวนมาก
สารละลายของ DNA จึงมีประจุเป็นลบที่ pH เป็นกลาง เมื่ออยู่ในสนามไฟฟ้าโมเลกุลของ DNA
จะเคลื่อนที่จากขั้วลบไปยังขั้วบวก เนื่องจากหมู่ฟอสเฟตเป็นส่วนประกอบของ nucleotide ทุกชนิด DNA
ที่มีขนาดโมเลกุลเล็กจะมีหมู่ฟอสเฟตอยู่น้อยกว่าโมเลกุลขนาดใหญ่
ดังนั้นจะพบว่าประจุต่อมวลโมเลกุลของ DNA ทุกขนาดมีค่าเท่ากัน ความเร็วในการเคลื่อนที่ของโมเลกุล
DNA จึงขึ้นอยู่กับขนาดเป็นส่วนใหญ่ อย่างไรก็ตามมีปัจจัยอื่นที่มีผลต่อการเคลื่อนที่ของโมเลกุล DNA
ด้วยดังนี้

           1. ขนาดของโมเลกุล DNA ที่มีขนาดโมเลกุลเล็กจะเคลื่อนทีได้เร็วกว่า DNA     ่
ที่มีขนาดโมเลกุลใหญ่               ดีเอ็นเอที่มีโมเลกุลแบบเส้นตรง              (linear          DNA)
เกลียวคู่จะเคลื่อนที่ได้ระยะทางที่แปรผกผันกับขนาดโมเลกุล                ถ้านาระยะทางที่โมเลกุลเคลื่อนที่
(mobility) มาเขียนกราฟคู่กับค่า log ของโมเลกุล (molecular weight) จะได้กราฟแสดงความสัมพันธ์
ซึ่งมีความสัมพันธ์ลักษณะเส้นตรงอยู่ช่วงหนึ่ง          ดังนั้นถ้าต้องการทราบขนาดโมเลกุลของ        DNA
สามารถทาได้ โดยทา Electrophoresis เปรียบเทียบกับ DNA มาตรฐานที่ทราบขนาดแล้ว
นามาเขียนกราฟระหว่าระยะทางที่เคลื่อนที่ และ log ของน้าหนักโมเลกุลเพื่อใช้เป็นกราฟมาตรฐาน
ทั้งนี้จะต้องเปรียบเทียบในการทา Electrophoresis ครั้งเดียวกันเท่านั้น เนื่องจากเป็นค่าแบบสัมพัทธ์
(relative)




                           DNA     DNA
                         มาตรฐาน ตัวอย่าง



         2. รูปแบบของดีเอ็นเอ (configuration) กรณีที่มีขนาดโมเลกุลเท่ากันนั้น supercoiled DNA
จะเคลื่อนที่ได้เร็วกว่า linear DNA และ Nicked circles DNA ตามลาดับ
                                                                         (-)
                                                       การแยก DNA โดยวิธี Agarose gel electrophoresis 3/3




                                                                             (+)
                       (ดัดแปลงภาพจาก www.vivo.colostate.edu/.../gels/agardna.html)
          3. ความเข้มข้นของ gel ถ้าเพิ่มความเข้มข้นของ gel จะทาให้โมเลกุลของ DNA
จะเคลื่อนที่ได้ช้าลง gel ที่นิยมใช้กับกรดนิวคลีอิก คือ agarose gel และ polyacrylamide gel ส่วน gel
ที่นิยมใช้กับโปรตีนคือ polyacrylamide gel




                             1000 bp




รูปที่ 2 แสดงโมเลกุล DNA ที่มีขนาดใหญ่จะถูกแยกได้ดีกว่าใน gel ที่มีความเข้มข้นต่า (0.7%) ในขณะ
        ที่ DNA ขนาดเล็กจะแยกได้ดีใน gel ที่มีความเข้มข้นสูง (1.5%)
                 (ดัดแปลงภาพจาก www.vivo.colostate.edu/.../gels/agardna.html)

ตารางที่ 1 แสดงความสัมพันธ์ ระหว่างความเข้มข้นของ agarose กับขนาดของ Linear DNA ที่เหมาะสม

            ความเข้มข้นของ agarose gel (%)                   ขนาดของ Linear DNA (bp)
                         0.3                                     60,000 – 5,000
                         0.7                                      10,000 - 800
                         1.2                                       6,000 - 400
                         1.5                                      3,000 – 200
                         2.0                                       2,000 - 100
         ที่มา: Gel Electrophoresis and Photography An Application Note UVP-AB-1000-02


