IL POTERE RISOLUTIVO DEL MICROSCOPIO by HC111214193049

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									                   IL POTERE RISOLUTIVO DEL MICROSCOPIO
                          ANALISI E MIGLIORAMENTO
                                        di Alessandro Bertoglio



Soprattutto se ci si occupa di diatomee, con le loro strutture finissime, si è sempre in cerca di un
qualche miglioramento del proprio sistema ottico in modo tale da permettere una visione più
precisa, nitida e particolareggiata di quello che si ha sotto le lenti. D’altra parte le stesse leggi
fisiche pongono dei limiti invalicabili al potere risolutore di un qualsiasi sistema ottico; dunque se
da una parte è sicuramente impossibile cercare di superare tali barriere, si può sempre tentare di
ottimizzare il proprio sistema e magari volgere a nostro favore le leggi fisiche che governano la
formazione dell’immagine ed il potere risolvente.
Per cercare di trovare delle “scappatoie” e magari farci amiche le leggi fisiche è necessario
conoscerle e ragionarci un po’ sopra.
Da cosa è determinato il potere risolutivo di un microscopio?

Chiunque si interessi di questo strumento potrà citare la formula universalmente riconosciuta:


                                       λ           λ
                                   −−−−−− ≥ d ≥ −−−−−−
                                   n sin u      2n sin u

laddove “λ” rappresenta la lunghezza d’onda della luce utilizzata che è di 0.546 micron se si usa
luce monocromatica verde, lunghezza d’onda alla quale l’occhio umano è molto sensibile;

“d” è il potere risolutivo del microscopio espresso in micron;

“n sin u” rappresenta una quantità chiamata apertura numerica dell’obiettivo utilizzato ed è sempre
segnalata sul barilotto delle nostre ottiche;

Quest’ultima quantità dipende ancora da:

 “n”, ovvero l’indice di rifrazione del mezzo interposto tra il coprioggetti e la lente frontale
dell’ottica e vale 1 se si tratta di aria o all’incirca 1.5 se si tratta di olio per immersione;

e da “u”, ovvero il semiangolo, espresso in gradi, del più ampio cono di luce, con vertice
sull’oggetto osservato, che può ancora entrare nell’obiettivo e contribuire a formare l’immagine.

Questa formula, poi, esprime anche un notevole grado di variabilità del potere risolutivo in quanto
con un piccolissimo ragionamento matematico si può capire che detto potere può essere pari ad una
certa quantità o essere migliore di questa sino al doppio. In altre parole, usando una luce verde
monocromatica (λ = 0.546 micron), ed un’ottica con apertura numerica di 1.25, cioè quella dei più
comuni obiettivi ad immersione, ovvero la quantità “n sin u”, il potere risolutivo potrà variare da
0.44, nel peggiore dei casi, a 0.22, sua esatta metà, nella migliore situazione. Tutto ciò è da
imputarsi al numero “2” usato nel caso migliore per raddoppiare di fatto l’effetto dell’apertura
numerica dell’ottica “n sin u”.
La domanda che allora sorge spontanea è la seguente: perché questa variabilità del potere risolutivo
tra una quantità e la metà di questa?
La soluzione va cercata nel tipo di luce che illumina il preparato.
Se i raggi di luce che raggiungono il preparato sono tutti perfettamente paralleli, si è dimostrato che
il potere risolutore dell’obiettivo è circa la metà del massimo espresso dalla formula, ovvero il
moltiplicatore che può raggiungere il fatidico “2” è pari o molto vicino ad 1.
In questo caso il potere risolvente sarà piuttosto scarso mentre si è dimostrato parimenti che il
contrasto delle parti ancora risolte dell’oggetto è massimo e che questo contrasto cade molto
rapidamente a zero quando si sta osservando qualche particolare al di sotto del potere risolutore
calcolato per questo caso limite. In altre parole, avremo immagini molto contrastate ma scarse in
risoluzione.
Detta così, questa cosa sembra piuttosto astratta ma in effetti la sperimentiamo spesso con il nostro
microscopio. Quando chiudiamo moltissimo il diaframma di apertura del nostro condensatore,
accade che noi forniamo all’oggetto sotto osservazione un cono di luce focalizzato su di esso di
dimensioni angolari assai ridotte e ci avviciniamo abbastanza al caso limite dei raggi di luce
perfettamente paralleli, ovvero con cono di angolo zero. Noi tutti abbiamo sperimentato che con il
diaframma molto chiuso il contrasto dell’immagine aumenta parecchio ma parimenti ne risente
pesantemente il potere risolutivo. In altre parole, in queste condizioni pratiche stiamo lavorando al
limite delle condizioni più sfavorevoli espresse dalla formula del potere risolutivo del microscopio,
fornendo ad esso un cono di luce molto stretto anche se non proprio di valore zero.
L’esatto contrario avviene quando apriamo il diaframma del condensatore: le immagini migliorano
rapidamente in risoluzione mentre il contrasto decisamente eccessivo cala sino ad arrivare a valori
piuttosto bassi quando il campo di osservazione sembra riempirsi di luce.
La teoria ha dimostrato che fornendo coni di luce via via maggiori al preparato, il potere risolutivo
migliora sino al doppio ma l’immagine perde gradatamente contrasto o, meglio, solo i particolari
che sono già separabili con il cono di luce di minime dimensioni (vedi il caso peggiore descritto
poco fa), mantengono quasi totalmente il loro contrasto mentre si renderanno visibili particolari più
fini ma questi verranno resi sempre meno contrastati man mano che la separazione di detti
particolari si avvicina alla distanza teorica della formula nel suo caso migliore, ovvero quando il
moltiplicatore si approssima al fatidico numero “2” (pur non raggiungendolo mai nella pratica).
Insomma il potere risolutivo del microscopio dipende anche molto dal tipo di illuminazione.
Ai fini pratici è possibile dire che una illuminazione corretta sta alla base della bontà delle immagini
che possiamo osservare e che detta illuminazione dovrà essere un buon compromesso tra un potere
risolvente elevato ed un contrasto accettabile.

