cultivos by W72JwZk

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									Cultivos
celulares




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INDICE

INTRODUCCION........................................................................................................................... 3

CLASES DE CULTIVOS CELULARES ....................................................................................... 3
   CULTIVOS PRIMARIOS ........................................................................................................... 4
   LINEAS CELULARES ............................................................................................................... 4
   CULTIVOS TRIDIMENSIONALES ............................................................................................ 4
   CULTIVOS EN MONOCAPA .................................................................................................... 4
   CULTIVOS EN SUSPENSION .................................................................................................. 5
   SUPLEMENTACION DE LOS MEDIOS CON SUERO ............................................................. 5
CARACTERÍSTICAS DE LOS CULTIVOS CELULARES ........................................................... 6
   TIPOS DE CULTIVOS CELULARES ................................................................................................... 6
   TIPO DE CRECIMIENTO CELULAR ................................................................................................... 6
REQUERIMIENTOS DEL CRECIMIENTO CELULAR ................................................................. 7
   REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES ............................................................................................... 7
   REQUERIMIENTOS FISIOLÓGICOS .................................................................................................. 7
   TIPOS DE MEDIO DE CULTIVO ........................................................................................................ 7
TÉCNICAS GENERALES DE CULTIVO CELULAR ................................................................... 7

EN QUE CONSISTE UN LABORATORIO DE CULTIVOS CELULARES................................... 8
   MODELO DE LABORATORIO PARA CULTIVO CELULAR ...................................................................... 9
   EQUIPAMIENTO............................................................................................................................ 9
NORMAS DE BIOSEGURIDAD ................................................................................................. 10

BIBLIOGRAFÍA........................................................................................................................... 10




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INTRODUCCION
Los cultivos celulares constituyen una herramienta básica de aplicación fundamental en el
diagnóstico viral, en el campo Médico o en el Veterinario, en la investigación y en la industria
farmacéutica.
El desarrollo de los cultivos celulares ha sido el punto de partida para el desarrollo de la
virología, permitiendo la replicación y el conocimiento de este tipo de agentes y logrando el
desarrollo de medidas preventivas, a través de la producción de vacunas y también de
diferentes proteínas, lo cual ha facilitado la obtención de compuestos terapéuticos. Lo anterior
ha implicado un desarrollo biotecnológico al nivel industrial y el interés y la capacitación de
profesionales del campo pecuario, para liderar esta importante área del conocimiento.

El aporte que los cultivos celulares han dado a todos los campos de la biología, es semejante a
la injerencia de los anestésicos en las prácticas quirúrgicas. La investigación en biología
celular, biología molecular y virología así como los estudios en cáncer, han dependido de
técnicas de cultivo de células.
Con el cultivo de células in vitro se ha logrado el desarrollo de un determinado tipo de célula,
con una alta reproducibilidad. Igualmente el cultivo de grupos de células o de estructuras
celulares, ha sido importante en el establecimiento de relaciones estructurales y funcionales en
algunos organismos.
Con el advenimiento de los cultivos de células se logró la reproducibilidad de los agentes
virales, permitiendo de esta forma su estudio estructural y bioquímico, básico en la elaboración
de biológicos que han servido para prevenir la presentación de enfermedades, así como en el
desarrollo de técnicas diagnósticas utilizadas en la detección de un agente en particular.
Los cultivos celulares han servido para la producción de una amplia variedad de proteínas
como los compuestos químicos de la sangre, hormonas, anticuerpos monoclonales, y de
sustancias de gran significancia a nivel terapéutico, como el interferón producido a partir de
cultivos continuos transformados (líneas celulares), permitiendo el surgimiento de una industria
biotecnológica altamente competitiva. Establecer un cultivo de células conlleva un grado de
complejidad determinado por su adaptación a condiciones similares a las que se tienen in vivo,
siendo fundamental para los medios utilizados su suplementación con suero, aminoácidos y
antibióticos.
Se puede afirmar que el desarrollo de los cultivos de tejidos ha sido de gran impacto en el
desarrollo de las ciencias biológicas. Con éstos se ha logrado determinar y clasificar tanto
tumores humanos como animales, así como la detección temprana de desórdenes genéticos a
nivel embrionario.
Igualmente han sido básicos en el diagnóstico viral y en la producción a gran escala de
antígenos para la elaboración de vacunas. Mediante los cultivos celulares se pueden valorar
los efectos tóxicos de diferentes pesticidas usados en la actividad agrícola y pecuaria.
Existen investigaciones que no se podrían realizar sin el soporte de los cultivos celulares, como
en el caso de animales transgénicos, donde se pretende que organismos desarrollados
expresen genes nuevos, mediante la inserción de genes extraños en células receptoras.
Producir células implica un alto grado de preparación por parte del recurso humano
especializado, para dar el adecuado manejo a los conceptos básicos de esterilidad, así como
destreza en la detección de problemas (requerimientos de un cultivo en particular, estabilidad
de algunos reactivos) y la identificación de algunos virus a través del tipo de efecto citopático
que pueden generar en un determinado cultivo celular.



