??????? ???????????? by Hq8B58R

VIEWS: 94 PAGES: 31

									อุปกรณ์ ชนิดของอาหาร และ
 การเตรียมอาหารเพาะเลี้ยง
   เนื้อเยื่อและเซลล์สัตว์
           หัวข้อบรรยาย
1.   Tissue Culture (Laminar-flow) Hood
2.   CO2 incubator
3.   Aspiration pump
4.   Tissue culture substrate
5.   Media & Supplements
            1. Tissue Culture Hood
 Laminar-flow Hood
  หรือ Laminar-flow
  Cabinet
 สร้างบริเวณปลอดเชื้อ
  สาหรับการทางาน
 กรองอากาศผ่าน High
  Efficiency Particulate
  Air (HEPA) filter
   มีหลอดไฟ UV สาหรับฆ่าเชื้อ
http://en.wikipedia.org/wiki/Image:UV-ontsmetting_laminaire-vloeikast.JPG
http://www.globalrph.com/images/verticalhood.jpg
http://www.globalrph.com/images/horizontalhood.jpg
Class II Biohazard Cabinet
         สาหรับงานที่เกี่ยวข้องกับสิ่ง
          อันตราย เช่น สาร
          กัมมันตภาพรังสี สารก่อมะเร็ง
          สารมีพิษ
         การเพาะเลี้ยงเซลล์เพื่อผลิตไวรัส

         การเลี้ยงเซลล์ของไพรเมต
          (รวมทั้ง human cells)
2. CO2 Incubator
   เซลล์ต้องการสภาวะที่มี CO2
    ประมาณ 5%
   สาหรับภาชนะเพาะเลี้ยงที่ปิดสนิท
    สามารถเติม CO2 แล้วปิดฝา แล้ว
    incubate ใน dry incubator หรือ
    hot room ได้เลย
   Petri dish และ multi-well plate
    ต้องการบรรยากาศที่มีความชื้นสูง
 สามารถให้ความชื้นได้
  โดยการใส่ถาดบรรจุน้า
  ไว้ใน CO2 incubator
 ใส่ยาฆ่าเชื้อแบคทีเรีย
  และเชื้อราในน้าด้วย และ
  ต้องคอยตรวจสอบอย่า
  ให้น้าแห้ง
3. Aspiration Pump
                    เป็นวิธีที่สะดวกมากในการ
                     กาจัดของเหลวที่ไม่ต้องการ
                    ต้องมีการเปลี่ยน sterile
                     pipette ทุกครั้ง
                    ในขวดเก็บน้าทิ้งต้องเติม
                     สารฆ่าเชื้อ เช่น
                     gluteraldehyde หรือ
                     hyperchlorite
  Freshney, 1994
Freshney, 2005
               4. ภาชนะเพาะเลี้ยง
 เซลล์ส่วนใหญ่ต้องมีพื้นผิวให้ยึดเกาะและแผ่ตัวออกจึงจะ
  สามารถเติบโตและเพิ่มจานวนได้ ยกเว้นเซลล์ของระบบ
  เลือด และเซลล์มะเร็งบางชนิด
 การที่เซลล์ไม่สามารถแผ่ตัวออกได้อาจเนื่องมาจากการยึด
              ี
  เกาะได้ไม่ดหรืออาจเนื่องมาจากเซลล์มีความหนาแน่น
  มากเกินไป
 พื้นผิวเพาะเลี้ยงต้องเหมาะแก่การยึดเกาะ (adhesion)
                     ภาชนะแก้ว
                  ผิวแก้วมีประจุ ทาให้เซลล์ยึดเกาะได้ดี
                  สามารถล้างและใช้ซ้าได้โดยไม่สูญเสีย
                   คุณสมบัติในการยึดเกาะกับเซลล์
                  ข้อเสีย: น้าหนักมาก แตกง่าย

