LCAAmb CA 2 principali tecniche analitiche by g5o6047Y

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									   Panorama sulle principali
     tecniche analitiche




Laboratorio di Chimica Analitica Ambientale – a.a. 2004-2005
 Valutazione di una tecnica analitica
• Accuratezza  capacità di determinare il valore vero
• Precisione  capacità di replicare le misure
• Sensibilità  capacità di
  distinguere due concentrazioni
  differenti ma molto vicine




                                      Segnale
• Limite    di    rivelabilità  
  concentrazione      minima    di
  analita che può essere rivelata
• Range dinamico lineare  range
  di concentrazioni in cui la                    Concentrazione
  risposta analitica è lineare
• Selettività  capacità di distinguere tra due analiti
• Effetti matrice  effetti di altre componenti del campione
  sulla risposta analitica
            Tecniche analitiche

• Tecniche cromatografiche
• Tecniche spettroscopiche
• Tecniche elettrochimiche
• Tecniche volumetriche
• Saggi qualitativi
       Tecniche cromatografiche
• In base alla forma del letto cromatografico
   • Cromatografia su colonna (impaccata, open-tubular)
   • Cromatografia planare (su carta, su strato sottile)
• In base allo stato fisico della fase mobile
   • Cromatografia Liquida (LC)
   • Gascromatografia (GC)
   • Cromatografia fluida supercritica (SFC)
• In base al meccanismo di separazione
   • Adsorbimento
   • Ripartizione
   • Scambio ionico
   • Esclusione
   • Affinità
           Schema delle tecniche
Dalla combinazione dei meccanismi e dei supporti citati, si possono avere
numerose varianti di tecniche cromatografiche


                          CROMATOGRAFIA


          GAS         SFC                 LIQUIDA


    GSC         GLC        Colonna                       Planare


              NP        RP        IEC       SEC       TLC       Carta


                                        GPC     GFC
        Tecniche cromatografiche
• analiti volatili o volatilizzabili, termicamente stabili, non ionici
                                       
                              Gascromatografia


• analiti non volatili o poco volatili, ionici, ionizzabili o non ionici,
  termicamente instabili
                                       
                            Cromatografia liquida


• analiti non volatili o termicamente instabili ma non rivelabili dai comuni
  detector per LC
                                       
                     Cromatografia fluida supercritica
                Gascromatografia
• Gas-liquido
   • supporto inerte solido
   • liquido non volatile, legato covalentemente
   • meccanismo di ripartizione
   • moltissime applicazioni


• Gas-solido
   • fasi stazionarie di silice, allumina o carbone
   • meccanismo di adsorbimento
   • adatta per la separazione di gas permanenti (H2, He, Ar, O2,
     N2, CO) o idrocarburi a basso punto di ebollizione
Schema di un GC
   Colonne per gascromatografia
• Colonne impaccate
   • contengono un supporto solido inerte, finemente suddiviso
     (comumente basato su terra di diatomee), ricoperto di fase
     stazionaria liquida


• Colonne capillari
   • WCOT (Wall Coated Open Tubular), strato sottile di fase liquida (1
     µm) depositato sulla superficie
   • SCOT (Support Coated Open Tubular), strato poroso creato sulle
     pareti della colonna per trattamento o deposizione chimica
   • PLOT (Porous Layer Open Tubular), strato poroso polimerico o
     inorganico che funge da fase stazionaria per una cromatografia di
     adsorbimento
Confronto tra colonne impaccate e capillari

                        Le colonne capillari possono
                        essere lunghe fino a 100 m
                        e hanno quindi un numero di
                        piatti teorici enormemente
                        più elevato rispetto alle
                        colonne impaccate. Questa
                        differenza è esemplificata
                        nella figura a lato (in alto
                        separazione con colonna
                        capillare, in basso la stessa
                        separazione con colonna
                        impaccata)
                    Rivelatori per GC
• a conducibilità termica (TCD)
                                         Uno dei punti di forza della tecnica
• a ionizzazione di fiamma (FID)         GC è la grande varietà dei rivelatori
• a cattura di elettroni (ECD)           disponibili. Alcuni sono aspecifici e
                                         quindi di uso generale (TCD, FID),
• a conducibilità elettrolitica (ELCD)   altri sono invece molto specifici
• amperometrico per lo zolfo (ASD)       (AED, ASD). Quelli universalmente
                                         accettati sono TCD ed FID, ma è
• termoionico (TID o NPD)                sempre più diffuso l’impiego del
• fotometrico a fiamma (FPD)             rivelatore a spettrometria di massa

• a fotoionizzazione (PID)               Un aspetto da considerare nella
                                         scelta del rivelatore è verificare se è
• ad emissione atomica (AED)             distruttivo o no: nel secondo caso può
• a chemiluminescenza                    essere interessante mettere in serie
                                         più rivelatori (es. TCD e MS)
• spettrometria di massa (MS)
  Rivelatore a conducibilità termica

• si misura la variazione di
  conducibilità termica in
  un flusso di H2 ed He
• si tratta di un rivelatore
  non    specifico,   quindi
  risponde ad ogni tipo di
  composto
• la sensibilità è una delle
  peggiori
                               Campione   Riferimento
•è    un     sistema    non
 distruttivo
 Rivelatore a ionizzazione di fiamma

• si misura la conducibilità elettrica
  di una fiamma in un campo elettrico
• è sensibile a tutti i composti
  contenenti legami C-C e C-H (per
  questo si tratta del rivelatore più
  utilizzato)
• non risponde a molecole volatili non
  infiammabili
• la sensibilità è buona
• è un sistema distruttivo
Rivelatore a cattura di elettroni
• si misura la diminuzione di
  corrente dovuta alla cattura
  di elettroni da parte di analiti
  all’uscita della colonna
• è sensibile soprattutto a
  composti       con       gruppi
  funzionali elettrofili (alogeni,
  perossidi, nitrogruppi, ecc.)
• la sorgente di elettroni è un
  beta-emettitore come 3H o
  63Ni