CLASES DE CULTIVOS CELULARES
Los cultivos celulares son el producto de la colección de células animales de diferentes
órganos, colocadas en condiciones especiales propicias para su sobrevivencia y multiplicación,
manteniendo para esto todas sus funciones metabólicas de una manera semejante a las que
tenía en el huésped.
Los cultivos de células animales se han clasificado de acuerdo a su capacidad de anclaje
(adherencia), y así han sido aisladas recientemente de un órgano determinado o si provienen
de células que han sufrido modificación.



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De acuerdo a su capacidad de adherencia o no a una superficie determinada pueden crecer
formando monocapa o en suspensión respectivamente, lo que está muy asociado con el tipo de
célula de la cual derivan: por lo general las células provenientes de órganos, crecen en
monocapa; igualmente existen células que pueden crecer indistintamente tanto en monocapa
como en suspensión, ejemplo son las células HeLa que son células transformadas derivadas
de cultivos en monocapa.
Cuando el cultivo proviene de células que han sido disgregadas de un tejido original tomado de
un órgano de un animal recién sacrificado, reciben el nombre de Cultivo Primario; cuando
éste cultivo primario es sometido a procesos de transformación que le confiere capacidad
ilimitada de multiplicaciíon, reciben el nombre de Líneas Celulares.

CULTIVOS PRIMARIOS
Los cultivos primarios tienen características especiales que los diferencian de las líneas
celulares: conservan la morfología de las células del órgano del que fueron aisladas, sus
cromosomas tienen un número diploide (2n), su crecimiento in vitro es limitado y hay inhibición
por contacto.
El estar más cercanas a las células que las originaron, se ve reflejado en una mejor actividad y
funcionalidad similar a su ambiente natural, por lo que en aislamientos primarios de cepas
virales éstas tienen mayor sensibilidad que una Línea Celular ya establecida. Igualmente para
la producción de vacunas los cultivos primarios son recomendables por tener una baja
probabilidad de que se transformen en malignos.
Dentro de las desventajas está la de una mayor probabilidad de presentar virus adventicios o
latentes, lo que implica el desarrollo de la adecuada tecnología para el control de calidad.

LINEAS CELULARES
Las Líneas Celulares continuas están formadas por células que se diferencian genética y
morfológicamente de las células de las cuales se originaron. Pueden provenir de células que se
derivan de tumores o de un proceso de transformación de un cultivo primario mediante
transfección con oncogenes o con tratamiento con carcinogenéticos, lo que les confiere un
nuevo fenotipo.
Este tipo de cultivo tiene la característica de ser aneuploides, de no tener inhibición por
contacto y de crecer de manera indefinida. El paso de un cultivo primario a línea se denomina
transformación.
Una transformación puede inducirse fisiológicamente (interacción celular, polaridad) a través de
hormonas como la hidrocortizona o utilizando inductores no fisiológicos como el DMS.

CULTIVOS TRIDIMENSIONALES
Son aquellos que buscan mantener la característica o arquitectura del tejido in vivo. Los
sistemas tridimensionales permiten estudiar la proliferación y morfología epitelial y su
interacción con otras células como son las del tejido conectivo; igualmente con ellos se puede
evaluar el efecto de sustancias que pueden influenciar en tales interacciones intercelulares.

