DIAGNOSTICA COLLATERALE IN MEDICINA INTERNA

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DIAGNOSTICA COLLATERALE IN MEDICINA INTERNA Powered By Docstoc
					DIAGNOSTICA COLLATERALE IN MEDICINA INTERNA VETERINARIA



Obiettivi formativi
L’attività dei dottorandi sarà organizzata secondo percorsi formativi in tutti i settori della diagnostica clinica di
laboratorio ed in particolare sull’acquisizione delle conoscenze di base e delle tecniche analitiche di chimica clinica,
enzimologia, ematologia, elettroforesi, coagulazione, citologia e dosaggi immunoenzimatici. Al termine del percorso
formativo il dottorando otterrà qualifiche specifiche secondo le procedure di qualità poste in essere presso il
Laboratorio del Dipartimento Clinico.
Contestualmente alle tecniche analitiche, il dottorando acquisirà le nozioni di Controllo di Qualità nonché gestione
organizzativa e flusso informativo del laboratorio clinico.
In tutti i casi il percorso formativo prevede una prima fase teorica, seguita da una successiva fase operativa in
affiancamento al personale qualificato del laboratorio, nonché una fase finale di operatività autonoma.
A completamento della formazione dei dottorandi si provvederà a fornire le nozioni teoriche e pratiche di statistica
biomedica. In particolare il dottorando sarà chiamato ad elaborare programmi di validazione dei test diagnostici ed a
misurarne le performance nella routine laboratoristica.
A fianco di queste attività, comuni a tutti i dottorandi, si provvederà ad affidare progetti di ricerca in cui la diagnostica
collaterale è impiegata in ambito clinico per lo studio fisiopatologico dei processi biologici degli animali domestici. In
particolare l’attività di ricerca si articola sui seguenti temi:
1. oncologia clinica: messa a punto e valutazione dei marker di angiogenesi con particolare riferimento a VEGF nelle
malattie linfoproliferative del cane. I dettagli dell’attività del dottorando sono riportati di seguito
L’obiettivo della ricerca è di indagare il ruolo della neoangiogenesi nelle neoplasie emolinfopoietiche della specie canina
ed in particolare nel linfoma, neoplasia dei tessuti ematopoietici più frequente dei mammiferi domestici.
Nel corso del 1° anno di Dottorato sarà valutata la concentrazione sierica di VEGF in soggetti sani ed affetti da linfoma.
L’indagine sarà condotta sui cani affetti da linfoma che si presenteranno presso le strutture del Dipartimento. In tali
soggetti si provvederà all’effettuazione delle routinarie indagini diagnostiche e di stadiazione clinica. La diagnosi sarà
effettuata, in ogni caso, mediante valutazione citologica e/o istologica. Il siero ed il plasma, deprivato di piastrine,
saranno raccolti e conservati a -30°C fino all’indagine. La misurazione delle concentrazioni sieriche e/o plasmatiche di
VEGF sarà effettuata mediante metodica quantitativa ELISA (Quantikine, R&D Systems) precedentemente validato
nella specie canina. Di ogni prelievo sarà contestualmente misurata e registrata la conta piastinica.
I dati saranno raggruppati secondo quattro tipologie: soggetti affetti da linfoma, soggetti affetti da linfoma in
remissione completa dopo chemioterapia, soggetti in remissione parziale o malattia stabile o malattia in progressione
durante chemioterapia ed infine soggetti in recidiva dopo remissione completa. L’analisi statistica sarà condotta
mediante ONE-WAY ANOVA per dati ripetuti onde verificare la significatività prognostica delle concentrazioni sieriche di
VEGF. I dati saranno inoltre correlati con la stadiazione clinica WHO mediante analisi X2.
Nel 2° anno di dottorato sarà valutata l’espressione di enzimi gelatinolitici come MMP-2 e MMP-9.
Le valutazioni saranno effettuate per campionamento bioptico o escissione chirurgica dei linfonodi di cani affetti da
linfoma. Una quota sarà fissata in una soluzione al 10% di formalina di Carson, un altra quota sarà congelata in azoto
liquido alla temperatura di –80 °C.
Sul tessuto fissato in formalina si eseguiranno le routinarie valutazioni istologiche.
Il tessuto sarà omogeneizzato con un omogeneizzatore meccanico in una soluzione Tris tamponata a pH 8 e
contenente uno 0,25% di Triton X-100. L’omogeneizzato così ottenuto sarà centrifugato per 10 minuti a 1500g a 4° C
e stoccato a –80°C.
I campioni ottenuti saranno analizzati con una metodica di zimografia su gel (Novex 10% Zymogram Gelatin gel) per
determinare l’attività enzimatica delle MMP-2 e MMP-9.
Sui campioni istologici verrà anche valutato il livello di apoptosi con il metodo TUNEL.
Nel 3° anno di dottorato l’interesse della ricerca sarà quello di valutare sotto l’aspetto terapeutico, l’azione di alcuni
farmaci/principi antiangiogenetici. In particolare si prenderà in considerazione l’utilizzo di sostanze inibitrici della
proliferazione delle cellule endoteliali come la Talidomide (inibizione del VEGF, FGF, TNF) e i regolatori delle MMP come
la epigallocallicreina-3 gallato (EGC-3G), sostanza contenuta nel the verde.