• la sensibilità è ottima per gli idrocarburi clorurati
• è un sistema non distruttivo
Rivelatore a conducibilità elettrolitica

• si misura la conducibilità
  elettrolitica modificata
  da composti derivati
  dagli      analiti    per
  combustione
• è un rivelatore alogeno-
  specifico       (pesticidi
  clorurati,        solventi
  alogenati, PCB, diossine)
  ma può rivelare anche
  composti di N ed S

• la sensibilità è eccellente per i composti clorurati, ottima per i
  composti di N ed S
• è un sistema distruttivo
  Rivelatore amperometrico per S




• le sostanze separate sono combuste in atmosfera riducente
  formando H2S che viene rivelato in una cella elettrochimica per
  ossidazione in-situ
• specifico per composti di S
• è un sistema distruttivo
          Rivelatore termoionico


• è specifico per composti
  contenenti azoto e fosforo
  (per questo è chiamato anche
  NPD)
• basato sulla formazione di
  radicali a partire da composti
  di N e P
• è un sistema distruttivo
Rivelatore fotometrico a fiamma
• è specifico per composti contenenti zolfo e fosforo
• si misura l’emissione ottica a 394 nm per S e 526 nm per P
• è un sistema distruttivo
 Rivelatore a fotoionizzazione di fiamma
• si impiega luce UV per ionizzare gli analiti che escono dalla
  colonna; gli ioni così prodotti generano una corrente misurata
• selettivo per idrocarburi aromatici e composti contenenti
  eteroatomi (come organozolfo od organofosforo)
                                           •è    un      sistema
                                            praticamente non
                                            distruttivo,       in
                                            quanto la frazione
                                            di analita ionizzato
                                            è bassa
  Rivelatore a emissione atomica
• rivelatore specifico per elementi, vantaggioso per l’analisi di
  miscele complesse
• basato sull’emissione ottica di atomi formatisi in un plasma di
  elio a microonde
• è un sistema distruttivo
 Rivelatore a chemiluminescenza
• analogo come principio all’AED, ma la chemiluminescenza è
  emessa da molecole eccitate piuttosto che da atomi
• le bande di luce emessa sono più ampie e più difficili da
  interpretare
• la radiazione di fondo è bassissima, analogamente alla
  fluorescenza (l’eccitazione è prodotta per via chimica, non
  spettroscopica)
• limitato a composti che
  possono     dare    reazioni
  chemiluminescenti (composti
  di N ed S soprattutto)
• è un sistema distruttivo
  (l’analita reagisce con un
  composto)
Rivelatore a spettrometria di massa

• accoppiamento ormai più che consolidato e di straordinaria
  potenza
• è l’unico rivelatore che fornisce informazioni strutturali
• è un sistema distruttivo
           Scelta del rivelatore


La selezione è basata su:
• natura chimica degli analiti
• potenziali interferenze
• limite di rivelabilità richiesto
• disponibilità e/o costo
         Confronto tra rivelatori
Rivelatore          Target                LOD         Range lineare
  TCD            non selettivo            1 ng            106
   FID            idrocarburi            100 pg           107
  ECD               alogeni             50 fg Cl          104
  ELCD        composti di N, S, Cl        1 pg          104 - 106
  ASD            composti di S          10 ppb S          104
  NPD          composti di N, P           10 pg           104
   FPD         composti di S, P          100 pg           103
             idrocarburi aromatici,
   PID                                2 pg benzene        107
                 eterocomposti
  AED              elementi           0.1 – 20 pg/s       104
  Chem         composti di N, S           10 pg           104
                                      10 ng (SCAN),
   MS               specie                                105
                                       10 pg (SIM)
     Cromatografia liquida

            CROMATOGRAFIA LIQUIDA


        Colonna                   Planare


NP     RP     IEC     SEC       TLC    Carta


                    GPC   GFC
Schema di un HPLC
Selezione della tecnica HPLC
Selezione della tecnica IC
Eluizione isocratica o in gradiente




isocratica     isocratica    gradiente
(più forte)   (meno forte)
            Rivelatori per HPLC
• Bulk properties: si misura una caratteristica della fase
  mobile che indirettamente rivela gli analiti
• Solute properties: si misura una caratteristica del soluto


• Spettrofotometrico UV-visibile (UV-Vis)
• UV-visibile con Diode-array (UV-DAD)
• Spettrofotometrico IR
• Fluorimetrico
• Indice di rifrazione (RID)
• Elettrochimico (ED)
• Spettrometria di massa (MS)
 Rivelatore spettrofotometrico UV-visibile

• il rivelatore più diffuso
  (copre più del 70% dei
  metodi di rivelazione)
• basato sull’assorbimento
  di luce nel range UV-
  visibile
• sensibile a moltissime
  sostanze organiche ed
  inorganiche (es. 254 nm)
• sensibilità tipica: 0.1 ppb
•è    un    sistema       non
 distruttivo
             Gruppi cromofori
Cromoforo     Formula   lmax (nm)        e
 aldeide       -CHO       210          1.500
  amino        -NH2       195         2.800
   azo        -N=N-     285-400        3-25
bromuro         -Br       208          300
carbossile    -COOH     200-210       50-70
 chetone       -C=O       195          1.000
disolfuro      -S-S-      194         5.500
 estere       -COOR       205           50
  etere        -O-        185          1.000
 etilene       -C=C-      190         6.000
  fenile       -C6H5    202, 255
 naftile                220, 275
 nitrato      -ONO2       270           12
 nitrito      -ONO      220-230     1.000-2.000
 nitrile       -C=N       160            -
  nitro        -NO2       210          forte
   Scelta della lunghezza d’onda