CULTIVOS EN MONOCAPA
Las células exhiben una variedad de "comportamientos sociales", lo que hace que su
multiplicación sea inhibida cuando establecen contacto entre sí, permitiendo la formación de
una monocapa que cubrirá la correspondiente superficie de crecimiento. Las células
provenientes de cultivos primarios son las que mejor crecen en ésta condición, dada su
estabilidad genética y su naturaleza diploide normal.
Los recipientes para el cultivo de células estacionarias son cajas de Petri, frascos para el
cultivo de tejido (T-25, T-75), entre otros, que pueden ser de material de plástico o de vidrio
previamente tratado y su desprendimiento para transferirlas a superficies mayores se realizan
con agentes proteolíticos como la tripsina.
Cuando se requiere la producción de éste tipo de cultivo en una escala mayor, se debe
incrementar el área de la superficie de crecimiento, siendo ideal utilizar botellas en rotación
(roller). Mediante éste sistema, las células pueden crecer en toda la parte interna de la pared



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de la botella, usando un aparato que permite la rotación del roller a una baja velocidad; de esta
forma un roller de 1 litro que requiere 100 ml de medio, confiere una superficie de crecimiento
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de 500 cm .
Otra forma de aumentar el número de células adherentes por volumen de frasco, es utilizando
microperlas (microportadores), que son compuestos en base a dextranos o a vidrio, las que
flotan cuando se emplean en cultivos con agitación, lo que le da una mayor disponibilidad de
superficie para el crecimiento celular: con 100 ml de medio de cultivo, se logra una superficie
           2
de 0.24 m . La relación superficie-volumen para los rollers es de 0.2-0.7, mientras que para los
microportadores es de 122-153.
Existen otras consideraciones que influyen en la utilización de sistemas en monocapa a pesar
de las ventajas que tienen los cultivos en suspensión, entre las que están la flexibilidad para
desarrollar cultivos primarios o de líneas heteroploídes, la facilidad para la remoción del medio
gastado antes de infectar las células y la alta concentración que se obtiene del producto.

CULTIVOS EN SUSPENSION
Las Líneas celulares que provienen de cultivos primarios con requerimiento de anclaje a
superficies, tienen la propiedad de crecer de manera estacionaria o en suspensión después de
un período de adaptación.
Existe evidencia experimental que los sistemas en suspensión también requieren de matrices
que son macromoléculas, que sirven de protectores a la superficie celular; éstas
macromoléculas se encuentran en el suero, el cual contribuye igualmente con el medio de
cultivo, proporcionando un sistema balanceado de nutrientes. Dentro de éstas matrices está el
Methocel, esencial para el crecimiento de cultivos en suspensión.
Aunque el cultivo estacionario es ideal cuando se busca la elaboración de productos
extracelulares, el cultivo en suspensión es deseable cuando los productos son intracelulares o
cuando se presentan problemas con la capacidad de anclaje de un determinado tipo de célula.
El proceso de cultivo continuo ofrece factores económicos decisivos (utilización de mejores
equipos, reducida manipulación) cuando se trata de producir cultivos a una mayor escala de
operación.

SUPLEMENTACION DE LOS MEDIOS CON SUERO
El papel de suero, especialmente fetal bovino en el establecimiento y mantenimiento de líneas
y cultivos celulares, es fundamental; cuando estos se han establecido en medios libres de
suero, el crecimiento celular requiere, la suplementación con hormonas y otros factores de
crecimiento que están involucradas en transporte de nutrientes, mantenimiento de balance de
energía celular, control de síntesis de macromoléculas y factores que estimulan la formación
del producto deseado. Muchos de los factores suplementados son purificados del mismo suero,
lo cual hace que cultivos a gran escala con medio libre de suero no sean rentables.
Uno de los inconvenientes que presentan los laboratorios de investigación y diagnóstico es el
del alto porcentaje de cultivos contaminados por el virus de la DVB. Como consecuencia de la
infección intrauterina de los bovinos donantes del suero, las líneas celulares y los cultivos
primarios se pueden contaminar con el virus cuando son suplementados con el suero
contaminado. El porcentaje de contaminación del suero fetal comercial oscila entre el 10y el
70%.
Las células afectadas, alteran su eficiencia en la replicación, y en la producción de metabolitos
específicos. Como una alternativa para prevenir este probloma se ha optado por la radiación de
los lotes de suero; se han evaluado otros métodos de inactivación, a través del uso de
sustancias tales como el BEI (etilenimina binaria), la cual ofrece ventajas comparativas, pero
demanda estudios adicionales para determinar el efecto en el tiempo, sobre la calidad de las
células como substrato biológico en pruebas diagnósticas y especialmente en el aislamiento de
agentes virales.
Sin embargo, además de buscar soluciones para el producto final, se han desarrollado también
métodos y técnicas para la detección de animales inmunotolerantes persistentemente
infectados con el virus de la DVB, usando cultivo de células polimorfonucleares y técnicas de
inmunoperoxidasa indirecta.