Da cosa ancora dipende il potere risolutivo del microscopio?

Sicuramente dalla correzione delle aberrazioni. Le aberrazioni, soprattutto le principali, ovvero la
cromatica e la sferica, contribuiscono in modo rilevante alla diminuzione del contrasto
dell’immagine. Come abbiamo detto poco fa, lavorando solitamente con condizioni mediane tra il
caso peggiore della formula ed il migliore avremo che i particolari più fini saranno sì visibili ma
con un contrasto inferiore al reale e, quindi già diafani ed elusivi. Se a questa perdita di contrasto
diciamo “fisiologica” si aggiungono le aberrazioni a diminuire ulteriormente la qualità
dell’immagine, i particolari fini perderanno qual poco di contrasto che già possedevano e
diventeranno del tutto invisibili all’occhio. Insomma, un caso eclatante dove le aberrazioni possono
farci perdere in potere risolvente.

Infine il potere risolutivo è condizionato dal contrasto intrinseco dei particolari osservati. Tutti noi
abbiamo sperimentato almeno una volta nella vita il fatto di essere in grado di sdoppiare un paio di
fili della luce di colore scuro piuttosto vicini tra loro ed a notevole distanza da noi se stagliati sul
chiarore del cielo. Sebbene questi due fili spesso distino angolarmente assi meno del normale potere
risolutivo dell’occhio nudo, noi riusciamo ancora scorgerli come entità separate grazie al
grandissimo contrasto tra il loro colore scuro ed il chiarore intenso del cielo. Se gli stessi fili fossero
stati bianchi il nostro occhio non sarebbe stato in grado di mostrare la loro duplicità.
Analogo discorso vale per le immagini al microscopio: una diafana cellula non colorata presenterà
contrasti molto bassi ed in definitiva il potere risolutivo del microscopio ne risentirà notevolmente,
mentre la stessa cellula, colorata intensamente, grazie al contrasto migliorato di molto, renderà
visibili molte più particolari fini.

Ricapitolando, il potere risolutivo del microscopio dipende allora dai seguenti fattori:

    1) “λ”, la lunghezza d’onda della luce che illumina il preparato, ovvero, dimezzando tale
       lunghezza il potere risolutivo raddoppia (regola che viene sfruttata nei microscopi elettronici
       laddove si utilizzano fasci di elettroni di piccolissima lunghezza d’onda). Possiamo sfruttare
       tale effetto illuminando il nostro preparato con luce azzurra o violetta. Facciamo due conti:
       se invece della luce verde di 0.546 micron utilizzassimo luce monocromatica blu violetta
       (lunghezza d’onda pari a circa 0,410 micron) si otterrebbe un vantaggio del 13% e questo
       ammettendo che la luce verde di confronto sia anch’essa perfettamente monocromatica o, in
       altre parole, che alla formazione dell’immagine non contribuiscano lunghezze d’onda ancora
       maggiori, quali il giallo ed il rosso.
       In pratica, si utilizzano filtri blu violetti molto scuri, quali il Kodak Wratten 50 ed alcuni si
       sono fatti costruire apposta filtri interferenziali che lasciano transitare solo fette molto
       ristrette nella zona del blu violetto. Il guadagno tra un’osservazione in luce integrale, dove la
       componente rossa e gialla dello spettro è particolarmente forte utilizzando le lampade ad
       incandescenza dei nostri microscopi, ed una fatta con l’ausilio di un Wratten 50 è piuttosto
       elevato e può raggiungere anche un buon 30% per quello che riguarda il potere risolutivo.
       Provare per credere, stando solo attenti ad utilizzare ottiche corrette per tali lunghezze
       d’onda, di solito obiettivi apocromatici, altrimenti invece di un guadagno si può andare
       incontro ad un disastro.

