Ensayos para Citotoxicidad by oUsDWTj

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									          Ensayos para Citotoxicidad




http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/research/cytotech/apopto/data/malorni/mal17b.jpg
                INMUNIDAD MEDIADA POR CÉLULAS:
                     Detectar y Eliminar células
INFECTADAS con patógenos intracelulares (virus, bacterias)
PROPIAS ALTERADAS: Tumorales

                      CÉLULAS
                      EFECTORAS
  Células Antígeno no específicas:        Células Antígeno específicas:
  – Células Natural Killer (NK)           – Linfocitos específicas:
                                    Células Antígeno T citotóxicos (CTLs)
                                    –
  – Células no linfoides (macrófagos, Linfocitos T citotóxicos (CTLs)
  neutrófilos y eosinófilos)

                                                       Secreción Citocinas

                         Linfocito T
  Linfocito T
                         EFECTOR T
                            Linfocito
  virgen
                            efector                     Actividad citoquinas
                                                      Secreción decitotóxica
       ¿ Cómo muere una célula ?
• por NECROSIS                      • por APOPTOSIS
=> causas externas:                 => causas “internas”
        Injuria física o química    desencadenan mecanismos mortales
                                                  x instrucción
•   envenenamiento
                                                  x negligencia
•   anoxia
                                    * exposición de fosfatidil-serina
•   algunos virus líticos
                                    * activación de caspasas
•   ataque por Complemento
                                    * degradación regular del DNA
•   cambia permeabilidad de
                                      nuclear (ladder) x endonucleasas
    membrana: liberación Ca2+
                                    * condensación nuclear
•   activación de fosfolipasas
                                    * eliminación por fagocitosis
•   degradación irregular del DNA
                                    * sin liberación de productos
•   desencadena inflamación
                                      intracelulares
•   quedan restos celulares que
                                    * SIN inflamación
    se eliminan por fagocitosis
Criterios de uso de tests de toxicidad
   1- Disminución del metabolismo “basal”: injuria temprana
                    medir niveles de ATP
                    medir actividad mitocondrial
   2- Pérdida de Integridad de la membrana: injuria grave
                    medir enzimas liberadas
                    medir exclusión de colorantes:
                             fluorescentes: ethidiumDI
                                              Ioduro de Propidio
                             ópticos: Azul Tripán (V=neg)
                                      Eosina (V=+)
   3- Pérdida de células: muertas se despegan del sustrato
                    medir número x recuento celular
                    medir DNA,
                    medir Proteinas Totales
DETECCION DE CELULAS MUERTAS
           ENZIMAS liberadas:

Cuantificación: por ensayos colorimétricos,
       luminiscentes y fluorescentes

        Lactato deshidrogenasa (LDH)
   LACTATO                  PIRUVATO
        NAD+              NADH
   Tetrazolio           Formazán   DO490
              diaforasa
DETECCION DE CELULAS MUERTAS
        ENZIMAS liberadas:
 Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
                        Las células vivas pueden
                        reducir fácilmente la
                        resazurina ( compuesto no
                        tóxico ),y el aumento de
                        fluorescencia ROJA
                        resultante se puede medir
                        con un lector de placas o un
                        fluorómetro.

                        Las células no viables no
                        tienen esta capacidad
                        metabólica , y no reducirán
                        el colorante. Por lo tanto la
                        intensidad de fluorescencia
                        observada es una verdadera
                        medida de las células
                        viables.
               ENZIMAS liberadas:

           Adenilato kinasa (AK)
ADP                                 ATP
luciferin + ATP → luciferyl adenylate + PPi
luciferyl adenylate + O2 → oxyluciferin + ADP + luz
                 RESUMEN
     Ensayos de Viabilidad/ Citotoxicidad




Biotium ®                                   8
    Estudios de la función efectora citotóxica




                      Célula presentadora de
Población
                         antígenos con el
de
                       antígeno de interes o
Linfocitos T
                             infectada
                                               Células Blanco (target)
     Expansión de células efectoras            (presentan el antígeno
         antígeno específicas                  de interés)
               (5-7 días)




                                      Se marcan con 51Cr ó un
                                      colorante (P. ej: Rojo neutro)
              Estudios de la función efectora citotóxica



                              Se incuban las células efectoras y las
                              células blanco (diferentes relaciones
                              Cs efectoras: Cs blanco)
                              4 – 8 Hs




    Sobrenadantes
                                         - Lisis espontánea (Basal)
Se mide:
                                         (células blanco sin células
- CPM (en el caso de el ensayo
radiométrico)                            efectoras)
- Absorbancia (en el caso del ensayo     - Lisis total (Máximo del ensayo)
colorimétrico)                           - Lisis de la muestra
- actividad enzimática (Lactato
deshidrogenasa)
        Mecanismos de activación
Citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC)
                Citotoxicidad independiente de anticuerpo
                         Modelo del doble receptor




RA: Receptor activador
RI: Receptor inhibidor
     Estudios de la respuesta inmune innata:
                     Citotoxicidad NK



Marcado de células      Agregado de células     Muerte de las células
 “target”con 51Cr              NK             target, liberacion de 51Cr
          Cáculo del Porcentaje de Marca
             liberada al sobrenadante

   % liberación 51Cr = 100 x [(cpm experimental - cpm espontánea)
            / (cpm liberación máxima - cpm espontánea)].



cpm experimental: liberación debida a la lisis mediada por la célula efectora.
cpm espontánea: marca que escapa de la célula (leaking) en ausencia de ataque
cpm máxima: control positivo de 100% de lisis, ocasionada por detergente, etc.



    SIEMPRE probar al menos 3 relaciones efector: target, para obtener una
    curva de respuesta al ataque citotóxico.
Ejemplo de ensayo de liberación de Cromo*




www.cancerimmunity.org/v3p13/030913_fig2.gif
 Recognition of the SW 872 sarcoma cell line by the SSX-241-49-specific clone
  D2.5. Recognition was assessed in a chromium release assay in the absence
 (closed circles) or in the presence (open circles) of exogenously added peptide
 SSX-241-49 (1 µM) at the indicated effector to target cell ratio. Melanoma lines

              T567A and T465A were used as control target cells.
Uso del Ioduro de Propidio en
   ensayos de viabilidad




                      Anexina V- FITC


             www.merckbiosciences.co.uk/sharedimages
               Viabilidad en Bacterias
Figure 15.11 Quantitative flow cytometric analysis of Escherichia coli viability using the SYTOX
Green nucleic acid stain (S7020). A bacterial suspension containing an equal number of live and
isopropyl alcohol–killed E. coli was stained with SYTOX Green and analyzed using excitation at
488 nm. A bivariate frequency distribution for forward light scatter versus log fluorescence
intensity (collected with a 510 nm longpass optical filter) shows two clearly distinct populations.
When live and dead bacteria were mixed in varying proportions, a linear relationship between the
population numbers and the actual percentage of live cells in the sample was obtained (see inset).

								
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