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                  Características de los cultivos celulares

Tipos de cultivos celulares
                                         Tejido u órgano


                        Disgregación: mecánica, enzimática o por tamices



                             Cultivo primario: primer cultivo in vitro
            Conserva cariotipo diploide característico del organismo que le dio origen



                                  Subcultivo: línea celular
             Primeros pasajes conserva células y cariotipo del organismo de origen




      Línea celular continua                          Línea celular común establecida


      1 tipo celular, diploide                              1 tipo celular, aneuploide
         =50 generaciones                             teóricamente infinitas generaciones


Tiempo generacional: tiempo que tardan las células de un cultivo en duplicarse.


Tipo de crecimiento celular

                                   Monocapa: capa de células crecidas sobre superficie
                                    Hay células que para crecer necesitan una superficie de
                                      adhesión.
                                    Morfología de fibroblasto o epitelial


  Células

                                   Suspensión: crecen en medio líquido
                                    Hematopoyéticas, transformadas o de tumores malignos.
                                    Morfología redondeada.




Cultivos en masa: obtienen células a gran escala.
 Botellas roller, microcarriers, tanques fermentadores, reactores de fibra hueca, etc.




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                  Requerimientos del crecimiento celular

Requerimientos nutricionales
1. Medios de cultivo: composición de nutrientes esenciales balanceados cuantitativamente.
Aminoácidos: síntesis de proteínas y ácidos nucleicos
Hidratos de carbono: fuente de energía
Iones inorgánicos
Vitaminas, etc

2. Suero: composición no cuantitativa de diferentes componentes con actividad promotora del
crecimiento celular.


Requerimientos fisiológicos
   Temperatura (gral. 37º C)
   pH óptimo (gral. 7.2-7.4)
   CO2 (gral. 5%)
   Presión osmótica
   Humedad cercana a saturación



Tipos de medio de cultivo

Definidos (sin suero): compuesto por elementos cuya composición química y concentración
están perfectamente determinados. Medio solo o con agregados de formulaciones especiales.
Ejemplos:
 MEM: medio esencial mínimo, 27 factores esenciales para el crecimiento celular.
 DMEM: medio esencial mínimo modificado.
 HamF12: MEM + albúmina, transferrina, insulina y piruvato de sodio.

No definidos (con suero o hidrolizados proteicos): tienen componentes cuya composición
química y concentración no están determinados.
Ejemplos:
 Medios de mantenimiento: células con metabolismo basal (MEM + 2% de suero)
 Medios de crecimiento: activación del ciclo celular (MEM + 10% de suero)



                   Técnicas generales de cultivo celular


                                                  Cambios periódicos del medio (bajo pH y
                                                  agotamiento de nutrientes, por crecimiento celular


      Mantenimiento de los cultivos
                                                  Volumen del medio


                                                  Subcultivos




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                                                    Contar en cámara de conteo
                                                    o hemocitómetro
                                                    “cámara de Newbauer
                                                    error del 10%
      Viabilidad celular

                                                    Contadorelectrónico o Coulter


Objetivo: conservar células por largos períodos, disminuir riesgos de contaminación y

     Preservación celular                           Congelación

probabilidad de pérdida de caracteres deseados por los sucesivos pasajes.


 Cultivo celular                     Congelación                      Descongelación

                                Lento y gradual para evitar             Lo más rápido
                                 formación de cristales                   posible
                                 intracelulares.
                                Agregar agentes (DMSO)
                                 que se unen al agua: baja
                                 formación de cristales y por
                                 consecuencia la
                                 concentración de electrolitos
                                 que aparecen son
                                 perjudiciales para la célula.