La l del rivelatore va scelta in base ad alcune considerazioni:
• massimizzare sensibilità e specificità
• il solvente della fase mobile può causare shifts in lmax (2-5 nm)
   • controllare l’assorbanza degli analiti nella fase mobile
• i solventi per fase mobile hanno cutoff nell’UV

• operando sotto la lcutoff può:
   • ridurre la sensibilità
   • introdurre rumore sulla linea di base
         Rivelatore Diode-array
• misura in ogni istante lo spettro        UV-visibile
  dell’eluato nell’intervallo desiderato
                          • può fornire informazioni
                            strutturali sugli analiti
                            (database di spettri)
Rivelatore spettrofotometrico IR



• sensibilità tipica: 1 ppm
• applicabilità limitata dall’assorbanza   della   fase
  mobile nel range spettrale infrarosso
        Rivelatore a fluorescenza
• sensibilità 1000 volte
  superiore        rispetto
  all’assorbimento     UV-
  visibile
• sensibilità   tipica:   0.01
  ppb
• limitato alla rivelazione
  di composti fluorescenti,
  ma     è   possibile    la
  derivatizzazione
•è    un    sistema    non
 distruttivo (tranne che
 con derivatizzazione)
 Rivelatore a indice di rifrazione


                                      • basato      sulla misura
                                        del’indice di rifrazione
                                        dell’eluato       (tipico
                                        rivelatore bulk)
                                      • non adatto con eluizione in
• sensibilità tipica: 0. 1 ppm          gradiente
• completamente aspecifico
• necessita di termostatazione accuratissima
• si usa per composti non attivi nel range UV-visibile (zuccheri)
• è un sistema non distruttivo
  Rivelatore evaporative light scattering


• l’eluato è trasformato in
  aerosol, desolvatato e mandato
  in una cella nella quale si misura
  lo scattering della luce
• necessita di fasi mobili volatili
• ideale per composti ad alto PM,
  zuccheri e acidi non volatili
• è un sistema distruttivo
        Rivelatore elettrochimico

• tra i più sensibili (sensibilità tipica: 1 ppt, femtomoli in modalità
  amperometrica)
• possibilità di misura in
   • voltammetria (per applicazioni particolari)
   • amperometria
   • coulometria (raro)
   • conducimetria (utilizzato in cromatografia ionica)
• generalmente poco adatto all’eluizione in gradiente
Rivelatore elettrochimico: amperometria

• basata sulla misura della corrente risultante da un’elettrolisi
  (ossidazione o riduzione) di molecole di analita alla superficie di
  un elettrodo
• il più sensibile tra i rivelatori per LC (fino a femtomoli per
  alcune applicazioni  dopamina)
• utilizzabile per tutte le sostanze elettroattive nel range di
  potenziale dell’elettrodo
  di lavoro impiegato
• possibile avvelenamento
  degli elettrodi
• utilizzo non semplice
• è un sistema parzialmente
  distruttivo
  Rivelatore elettrochimico: conducimetria


• basato sulla misura della corrente elettrica trasportata da ioni
  disciolti in un campo elettrico
• utile per sostanze ioniche o ionizzabili
• rivelatore più comune in cromatografia ionica
• sensibilità   inferiore
  rispetto al rivelatore
  amperometrico
• utilizzo molto semplice
•è    un    sistema     non
 distruttivo
Rivelatore a spettrometria di massa

                                                  • il detector finale:
                                                    sensibile, selettivo e
                                                    universale,        può
                                                    permettere          la
                                                    caratterizzazione
                                                    chimica del campione
                                                  • possibilità       di
                                                    discriminare analiti
                                                    coeluiti in modalità
                                                    SIM
• sensibilità tipica: 0.1 ppb
• limitato dall’interfaccia e dalla necessità di rimuovere il solvente dal
  campione
• gli analiti devono essere ionizzabili
           Confronto tra rivelatori
 Rivelatore              Target             LOD       Range lineare
 UV-visibile/    composti che assorbono
                                            1 µg/l        104
  UV-DAD             luce UV-VIS
     IR
                 composti policondensati
Fluorimetrico                              10 ng/l        103
                         (PAH)
     RID              non selettivo         1 mg/l        104
    ELSD                                    1 mg/l
     ED
                 composti elettroattivi    100 pg/l
amperometrico
     ED
                     composti ionici        1 µg/l        103
conducimetrico
     MS                  specie            0.1 µg/l       105
Cromatografia Fluida Supercritica
• si utilizza come fase mobile un fluido supercritico (cioè portato al di
  sopra della temperatura critica, Tc, sopra la quale una sostanza non
  può più essere trasformata in un liquido), avente caratteristiche
  fisiche intermedie tra i liquidi e i gas:
   • maggiore densità rispetto ai gas
   • minore viscosità rispetto ai liquidi
   • alto potere solubilizzante
• Fluidi supercritici impiegati in
  cromatografia:
   • CO2, Tc = 31°C
   • C2H6, Tc = 32°C
   • N2O, Tc = 37°C
       Caratteristiche della SFC

• è utile in particolare per analizzare composti che non possono
  essere determinati con GC o LC (25% dei problemi analitici):
   • composti non volatili
   • composti termicamente instabili
   • composti non rivelabili con i normali rivelatori per LC
• la strumentazione è simile a quelle per GC o LC; necessita
  controllo accurato della temperatura
• fasi mobili analoghe a quelle per HPLC in ripartizione
• l’eluato si rivela come gas              rivelatori     FID,   MS
  (interfacciamento semplice), TCD, ECD
          Applicazioni della SFC
• separazione di molecole ad alto PM (fino a 105), prodotti
  naturali, alimenti, additivi, pesticidi, polimeri, esplosivi
• CO2 supercritico può solubilizzare alcani C5-C40 e PAH