       Agarose gel ประกอบด้วย D-galactose และ 3,6-anhydro L-galactose เมื่อต้มจะทาให้ได้
                                                               ้
agarose gel ที่มีรูพรุนซึ่ง DNA สามารถผ่านได้ ขนาดของรูพรุนจะขึนอยู่กับความเข้มข้นของ agarose
3/4 การแยก DNA โดยวิธี Agarose gel electrophoresis


gel โดยถ้าความเข้มข้น             agarose        สูงรูพรุนจะมีขนาดเล็กลง   จะสามารถแยก       DNA
ที่มีขนาดโมเลกุลเล็กได้ดี




                  รูปที่ 3 องค์ประกอบของ agarose และ โครงสร้างของ agarose gel
                 (ภาพจาก www.fao.org/docrep/field/009/ag156e/AG156E01.htm)

         4. แรงเคลื่อนไฟฟ้า (Voltage) ถ้าเพิ่มแรงเคลื่อนไฟฟ้า DNA จะเคลื่อนที่ได้เร็วกว่า
ในการแยกขนาด DNA โดยวิธี Electrophoresis นี้ ต้องใช้แรงเคลื่อนไฟฟ้าที่เหมาะสม
ถ้าใช้แรงเคลื่อนไฟฟ้าสูงเกินไป DNA เคลื่อนที่ได้เร็ว แต่การแยกตัวจะไม่ดี แต่ถ้าต่า DNA
จะเคลื่อนที่ช้าการแยกตัวได้ดีแต่แถบ DNA จะไม่ชัดเพราะเกิดการแพร่ (diffusion) โดยทั่วไป DNA
ที่มีขนาดประมาณ         2      kb     จะใช้แรงเคลื่อนไฟฟ้าประมาณ    5      volts/cm     (cm
เป็นระยะทางระหว่างขั้วทั้งสอง ไม่ใช่ขนาดของ gel)

                                                                 ่
          5. Buffer (บัฟเฟอร์) ชนิดของพัปเฟอร์มีผลต่อการเคลื่อนทีของ DNA บัฟเฟอร์ที่นิยมใช้ ได้แก่
TAE (Tris-acetate) และ TBE (Tris- borate) บัฟเฟอร์แต่ละชนิดจะให้ความแรงของประจุ (ionic
strength) ที่ต่างกันทาให้แยก DNA ได้แตกต่างกัน ดังนั้นการเลือกใช้บัฟเฟอร์แต่ละชนิดในการการแยก
DNA จึงขึ้นอยู่กับวัตถุประสงค์ในการใช้งาน โดยที่บัฟเฟอร์ TAE จะใช้แยก supercoiled DNA
ได้ดีกว่าบัฟเฟอร์ TBE และ double stranded linear DNA จะเคลื่อนที่ในบัฟเฟอร์ TAE ได้เร็วกว่า TBE
แต่ข้อเสียของบัฟเฟอร์ TAE คือมี buffer capacity และ ความแรงของประจุ น้อยกว่า TBE
ในขณะที่การแยก DNA ขนาดเล็กนิยมใช้บัฟเฟอร์ TBE มากกว่า TAE

3. Agarose gel electrophoresis
        Agarose gel electrophoresis เป็นเทคนิคที่ง่ายและเป็นที่นิยมที่สุดในการแยกและวิเคราะห์
DNA โดยมีวัตถุประสงค์สาคัญเพื่อวัดปริมาณ หรือแยกแถบ DNA (DNA band) ที่ต้องการ
ขั้นตอนการทา Agarose gel electrophoresis โดยหลังจากเตรียมแผ่น gel แล้วจะทาการหยด (load)
ตัวอย่างลงไปในช่อง (wells) ที่เตรียมไว้ (ดังแสดงในรูปที่ 4) ขณะเตรียมแผ่น gel ตัวอย่าง DNA
                                                               การแยก DNA โดยวิธี Agarose gel electrophoresis 3/5


จะผสมกับ Loading dye ซึ่งประกอบด้วยสี (ได้แก่ bromophenol blue หรือ xylene cyanol)
          ่
และสารทีทาให้มีความหนักหรือความหนาแน่นสูงเช่น glycerol หรือ sucrose ก่อนใส่ในช่องของแผ่น
gel         เพื่อป้องกันไม่ให้   DNA       ตัวอย่างกระจายออกไปจากช่องใส่ตัวอย่างใน        gel
เนื่องจากการแยกจะทาโดยวางแผ่น gel ไว้ใต้บัฟเฟอร์ ส่วนสีที่ใส่ลงไปจะใช้เป็นตัวติดตามว่าตัวอย่าง
DNA เคลื่อนที่ไปถึงบริเวณใดของแผ่น gel แล้ว หรือดู dye front เพื่อป้องกันไม่ให้ DNA
ตัวอย่างเคลื่อนที่ไปจนสุดแผ่นของ gel สีที่ใช้จะมีขนาดเทียบเท่ากับ DNA ประมาณ 500 bp
หลังจากใส่ตัวอย่างเสร็จก็จะให้กระแสไฟฟ้า
                               ้
โดยแรงเคลื่อนไฟฟ้าที่ใช้จะขึนกับระยะทางระหว่างขั้วทั้งสอง