                  การทาความสะอาดด้วยด่างแก่ เช่น NaOH
                   ทาให้พื้นผิวไม่เหมาะแก่การเพาะเลี้ยงเซลล์
                   ต้องทาการ neutralize ด้วย acid wash
Freshney, 1994
               Disposable Plastics
 Polystyrene flasks แบบใช้ครั้งเดียว
  สะดวก และผลการทดลองน่าเชื่อถือ
  เพราะพื้นผิวเพาะเลี้ยงเหมือนเดิม
  (reproducible)
 Polystyrene มีคุณสมบัติ hydrophobic ไม่เหมาะสาหรับ
  การยึดเกาะของเซลล์
 g-irradiation หรือ chemical treatment
Disposable Plastics
    มีหลายขนาด หลายสี ให้เลือก (T-25, T-
     75, T-125)
    Sterile มาแล้ว ไม่ควรใช้ซ้า
    การล้างด้วย detergent ทาให้พื้นผิว
     เปลี่ยนคุณสมบัติการยึดเกาะไป
                              ั
    คุณภาพแตกต่าง ขึ้นอยู่กบผู้ผลิต
    วัสดุอื่น: polyvinylchloride (PVC),
     polycarbonate, melinex, thermanox
     (TPX) เป็นต้น
Petri dish & Multi-well Plates
                    มีหลายขนาดให้เลือก
                     เช่น 35-mm, 100-
                     mm, 6-well, 12-well,
                     24-well, 96-well
                    ข้อเสีย: ไม่ปิดสนิท
                     media ระเหยง่าย
                     และ contamination
                     ง่าย
            5. Media & Supplements
 อาหารของเซลล์ในธรรมชาติคือสิ่งที่อยู่
  ในกระแสเลือด
 อาหารเพาะเลี้ยงยุคแรกๆ: embryo extract,
  lymph, protein hydrolysate, etc.
 ปัจจุบันพยายามผสมอาหารขึ้นมาจากสิ่งที่
  พบว่าจาเป็นต่อเซลล์เพื่อเพิ่มความคงที่เชิง
  คุณภาพ (qualitative consistency)
       Chemically Defined Media
 Eagle’s BME, Eagle’s MEM
 Dulbecco’s Modification of Eagle’s MEM
  (DMEM)
 CMRL 1066
 RPMI 1640
 Ham’s F10, Ham’s F12
 Etc.
         ส่วนประกอบทั่วไปของ Media
 Essential amino acids (tryptophan, methionine, valine,
  threonine, phenylalanine, leucine, isoleucine, lysine) +
  tyrosine & cysteine
 Vitamins
 Salts
 Glucose
 Organic supplements: pyruvate, citric acid cycle
  intermediates, proteins, peptides, nucleotides, nucleosides,
  lipids
                  pH of the Media
 เซลล์ส่วนใหญ่เจริญได้ดีที่ pH 7.4
 Fibroblasts เจริญได้ดีที่ pH 7.4-7.7
 เซลล์มะเร็งเจริญได้ดีที่ pH 7.0-7.4
 Epidermal cells สามารถเลี้ยงที่ pH 5.5 ได้
 Phenol Red: สีแดงที่ pH 7.4, สีส้มที่ pH 7.0, สีเหลืองที่
  pH 6.5, สีเหลืองมะนาวที่ pH ต่ากว่า 6.5, สีแดงอมม่วงที่
  pH 7.6, และสีม่วงที่ pH มากกว่า 7.8
        Buffering Capacity of Media
 ในอาหารเพาะเลี้ยงเซลล์ต้องมีระบบรักษา pH ให้
  เปลี่ยนแปลงน้อยที่สุด
 ที่พบในสูตรอาหารหลายชนิด เช่น bicarbonate buffer
  และ HEPES
 HEPES เป็น buffer ที่ดีกว่าสาหรับช่วง pH 7.2-7.6
 นิยมใช้ควบคู่กัน: เช่น 20 mM HEPES, 10 mM
  bicarbonate
                        Serum
 มีองค์ประกอบที่เป็น growth factors, adhesion factors,
  และ antitrypsin activity
 ใช้เพื่อเพิ่มสารบางอย่าง (undefined) ที่ไม่มีในสูตรอาหาร
  เช่น minerals, lipids, hormones
 ที่นิยมใช้กันได้แก่ fetal calf serum, bovine serum,
  horse serum, และ human serum
 เซลล์บางชนิด (เช่น HeLa และ L929) เจริญได้ใน
  serum-free media
            Serum Substitutes
 หลายๆ บริษัทผลิตสารทดแทน serum ขึ้นมาเพื่อเพิ่ม
  reproducibility และ ลดความเสี่ยงจากการปนเปื้อน
 SerXtend (NEN)