2. oncologia clinica: messa a punto ed applicazione clinica delle tecniche di amplificazione genica mediante PCR per la
valutazione diagnostica e prognostica di marker molecolari delle malattie linfoproliferative del cane e del gatto. I
dettagli dell’attività del dottorando sono riportati di seguito
L’obiettivo della ricerca è quello di mettere a punto un test molecolare (PCR) che possa coadiuvare la semplice
valutazione morfologica su campioni citologici nella diagnosi di linfoma nel cane e nel gatto. La messa a punto di un
test molecolare per la diagnosi di linfoma necessita di adattare il test al prelievo citologico di materiale biologico poichè
la biopsia linfonodale rappresenta una procedura più invasiva e più indaginosa.
La PCR, rappresenta inoltre un test versatile e poco costoso che potrebbe essere utilizzato per la determinazione
dell’immunofenotipo di una popolazione linfocitaria senza ricorrere all’utilizzo di anticorpi monoclonali.
Un ulteriore utilizzo del test molecolare è quello di rilevare la clonalità della popolazione linfocitaria nel caso in cui la
diagnosi di neoplasia presenti delle difficoltà di interpretazione.
Un ultimo punto è quello della ricerca di marker tumorali al fine di valutare la malattia residua minima, (minimal
residual desease) come parametro oggettivo di risposta alla terapia associato alla valutazione clinica della remissione
della sintomatologia.
Nel corso del primo anno di Dottorato verranno esaminati campioni citologici linfonodali, strisci ematici e midollari di
cani e gatti affetti da patologie linfoproliferative. Il materiale biologico verrà conservato congelato a -20° o a
temperatura ambiente, per poter eseguire successivamente un confronto. Da tali matrici si estrarrà il DNA mediante
Kit commerciale (Perfect Blood gDNA, Mini Isolation Kit, Eppendorf, Milano). La qualità e la quantità del DNA così
estratto verranno valutate tramite lettura spettrofotometrica (Spettrofotometro Beckmann Du 530) e mediante gel di
agarosio. Il DNA genomico verrà amplificato tramite PCR su thermal cycler (MJ Research Minicycler), le reazioni di
amplificazione dovranno essere ottimizzate nel corso della messa a punto del metodo. I primer che verranno utilizzati
sono già stati identificati nei cloni DNAc VH e validati (GenBank ).
Nel corso del secondo anno accanto all’utilizzo dei primer già validati si tenterà l’approccio con geni candidati per
ampliare la ricerca dei marker di clonalità nei campioni biologici.
Nel corso del terzo anno di Dottorato si confronteranno le metodiche immunoistochimiche e immunocitochimiche per
l’immunofenotipizzazione mediante l’utilizzo di anticorpi monoclonali (Polyclonal antihuman Pan T-cell e )con le
metodiche di genetica molecolare da Polyclonal antihuman Pan B-cell Dako noi precedentemente messe a punto.
3. nefrologia veterinaria: messa a punto ed applicazione clinica della misurazione dell’emoglobina carbamilata per la
diagnosi di insufficienza renale acuta e cronica nel cane. I dettagli dell’attività del dottorando sono riportati di seguito
L’obiettivo della ricerca è di mettere a punto una metodica per la determinazione della carbamil emoglobina canina
nella specie canina, con lo scopo di poter differenziare pazienti affetti...

				
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posted:12/16/2011
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