                                       separazione di polietileni
                                       oligomerici con gradiente
                                       di pressione
     Confronto tra HPLC ed SFC



Separazione di bi- e
trifenile con HPLC (sx)
ed SFC (dx): la velocità
di flusso è maggiore in
SFC      per    cui     la
separazione è più veloce
                       GC, LC o SFC?
• Caratteristiche comuni
   • Efficienti e altamente selettive; non distruttive (in senso analitico); possono
     essere quantitative


• Vantaggi della GC
   • Rapida; risoluzione eccezionale; facilmente interfacciabile con MS


• Vantaggi della LC
   • Determinazione di specie non volatili o termicamente instabili, specie
     ioniche inorganiche
   • La diffusione longitudinale è trascurabile


• Vantaggi della SFC
   • caratteristiche intermedie tra GC ed LC
       Tecniche elettroforetiche
Le tecniche elettroforetiche sono spesso associate alle tecniche
cromatografiche, in quanto permettono la separazione di miscele di ioni
che migrano sotto l’effetto di un campo elettrico con diverse velocità di
migrazione. In realtà non si tratta di metodi cromatografici veri e
propri, in quanto non avviene la ripartizione degli analiti tra fase mobile e
fase stazionaria. Per questo sono chiamate anche tecniche ancillari
rispetto alle cromatografiche. La strumentazione richiesta è comunque
affine e quindi sono valide molte delle nozioni acquisite in campo
cromatografico. La rivelazione delle sostanze avviene mediante
colorazione, per via fotometrica o, nell’elettroforesi capillare, con
rivelatori più sofisticati come il fotometrico, l’elettrochimico e lo
spettrometro di massa
Si tratta di un gruppo di tecniche molto utilizzate in campo biologico,
biochimico e molecolare per la separazione di proteine, polinucleotidi e
altri biopolimeri, e in generale di ioni e anfoliti (sostanze che si
comportano come acidi o basi a seconda del pH, es. aminoacidi e peptidi)
   Classificazione delle tecniche
Le tecniche elettroforetiche si classificano in:
• elettroforesi priva di carrier, in
  cui gli ioni migrano in una soluzione
  tampone
• elettroforesi mediante carrier,
  più comunemente utilizzata, in cui
  gli ioni migrano su un supporto di
  carta, un gel o un polimero


• elettroforesi    classica  (es.
  separazione delle proteine del
  siero)
• elettroforesi capillare
          Elettroforesi capillare

Due grossi svantaggi dell’elettroforesi classica sono:
• convezione di calore dovuta alla resistenza del tampone al
  flusso di corrente elettrica, che porta all’allargamento dei
  picchi
• difficoltà nella valutazione degli elettroferogrammi


Questi svantaggi sono superati grazie all’avvento della tecnica
capillare, derivata da elementi della GC capillare. In questa
tecnica, la migrazione degli ioni avviene in un sistema
miniaturizzato, un capillare appunto, nel quale le correnti sono
inferiori e conseguentemente il calore di Joule è notevolmente
più basso con vantaggi analitici evidenti
Prestazioni dell’elettroforesi capillare
La strumentazione necessaria per l’elettroforesi capillare è costituita da due
soluzioni tampone, il capillare con dispositivo di raffreddamento, un generatore di
energia ad alta tensione, un sistema per l’applicazione del campione e un rivelatore




Si utilizzano rivelatori    UV,   UV-DAD,     fluorimetrici,   elettrochimici   e   a
spettrometria di massa
                   Versioni della CE
L’elettroforesi capillare comprende una famiglia di tecniche che hanno
caratteristiche operative e di separazione alquanto diverse. Le tecniche sono:
• elettroforesi capillare di zona (CZE): è la forma più semplice di CE, in cui le
  molecole sono separate in base alle differenze nel rapporto massa/carica
• elettroforesi capillare ad alta prestazione (HPCE): evoluzione della CE
  tradizionale
• elettroforesi capillare a gel: è l’adattamento della tecnica tradizionale di
  elettroforesi su gel operata su un capillare contenente un mezzo anticonvettivo
  come la poliacrilamide
• focusing isoelettrico (IEF): molecole cariche migrano in un campo elettrico nel
  quale un gradiente di pH le porta al loro punto isoelettrico
• isotacoforesi (ITP): le particelle migrano nel campo elettrico alla stessa
  velocità
• cromatografia capillare elettrocinetica micellare (MECC): l’addizione di
  sostanze in grado di formare micelle permette la separazione di molecole
  neutre (es. fenoli)
                Vantaggi della CE

• utilizza la moderna tecnologia dei rivelatori in modo che gli
  elettroferogrammi assomigliano molto ai cromatogrammi
• l’efficienza è analoga a quella della GC capillare o migliore (N
  piatti teorici elevatissimo)
• richiede una quantità minima di campione e di reagenti
• può essere facilmente automatizzata
• è applicabile ad un range di analiti più ampio rispetto alle altre
  tecniche separazione
  Selezione della tecnica più adatta

Le varie versioni della CE hanno caratteristiche che le rendono più
adatte in certe situazioni. Nella tabella sono elencate in ordine di
efficienza decrescente per la separazione delle diverse classi di analiti



 Ioni a     Molecole a                              Oligo
                           Peptidi    Proteine                   DNA
basso PM    basso PM                              nucleotidi
   CZE         MECC         CZE          CZE         CGE          CGE
   ITP         CZE         MECC          CGE        MECC
                ITP         IEF          IEF
                            CGE          ITP
              Applicazioni della CE
Dal momento che la stragrande maggioranza delle molecole di interesse
biologico è carica, la CE ha applicazioni importanti nell’analisi di
aminoacidi, peptidi, proteine, acidi nucleici a altri biopolimeri, con tempi
di analisi minori rispetto a tecniche cromatografiche equivalenti (SEC).
In particolare, per l’analisi di proteine e peptidi è possibile separare
analiti che differiscono per un solo aminoacido. Nella figura è mostrata
l’analisi di una soluzione di albumina di siero bovino digerita con tripsina
             Applicazioni della CE
Altre applicazioni comprendono la separazione di anioni e cationi
inorganici e di composti farmaceutici purchè carichi