                                 Slot for comb                                                                     Comb
                                                 Tape
                                 Casting tray
                                                                             Agarose solution
                                  Glass slide                                Tape
                                 Support deck                                            Wells

   1. Casting tray for making gel slab           2. Agarose solution poured into casting tray
                                                                                                        3. Comb that forms
                                                                                                        wells for samples



                                  Micropipette



                                                                                                 5. Electrophoresis chamber
                                                                                                 and power supply
                                                                                           Lid
                                                 Buffer

     4. Wells that can be loaded with samples               Electrophoresis chamber

รูปที่ 4 แสดงการเตรียม agarose gel และขั้นตอนในการแยก DNA โดยเทคนิค Agarose gel electrophoresis
                     (ภาพจาก a32.lehman.cuny.edu/molbio_course/agarose1.htm)
3/6 การแยก DNA โดยวิธี Agarose gel electrophoresis



                                        Well




   รูปที่ 5 แสดงการ load สารละลาย DNA ตัวอย่าง และการเคลื่อนที่ของสี และ DNA ขนาดต่างๆ กัน
                    (ภาพจาก biotrek.rdrake.org/gallery_assorted_group_pic...)
           แถบ DNA ที่แยกได้ด้วย Agarose gel electrophoresis จะถูกย้อมด้วย ethidium bromide
โดยการเข้าแทรก         (intercalate)    ระหว่างคู่เบส      ทาให้แถบ        DNA   ภายใน     gel
เรืองแสงได้เมื่อส่องภายใต้แสง UV จึงสามารถวัดปริมาณความเข้ม หรือแยกแถบ DNA ที่ต้องการได้
การย้อมด้วย ethidium bromide ทาได้ 2 วิธีโดยอาจเติมลงใน gel ก่อนเตรียม หรืออาจแยก DNA
จนเสร็จแล้ว จึงนาแผ่น gel มาแช่ในสารละลาย ethidium bromide
           สาร       ethidium        bromide          จัดเป็นสารก่อให้เกิดมะเร็ง  (carcinogen)
จึงต้องใช้และกาจัดอย่างระมัดระวัง                  นอกจากนี้                 แสง           UV
เป็นอันตรายต่อสายตาควรสวมแว่นตาป้องกันแสง UV ขณะปฏิบัติงาน


           (A)
                                                                                     (B)




รูปที่ 6 (A) โครงสร้างของ ethidium bromide และ (B) การแทรก (intercalate) ของ ethidium bromide
          ระหว่างคู่เบสในสาย DNA (ภาพจาก www.madsci.org/.../1999-02/919869466.Mb.r.html)

การลดความเป็นพิษของสารละลาย ethidium bromide ก่อนทิ้ง:
   1. เติมน้า 1 เท่าตัวของสารละลาย ethidium bromide ในขณะนั้น
   2. เติม 0.5 M KMn04 (ด่างทับทิม) 1 เท่าตัวของสารละลาย ethidium bromide
   ที่เติมน้าแล้วผสมให้เข้ากันระวังอย่าให้สารละลายหกออกมา
                                                    การแยก DNA โดยวิธี Agarose gel electrophoresis 3/7


                                                                                              ้
    3. เติม 2.5 M HCI 1 เท่าตัวของปริมาตรทั้งหมดที่มีอยู่ ผสมให้เข้ากัน และทิ้งไว้ที่อุณหภูมิหอง 1 วัน
                                                             ้
    4. เติม 2.5 M NaOH อีก 1 เท่าตัว ผสมให้เข้ากันแล้วจึงเททิง

4. การทดลอง
อุปกรณ์และสารเคมี
     1. Gel electrophoresis set
     2. 1x TAE buffer
     3. Loading dye
     4. Agarose gel
     5. Autopipette ขนาด 100-200 l พร้อม tips
     6. Ethidium bromide (10 mg/ml)
วิธีการ
        1. เตรียม 1% agarose gel โดยละลายผง agarose 0.5 g ใน 1 x TAE buffer ปริมาตร 50 ml
        2. นาไปต้มจน agarose gel ละลาย
        3. รอให้ gel เย็นลงประมาณ 55 oC
        4. วาง comb ลงไป เพื่อทาให้เกิดช่อง (wells) สาหรับเติม DNA ตัวอย่าง
        5. รอจน gel แข็งตัว (ประมาณ 30 นาที) ดึง comb ออก
        6. วาง tray ลงใน chamber ที่มี TAE buffer อยู่เต็ม (ให้ระดับของบัฟเฟอร์ท่วม gel สูงประมาณ
           2-5 มิลลิเมตร)
        7. load DNA ตัวอย่าง และ DNA มาตรฐานที่ผสมกับ loading dye เรียบร้อยแล้ว
           ปริมาตรละประมาณ 5 l ลงใน well แรก และเว้นอย่างน้อย 1 well เพื่อ load DNA ตัวอย่าง
           (ตัวอย่างการ load แสดงดังรูปข้างล่าง)