                   EN QUE CONSISTE UN LABORATORIO
                       DE CULTIVOS CELULARES

Un laboratorio de cultivo celular debe contar con una infraestructura básica en la cual se
disponga de áreas independientes para llevar a cabo la preparación y esterilización de medios
y reactivos, un espacio independiente para el proceso de lavado y preparación de material y un
área propiamente destinada al trabajo con cultivos celulares.
Dentro de la infraestructura física básica se debe contar con sistemas de refrigeración y
congelación, incubadoras, centrífugas, balanzas, microscopios y cabinas de flujo laminar.
Adicionalmente, se debe disponer de un buen suplemento de material plástico y de vidrio y con
sistemas de esterilización apropiados para los diferentes tipos de reactivos y material
utilizados.
Esterilización: proceso por el cual se eliminan totalmente los microorganismos de un objeto o
sustancia.
Desde el punto de vista de los sistemas de esterilización se pueden citar los siguientes:
Calor Húmedo: Mediante el empleo de autoclaves los cuales proporcionan una temperatura de
     o
121 C, por lo menos por 20 minutos a una presión de 1.2 atm.
Utilizados para la esterilización de soluciones cuyos componentes no se degradan por éste
método, material plástico y de vidrio y equipos de filtración.
                                                                  o
Calor Seco: lo constituye el uso de hornos a temperatura de 200 C por espacio de 3 horas.
Es empleado para la esterilización de material de vidrio particularmente.




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Filtración: a través del uso de equipos con membrana de nitrocelulosa o acetato de celulosa
con poro de 0.22 ó 0.1 micrometros de diámetro, mediante la aplicación de presión positiva o
negativa.
Por éste sistema se esterilizan la mayor parte de los medios de cultivo, suero, solución de
antibiótico-antimicótico y suplementos.
Desinfección: proceso por el cual se detiene el desarrollo celular de los microorganismos,
elimina la mayor parte de éstos pero no sus esporas.

Modelo de laboratorio para cultivo celular

Objetivo: proteger al operador y al producto.

Tener en cuenta:
 Diseño
 Ubicación
 Equipamiento
 Entrenamiento del personal encargado


Areas de un laboratorio

1. Area estéril o de cultivo: tener cámaras de flujo laminar o cerradas con UV.
Requerimiento:
 Sin corrientes de aire
 Filtros de aire
 Desinfecciones periódicas
 Luz UV en períodos de descanso
 Area, equipos y materiales usados sólo para cultivo celular

2. Incubación: estufas humidificadas a 37ºC, gaseadas con CO2 o cuartos termostáticamente
   controlados.

3.   Preparación
    Los medios se filtran en cámaras de flujo laminar
    pHímetros y agitador magnético
    guantes, barbijo y guardapolvo

4. Almacenamiento: tanques de N2 para los cultivos celulares

5. Lavado y esterilización: preparación del material lejos del área de cultivo


Equipamiento
    Cabina de flujo laminar
    Centrífugas refrigeradas
    Microscopio o lupa invertida
    Equipos de esterilización
    Tanques de almacenamientos de células
    Heladera y freezer
    Estufas con y sin CO2
    Fuentes de agua: destilador, desionizador, etc
    Baños termoestabilizados
    Balanzas, pHímetro, agitador magnético, pipeta automática, etc
    Materiales: probetas, pipetas, botellas, frascos de cultivo, cámara de Newbauer, etc




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Función de la cámara de flujo laminar

Proteger de contaminación al operador, producto y medio ambiente.
Características principales: aire filtrado estéril (HEPA) y regimen de aire laminar.
Los filtros HEPA retienen un 99% de eficiencia las partículas de hasta 0.3 micrones.

Se pueden clasificar en 3 según su nivel de bioseguridad que ofrezcan. La elección del nivel de
bioseguridad depende de la peligrosidad del material de experimentación.

Clase 1: cámara de extracción de aire que pasa por un filtro
 Protege al medio ambiente y al operador
 No protege al producto

Variante: flujo laminar de circulación horizontal
 Protege al producto
 No protege al medio ambiente ni al operador

Clase 2: flujo laminar de circulación vertical, doble sistema de filtración
 Protege al medio ambiente, al operador y al producto

Clase 3: sistemas totalmente cerrados de alta seguridad, el operador solo accede al producto
mediante guantes.


                               Normas de bioseguridad

   No comer, beber, etc
   No pipetear con la boca
   No al ingreso de personas no autorizadas
   Lavarse las manos antes y después del trabajo
   Usar guantes sólo cuando sea necesario
   El material se descarta en lugar especial
   Usar guantes desinfectantes
   Desinfectar mesadas antes y después de usarla



Bibliografía
       www.encolombia.com/acovez24_evolucion14.htm
       www.ub.es/biocel/wbc/recursos/coleccionphc.htm




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