Separazione con MECC di aminoacidi (sx) e di corticosteroidi (dx)
     Tecniche spettroscopiche

          Interazione tra luce e materia
                        
            Tecniche spettroscopiche


• Informazione qualitativa (elementi, composti)
• Informazione quantitativa (concentrazione)
    Lo spettro elettromagnetico
I vari intervalli dello spettro elettromagnetico sono sfruttati a scopo
analitico per ottenere informazioni strutturali quali-quantitative sulla
materia analizzata




                                 Energia

                                   l
Classificazione delle tecniche spettroscopiche

• In base al meccanismo              • In base alla specie interessata
   • assorbimento                       • atomica
   • emissione                          • molecolare
   • fluorescenza


• In base alla regione spettrale impiegata
   • raggi g (0.01 Å)                  PIGE
   • raggi X (0.01 Å – 100 Å)          XRF, PIXE
   • UV-Visibile (10 nm – 800 nm)      AAS, ICP-AES
   • IR (800 nm – 0.4 mm)              FT-IR
   • microonde (0.4 mm – 0.25 m)       EPR
   • radiofrequenze (> 0.25 m)         NMR
Assorbimento ed emissione di luce

                   A livello microscopico la luce
                   interagisce con la materia in
                   modalità     differenti     ma
                   sempre legate a salti tra stati
  S1               energetici




          ~~~ E = h
                   L’assorbimento e l’emissione
  S0               di luce da parte della materia
                   sono    interpretabili   come
                   passaggio tra due stati di
                   energia di un atomo o una
                   molecola
Spettroscopia atomica e molecolare


• Spettroscopia atomica: il campione è trasformato in
  atomi somministrandogli energia  si determinano
 elementi
• Spettroscopia molecolare: il campione è analizzato
  tal quale  si determinano composti
      Regioni spettrali utilizzate

Irraggiando la materia con la radiazione luminosa si creano
effetti diversi a seconda dell’energia della radiazione utilizzata:

• raggi g e raggi X provocano transizioni elettroniche nei gusci
  interni e reazioni nel nucleo
• raggi UV e visibile causano transizioni elettroniche nei gusci
  esterni
• raggi infrarossi causano transizioni vibrazionali e rotazionali
• microonde e onde radio interessano l’orientazione degli spin
  elettronici e nucleari
         Spettroscopia atomica


• Il campione è trasformato in atomi con metodi vari di
  riscaldamento
• Il vapore atomico subisce un interazione con la luce
  oppure con un campo magnetico; l’entità di questa
  interazione fornisce la risposta analitica, qualitativa
  e quantitativa
               Tecniche atomiche
A seconda del tipo di interazione che subisce il vapore atomico, si
possono avere le seguenti tecniche di spettroscopia atomica:
• il vapore è irraggiato con una
  radiazione           monocromatica         Assorbimento atomico
  assorbibile solo dagli atomi di un
  determinato elemento
• il vapore subisce un riscaldamento
  ulteriore e gli atomi emettono il
                                                 Emissione atomica
  surplus di energia sotto forma di
  radiazione luminosa
• il vapore subisce un riscaldamento
  ulteriore e gli atomi si trasformano
                                             Spettrometria di massa
  in ioni i quali sono separati e rivelati
  con uno spettrometro di massa
   Spettroscopia atomica: assorbimento
• il campione è trasformato in atomi con metodi vari di
  riscaldamento
• il vapore atomico subisce un’interazione con la luce emessa da
  una sorgente luminosa (righe)
• la riga viene assorbita solo dagli atomi corrispondenti mediante
  l’assorbimento di risonanza
• l’entità di questa interazione fornisce la risposta analitica
   • qualitativa (quali elementi)
      • identificazione attraverso le l assorbite
   • quantitativa (qual è la concentrazione)
      • calibrazione con soluzioni a concentrazione nota
      • legge di Lambert-Beer (A = ebC)
 Spettrofotometria AAS




  Metodo di         Temperatura di         Tecnica
atomizzazione     atomizzazione (°C)
    Fiamma            1700-3150             FAAS
 Elettrotermico       1200-3000        ET-AAS (GF-AAS)
Assorbimento atomico a fiamma (FAAS)


  comparto della
     fiamma



   regolazione
     dei gas


introduzione del
    campione



  combustibile (acetilene) + comburente (aria)  fiamma
Assorbimento atomico a fiamma (FAAS)



                 cammino ottico




                  • aspirazione in continuo
                  • segnale dipendente dalla
                    concentrazione e non dalla
                    massa
Atomizzazione elettrotermica (ETAAS)




Elettrotermica (ET): atomizzazione mediante una corrente
elettrica ad alta potenza che crea un riscaldamento per effetto
Joule
 Atomizzazione elettrotermica (ETAAS)




il campione (poche decine di µl) viene depositato all’interno di un
cilindro di grafite detto fornetto, sottoposto poi a cicli di
riscaldamento
             Fornetti di grafite



• Il fornetto di grafite ha
  dimensioni di pochi cm
• La tecnica è nota anche come
  GF-AAS
      Spettroscopia atomica: emissione