 Ventrex (Ventrex Laboratories, Ltd.)

 Nutricyte (Brooks Laboratories)

 Nu-serum (Collaborative Research)

 CLEX (Dextran Products, Ltd.)
           Other Supplements
 ยาปฏิชีวนะ (เช่น Penicillin, Streptomycin,
  Gentamycin sulphate, Amphotericin B)
 Embryo extract

 Conditioned medium
การทาให้ Media ปลอดเชื้อ
   ไม่สามารถ autoclave ได้เพราะว่ามี
    ส่วนประกอบของอาหารหลายอย่างไม่
    ทนต่อความร้อน
   ต้องใช้การกรองผ่าน 0.22 mm
    membrane
ทิ้งท้าย...
                        วินัยชาวพุทธ
   หมวดหนึ่ง: วางฐานชีวิตให้มั่น
     กฏ ๑  เว้นชั่ว ๑๔ ประการ
     เตรียมทุนชีวิต ๒ ด้าน

     รักษาความสัมพันธ์ ๖ ทิศ

   หมวดสอง: นาชีวิตให้ถึงจุดหมาย
                  ้
     จุดหมาย ๓ ขัน

     จุดหมาย ๓ ด้าน


                                       พระพรหมคุณาภรณ์ (ป.อ. ปยุต.โต): ธรรมนูญชีวิต
                              ทิศ ๖
   คือบุคคลประเภทต่างๆ ที่เราต้องเกี่ยวข้อง สัมพันธ์ทางสังคม ดุจทิศ
    ทั้งหลายที่อยู่รอบตัวเรา: ทิศเบื้องหน้า, ทิศเบื้องขวา, ทิศเบื้องหลัง,
    ทิศเบื้องซ้าย, ทิศเบื้องล่าง, ทิศเบื้องบน
   บิดา มารดา
   ครู อาจารย์
   ภรรยา และบุตร
   มิตร สหาย
                            ั
    คนรับใช้ คนงาน ผู้ใต้บงคับบัญชา
   พระสงฆ์
                                                       ประดู่ลาย: พุทธรรมสาหรับชาวบ้าน
                           ทิศเบื้องหน้า
   คือบิดามารดา ผู้มีอุปการคุณ โดยการให้กาเนิด เลี้ยงดู รักใคร่
    เราควรตอบแทนคุณท่าน ดังนี้
     ท่านเลี้ยงเรามาแล้ว เราต้องเลี้ยงท่านตอบ

     ช่วยทาการงานของท่าน

     ดารงวงศ์สกุล

     ประพฤติตนให้เป็นผู้สมควรรับทรัพย์ มรดก

     เมื่อท่านล่วงลับไปแล้วทาบุญอุทิศให้ท่าน



                                                    ประดู่ลาย: พุทธรรมสาหรับชาวบ้าน
                    หนังสือแนะนา
           ิ
  ธรรมนูญชีวต โดย พระพรหมคุณาภรณ์ (ป.อ. ปยุตโต)
                                             .

 พุทธธรรมสาหรับชาวบ้าน โดย ประดู่ลาย




            ขอให้ศิษย์ทุกคนประสบแต่สิ่งดีๆ ในชีวิต...

								
To top