          Well ที่ 1 สาหรับ                                                         Well ที่ 3-8 สาหรับ
          load DNA มาตรฐาน                                                          load DNA ตัวอย่าง




      8. ปิดฝา chamber แล้วต่อสายไฟ โดยให้ด้านของตัวอย่างอยู่ด้านขั้วลบ (สีดา) เนื่องจาก
                         ่
         DNA จะเคลื่อนทีไปยังขั้วบวก (สีแดง) (ดังรูปข้างล่าง) ตั้งค่าแรงเคลื่อนไฟฟ้า (voltage, V) ที่
         100 V และตั้งเวลาประมาณ 50 นาที
3/8 การแยก DNA โดยวิธี Agarose gel electrophoresis




           9. เมื่อ dye front เคลื่อนไปประมาณสามในสี่ส่วนของแผ่น gel แล้วให้ถอดสายไฟออก
           10. นาแผ่น gel ออกจาก gel tray แล้วนามาแช่ในสารละลาย ethidium bromide (0.5 g/ml)
               ประมาณ 15-30 นาที (หากต้องการล้างสารละลายส่วนเกินออก (destaining)
               ทาได้โดยการจุ่มลงในน้ากลั่น) จากนั้นนาแผ่น gel ไปวางบนกล่องที่มีแสง UV จะเห็นแถบ
               DNA เรืองแสงUV บันทึกภาพผลการทดลองทีได้  ่
           ( ข้ อ ค ว ร ร ะ วั ง                          ethidium                  bromide                    เ ป็ น ส า ร ก่ อ ม ะ เ ร็ ง
           ค ว ร ใ ส่ ถุ ง มื อ ทุ ก ค รั้ ง เ มื่ อ ใ ช้ ส า ร ล ะ ล า ย ห รื อ ต้ อ ง สั ม ผั ส กั บ อุ ป ก ร ณ์ ที่ มี ก า ร ป น เ ปื้ อ น
           ถ้าสัมผัสโดยตรงกับผิวหนังให้ล้างด้วยน้าสะอาดทันทีประมาณ 15 นาที หรือเมื่อมีการหกให้ใช้วิธีการซับ
           ห้ามทาการถู เนื่องจากจะทาให้กระจาย และเกิดเป็นผงได้)

                                                                                                 รายงานปฏิบัติการที่ 3
                    การแยก DNA โดยวิธี Agarose gel electrophoresis
ผลการทดลอง
จงวาดแถบ       DNA      ที่นิสิตแยกได้ลงในรูปที่กาหนดให้ข้างล่างนี้                                                     โดยกาหนด                   จุดเริ่มต้น
และขั้วไฟฟ้าในการทา Agarose gel electrophoresis




สรุปและวิจารณ์ผลการทดลอง

..................................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................................
                                                                                    การแยก DNA โดยวิธี Agarose gel electrophoresis 3/9


..................................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................................




คาถาม

1. จงบอกสมบัติและหน้าที่ของ Loading dye
..................................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................................

2. จงอธิบายความสาคัญของความเข้มข้นของ gel สาหรับการทา Gel electrophoresis
..................................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................................

3. จงบอกความสาคัญของ DNA มาตรฐาน
..................................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................................

อุปกรณ์ที่เบิกกับนักวิทยาศาสตร์
       DNA ตัวอย่าง, DNA มาตรฐาน, ถุงมือ
การเตรียมสารเคมี
3/10 การแยก DNA โดยวิธี Agarose gel electrophoresis


1. 10x TAE buffer, pH 8.18 - 8.29
      Tris-base (40 mM)                                  48.4 g
      Glacial acetic acid (20 mM)                        10.9 g
      Ethylene Diamine Tetra Acetic acid (EDTA) (2 mM)   2.92 g
      Distilled water up to 1 L
2. Loading dye
      0.25% bromophenol blue                             25 mg
      40% (w/v) sucrose or glycerol                      4g
      Distilled water                                    10 ml
3. 1% Agarose gel
      Agarose gel powder                                 0.5 g
      1x TAE buffer                                      50 ml

								
To top