• il campione è trasformato in atomi con metodi vari di
  riscaldamento
• il vapore atomico emette luce emessa a righe in conseguenza
  dell’energia somministratta sotto forma di calore
• le righe emesse vengono separate e misurate
• l’entità dell’emissione fornisce la risposta analitica
   • qualitativa (quali elementi)
      • identificazione attraverso le l emesse
   • quantitativa (qual è la concentrazione)
      • calibrazione con soluzioni a concentrazione nota
      • intensità propozionale alla concentrazione (I = C)
 Spettrofotometria AES




  Metodo di       Temperatura di      Tecnica
atomizzazione   atomizzazione (°C)
   Fiamma           1700-3150        FAES (FF)
  Plasma IC         6000-8000         ICP-AES
    Emissione atomica a fiamma (FF)


  comparto della
     fiamma



   regolazione
     dei gas


introduzione del
    campione



     utilizzo lo stesso strumento senza sorgente ottica
Emissione atomica con plasma (ICP-AES)
      Spettrofotometria ICP-AES
                             Sistema ottico
                                                         Smaltimento fumi
     Torcia di quarzo



                                                                   al PC




       Nebulizzatore

Camera di nebulizzazione

              2 canali:
         1 per il campione
          1 per lo scarico          Pompa peristaltica
Spettrometria di massa con plasma (ICP-MS)




      Metodo di       Temperatura di     Tecnica
    atomizzazione   atomizzazione (°C)
      Plasma IC         6000-8000        ICP-MS
Spettrometria ICP-MS
         Spettrometria ICP-MS
 Spettrometro di
massa e rivelatore           Interfaccia

                                                 Torcia ICP




                     Introduzione del campione
         Caratteristiche tecniche

• tecniche distruttive (1500-8000 °C)
• si determinano elementi
• si analizzano liquidi, solidi se disciolti
• analisi totale del campione
• risultati espressi in concentrazione
• ottima sensibilità
   • mg/l per FAAS e FF
   • µg/l per GFAAS e ICP-AES
   • ng/l per ICP-MS
Confronto tra tecniche
Limiti di rivelabilità
         Spettroscopia molecolare

• Il campione è irraggiato con luce avente l nell’UV, nel visibile o
  nell’infrarosso
• Le molecole che compongono il campione assorbono l’energia
  irradiata se essa è in quantità sufficiente per far vibrare i loro
  gruppi funzionali (visibile, IR) oppure per promuovere
  transizioni elettroniche (UV, visibile)
• La risposta del campione viene registrata e, in base ai segnali
  raccolti, è possibile risalire alla composizione del campione in
  termini di molecole
• Le   tecniche   più   comunemente   utilizzate   sono   quelle   in
 assorbimento
Spettroscopia molecolare: assorbimento
• il campione è irraggiato con luce avente l nell’UV, nel visibile o
  nell’infrarosso (bande o righe)
• le molecole che compongono il campione assorbono l’energia irradiata se
  essa è in quantità sufficiente per far vibrare i loro gruppi funzionali
  (visibile, IR) oppure per promuovere transizioni elettroniche (UV,
  visibile)
• la risposta del campione viene registrata e, in base ai segnali raccolti, è
  possibile risalire alla composizione del campione in termini di molecole
• l’entità di questa interazione fornisce la risposta analitica
   • qualitativa (quali composti)
       • identificazione attraverso le l assorbite
   • quantitativa (qual è la concentrazione)
       • calibrazione con soluzioni a concentrazione nota
       • legge di Lambert-Beer (A = ebC)
           Spettrofotometria IR
Il campione è irraggiato con un intervallo più o meno ampio di l; le
l assorbite corrispondono ai gruppi funzionali delle molecole, i
quali assorbono l’energia equivalente per vibrare. La risposta è
visibile sotto forma di spettro di assorbimento


                                Esempio di spettrofotometro IR.
                                Si tratta in genere di strumento
                                molto compatti
                                I campioni liquidi sono analizzati
                                tal quali, mentre per i campioni
                                solidi si prepara una pastiglia di
                                KBr nel quale si disperde il
                                campione polverizzato; è possibile
                                analizzare anche i campioni
                                gassosi
IR: modi di vibrazione

        Alcuni modi di vibrazione sono gli
        stretching (allungamenti) e i
        bending      (piegamenti)     che
        corrispondono a livelli energetici
        ben definiti
          Esempio di spettro IR
Il campione è irraggiato con un intervallo di l compreso tra 2.5 e
20 µm (o  compreso tra 4000 e 500 cm-1). Il 100% della scala di
trasmittanza corrisponde ad assorbimento nullo
          Spettrofotometria IR




Ogni gruppo funzionale ha modi di vibrazione corrispondenti a l o
 ben definite, che ne permettono l’identificazione
                Impronta digitale

L’insieme dei gruppi
funzionali identificati
permette di risalire
globalmente        alla
molecola, lo spettro
IR      della    quale
corrisponde         ad
un’impronta digitale
   Spettro IR della formaldeide



                                                             H
                                                    H    C
                                                             O




L’assegnazione delle bande di assorbimento ai vari modi di
vibrazione permette di risalire in modo ancora più accurato alla
struttura della molecola
                  Applicazioni IR

Esempi di applicazioni della tecnica IR:
• caratterizzazione strutturale di prodotti di sintesi
• caratterizzazione strutturale di intermedi di sintesi
• monitoraggio di cinetiche di reazione
• caratterizzazione della purezza di un composto
• raramente utilizzata per determinazioni quantitative
  Spettrofotometria UV-visibile
Il campione è irraggiato con un intervallo più o meno ampio di l; le l
assorbite, aventi energia sufficiente a promuovere transizioni
elettroniche, corrispondono ai gruppi funzionali delle molecole. La
risposta è visibile sotto forma di spettro di assorbimento
Gli     spettrofotometri
UV-visibile sono molto
diffusi per la loro
semplicità di utilizzo e
versatilità e per il basso
costo; quasi tutte le
sostanze        organiche
presentano assorbimenti
nel range strumentale
(180-800 nm)
Un      utilizzo   molto
comune si ha come
rivelatore per HPLC
         Transizioni elettroniche
La spettroscopia UV-visibile è detta anche spettroscopia elettronica
perchè è basata su transizioni di elettroni tra livelli energetici diversi
Le transizioni elettroniche più comuni sono illustrare nella figura
sottostante. Esse si verificano se nel campione sono presenti molecole
aventi cromofori, cioè gruppi funzionali in grado di assorbire la luce,
come il gruppo –NO2 (nitro), -N2- (azo), ecc.
Solo le transizioni di elettroni n e  hanno energie nel range 200-800 nm
Esempio di spettro UV-visibile
               Esempio di spettro UV-visibile
               di un’aldeide insatura. La
               banda a 395 nm rende conto
               del fatto che il composto è
               colorato in arancio, colore
               complementare rispetto al
               violetto che corrisponde alla
               regione spettrale interessata
               (~ 400 nm).
               Le bande di assorbimento
               registrate sono in numero
               minore rispetto all’IR, tuttavia
               è possibile utilizzarle per
               effettuare      determinazioni
               quantitative secondo la legge
               di Lambert-Beer
     Tabella dei gruppi cromofori
Alcuni esempi di gruppi cromofori con i relativi coefficienti di estinzione molare o
assorbività molare (e)


Cromoforo         Esempio         Transizione     lmax (nm)       e       Solvente


    C=C            Etene              *           171       15.000       Esano


    C=C           1-Esino             *           180       10.000       Esano

                                    n  *           290          15
    C=O           Etanale                                                   Esano
                                      *           180       10.000
                                    n  *           275          17
   N=O         Nitrometano                                                 Etanolo
                                      *           200        5.000
   C-X                                               205         200
              Metil bromuro         n  *
  X = Br                                                                    esano
               Metil ioduro         n  *           255         360
  X=I
     Applicazioni dell’UV-visibile

• caratterizzazione strutturale di prodotti di sintesi
• monitoraggio di cinetiche di reazione
• caratterizzazione della purezza di un composto o di un prodotto
  naturale (es. olio, vino)
• determinazione quantitativa di specie di interesse chimico-
  clinico o ambientale (A = ebC)
• rivelazione in sistemi cromatografici
         Caratteristiche tecniche

• tecniche distruttive o non distruttive
• si determinano composti
• si analizzano liquidi, solidi o gas
• analisi totale o parziale del campione
• risultati espressi in concentrazione
• buona sensibilità (mg/l)
       Tecniche molecolari: Raman
Il campione è irraggiato con luce monocromatica; le l assorbite,
aventi energia minore rispetto alla l irraggiata, corrispondono ai
gruppi funzionali delle molecole, i quali assorbono la differenza di
energia per vibrare. A differenza dell’IR, non si misura la luce
assorbita ma quella che viene restituita o diffusa dai gruppi
funzionali dopo l’assorbimento. La risposta è visibile sotto forma
di spettro

                                          Spettro Raman di
                                          un pigmento
         Caratteristiche tecniche

• tecniche distruttive o non distruttive
• si determinano composti
• si analizzano liquidi, solidi o gas
• possibili analisi in situ
• analisi totale o parziale del campione
• risultati espressi in concentrazione
• buona sensibilità
          Fluorescenza a raggi X
Il campione è colpito con un fascio di raggi X dalla sorgente. Gli
elementi presenti localmente vengono eccitati, cioè passano ad
uno stato energetico superiore, dal quale decadono
istantaneamente emettendo radiazioni X monocromatiche
specifiche per ogni elemento
L’intensità delle radiazioni
emesse è correlabile alla
concentrazione         degli
elementi     presenti    nel
campione      nel     punto
irraggiato
La zona irraggiata      può
essere di 3-100 mm2
         Caratteristiche tecniche

• tecnica non distruttiva o distruttiva
• si determinano elementi
• si analizzano liquidi, solidi
• possibilità di analisi in situ
• buona risoluzione spaziale
• risultati espressi in concentrazione
• sensibilità discreta
 Altre tecniche spettroscopiche

Esistono altre tecniche di analisi nelle quali si sfrutta
l’interazione della materia con un campo magnetico e/o con una
radiazione luminosa
Le tecniche principali in questo settore sono due:
• la spettrometria di massa
• la risonanza magnetica nucleare o NMR
Queste tecniche vengono generalmente considerate tecniche
spettroscopiche al pari di quelle descritte in precedenza
Spettrometria di massa (MS)



              Nella spettrometria di massa
              le molecole sono trasformate
              in ioni i quali, attraverso
              l’interazione con un campo
              elettromagnetico,         sono
              separati e analizzati per
              fornire informazioni sul peso
              molecolare e la struttura
              della molecola progenitrice
          Esempio di spettri MS
in questo esempio il campione è costituito da H2O. Attraverso la
sorgente si possono formare lo ione molecolare (H2O + e-  H2O+
+ 2 e-) e i frammenti H+, O+ e OH+

                                             specie   massa
                                               H2O+    18
                                               OH+     17
                                               O+      16
                                               H+       1

                                       I segnali degli ioni sono
                                       riportati assegnando allo
                                       ione più abbondante il 100%
                                       e mostrando gli altri ioni
                                       come percentuale di esso
   Applicazioni della tecnica MS

Le applicazioni della tecnica MS spaziano in tutti i campi della
scienza. In particolare:
• analisi ambientale (determinazione di composti tossici come
  diossine, PCB, PAH, ecc.)
• caratterizzazione di composti di interesse biologico o
  farmaceutico (macromolecole, prodotti di ingegneria genetica,
  principi attivi, ecc.)
• analisi di materiale di interesse agroalimentare (prodotti
  naturali e sintetici, ecc.)
• rivelatore per cromatografia, sia GC che LC
  Risonanza Magnetica Nucleare (NMR)

Questa tecnica analitica è da ormai 50
anni la più utilizzata nel campo della
caratterizzazione della struttura di
sostanze     organiche;    ha    buone
potenzialità anche in campo inorganico
Le caratteristiche tecniche dell’NMR
ne fanno però uno strumento da
ricerca più che da laboratorio, per
quanto    alcune  applicazioni   siano
entrate nella routine, per esempio
nell’ambito del controllo in campo
alimentare
La tecnica si basa sull’interazione tra atomi aventi numero di spin
non nullo posti in un campo magnetico, e una radiazione
elettromagnetica nel campo delle radiofrequenze
            Nuclei e numeri di spin
Alcuni esempi di specie con numero di spin nullo o non nullo sono
riportate nella tabella seguente


  Numero        Numero      Numero
                                        Esempi         NMR-attivo
 di protoni   di neutroni   di Spin
    pari         pari         0       12C, 16O, 32S        no
  dispari        pari         1/2      1H, 19F, 31P        si
  dispari        pari        3/2      11B,35Cl, 79Br       si
    pari        dispari       1/2          13C             si
    pari        dispari      3/2          127I             si
    pari        dispari      5/2           17O             si
  dispari       dispari        1        2H, 14N            no
Schema di uno spettrometro NMR
Chemical shift: esempi
Esempio di spettro 1H NMR




   acido dimetilbenzoico
Esempio di spettro   13C   NMR
            Tecniche accoppiate

Le tecniche accoppiate o ifenate (dall’inglese hyphen che indica il
trattino di sillabazione) sono costituite dall’interfacciamento di
un sistema separativo ad un sistema di rivelazione spettroscopica
Questa combinazione sfrutta i vantaggi di entrambi i sistemi:
• la parte cromatografica produce frazioni pure di analita
• la parte spettrale fornisce informazioni su un componente puro
Le tecniche ifenate più comuni sono GC-MS ed LC-MS, disponibili
in versioni commerciali largamente diffuse. Altre tecniche sono
meno diffuse, es. GC-AES, LC-ICPMS. A parte GC-MS, si tratta
normalmente di strumenti disponibili a grandi centri di ricerca
            Informazioni fornite

Le grandi potenzialità delle tecniche ifenate sono legate alle
informazioni strutturali che forniscono sul campione
• spettri di massa
• determinazione di specie diverse di uno stesso elemento
       Determinazione di metalli
Combinazioni possibili




• step di cleanup della matrice
• step di preconcentrazione
• possibilità di studi di speciazione
     Criteri di scelta: separazione
Scelta della fase mobile o del carrier

rivelatore   gassoso    secco     acquoso   organico       salino
                                                                    +++ necessario
  AFS          +++       +++         X         X             X
                                                                    ++ possibile
  FAAS          ++         +        +++        ++           ++
                                                                    + in condizioni specifiche
ICP-AES         ++        ++        +++        +            ++
                                                                    X non utilizzabile
 ICP-MS         ++        ++        +++        +             X


• carrier gassoso (solo per elementi che formano idruri)
      • GC-AFS
      • IEC-(postcolumn-HG)-AFS
• carrier organico (specie lipofiliche)
      • RP-HPLC-FAAS
      • RP-HPLC-ICP-AES (necessaria desolvatazione)
      • RP-HPLC-ICP-MS (necessaria desolvatazione)
• tamponi (specie ioniche e non ioniche)
      • IEC-ICP-MS (solo tamponi < 50 mM)
      • Ion pair-RP-HPLC-ICP-AES
    Criteri di scelta: rivelazione

• in base agli analiti da determinare
    • As, Se, Hg, Sb  AFS
    • Cu, Zn, Cr  FAAS
• in base alla concentrazione
    • elementi maggiori  FAAS
    • tracce  AFS, ICP-AES
    • ultratracce  AFS, ICP-MS
• il rivelatore deve poter funzionare in modalità continua
• il sistema deve generare segnali transienti
 Speciazione di elementi volatili

Se, As, Sb, Te, Hg, (Sn) formano idruri volatili  LC-HG-AFS




                         Separazione di composti organoarsenici
GC-ICP-MS

      • solo per elementi che
        formano      composti
        volatili
      • necessita            di
        derivatizzazione (HG o
        etilazione)
      • 100 % di campione
        introdotto nel detector
        (sensibilità elevata)
      • nessun    problema    di
        interfaccia     (carrier
        gassoso!)
Speciazione di organometalli




                Speciazione di composti
                organostannici (5 ppb)
                      GC-ICP-AES

• meno sensibile di GC-ICPMS
• interfacciamento semplice
• produce uno spettro di emissione per ogni analita
                           GC-FTIR

• può    distinguere    isomeri
  strutturali che presentano
  lo stesso spettro di massa
• fornisce informazioni sulla
  struttura molecolare anche
  in assenza di un esatto
  riferimento
• limitazione: librerie povere
  (poche migliaia di spettri
  contro 250.000 spettri in
  MS), in quanto la maggior
  parte degli spettri è in fase
  liquida o solida, ma in fase
  gas sono diversi
                      CE-ICP-MS




• richiede un’interfaccia speciale
• effetti matrice elevati
• consumo di campione bassissimo (nL)
• risoluzione eccellente
       Tecniche elettrochimiche

Le tecniche elettrochimiche sono rivolte alla determinazione di
specie elettroattive. Si tratta di un gruppo di tecniche con
ottime prestazioni in termini di sensibilità, versatilità e rapporto
qualità/costo, ma sono solitamente poste in secondo piano a causa
della difficoltà di comprendere appieno la teoria che sta alle loro
basi
Classificazione
Tecniche volumetriche
Saggi qualititativi

								
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