    2) “n”, il mezzo interposto tra il coprioggetti e la lente frontale dell’obiettivo. Ovvero
       utilizziamo ottiche ad immersione e possibilmente ad immersione in mezzi di alto indice di
       rifrazione. Oggi vengono praticamente prodotti solo obiettivi che possono essere usati con
       l’olio di legno di cedro (indice all’incirca uguale a 1.5) mentre in altre epoche, forse per la
       mancanza di strumenti ad altissima risoluzione, leggasi microscopio elettronico, erano in
       voga ottiche in immersione in fluidi con indice ancora superiore all’olio di cedro, per
       esempio il monobromonaftalene, il cui uso permetteva di raggiungere aperture numeriche
       superiori a 1.40 che è, con pochissime eccezioni, la massima apertura numerica fornita dai
       migliori obiettivi oggi in commercio. Se non vado errato, però, ho visto sul catalogo della
       Olympus un’ottica con una apertura di 1.65, non voglio nemmeno sapere il suo costo,
       sicuramente astronomico, e credo che sia stata progettata per l’utilizzo con il sopraccitato
       monobromonaftalene.

    3) “u”, ovvero il massimo semiangolo utile del cono di luce che l’ottica può ancora raccogliere
       utilmente. Ovvero, usate ottiche con apertura numerica maggiore possibile. Potrà apparire
       lapalissiano ma penso giovi ricordare che un’apertura numerica di 1.40 mostrerà particolari
       più fini di una analoga ottica ad immersione con a.n. pari a 1.25. Di solito, poi, gli obiettivi
       con più alta apertura numerica risultano essere di disegno più raffinato delle loro fratelli
       “poveri” anche se ovviamente costano parecchio di più.

    4) Regolazione della luce che illumina il preparato. Utilizzare un costoso condensatore
       acromatico aplanatico con apertura numerica di 1.40 per illuminare un misero obiettivo da
   20X acromatico, magari utilizzandolo con il diaframma alla massima apertura è un delitto
   che si sconta con il portafogli e con una abbagliamento insopportabile. Parimenti, utilizzare
   un’ottica apocromatica di a.n. 1.40 con un condensatore di Abbe poco o punto corretto è
   come mettere benzina normale in un motore da formula 1. Per ottenere il massimo potere
   risolvente, l’apertura numerica del condensatore è influente quanto quella dell’obiettivo.
   Quindi utilizziamo condensatori corretti e capaci di fornirci gli ampi coni di luce che i nostri
   obiettivi di gran pregio sono in grado di sfruttare. Ricordiamoci che un condensatore, per
   quanto buono possa essere, se non immerso a sua volta non sarà mai in grado di regalarci
   tutta l’apertura numerica di cui è capace. Lo so che è un po’ noioso pulire il condensatore
   alla fine delle osservazioni fatte con gli obiettivi ad immersione ma è necessario se vogliamo
   che le nostre ottiche rendano al massimo. Possiamo anche fare una prova, per esempio
   cercando di separare una diatomea molto stretta, l’Amphipleura pellucida può fare al caso
   nostro, la si può rinvenire sui vetrini test che si trovano oggi in commercio. Ebbene con un
   buon condensatore immerso ed un buon obiettivo saremo in grado di separare le strette strie,
   altrimenti la cosa si farà molto ma molto ardua.
   Infine, è buona norma cercare di capire se sul fascio ottico del nostri sistema di
   illuminazione è posto un filtro parzialmente o totalmente smerigliato. La funzione di questo
   accessorio è contraddittoria: da una parte rende più uniforme la luce e serve egregiamente
   quando desideriamo ottenere immagini esteticamente ineccepibili, da un altro lato, rende il
   fascio di luce molto incoerente (è un po’ come se aprissimo molto il diaframma del
   condensatore), forse il potere puramente teorico del microscopio può aumentare di un
   pochino ma il contrasto si va a far benedire ed ala fine il risultato ottenuto è un diminuzione
   del potere risolvente pratico. Sul mio nuovo microscopio è montato un filtro parzialmente
   smerigliato, ebbene, pur usando ora ottiche apocromatiche da 1.40 di marche
   all’avanguardia non riesco ad ottenere la risoluzione che avevo con il vecchio microscopio
   ed ottiche russe pur molto buone ma sicuramente inferiori alle attuali. La colpa è del
   malefico filtro semismerigliato che mi fa calare il contrasto ed, in definitiva, il potere
   risolvente.

5) la correzione delle aberrazioni. Mi pare palese. Un’ottica scadente non raggiungerà mai le
   performance di una di ottima qualità anche se sul barilotto e segnalata la medesima apertura
   numerica. Acquistare un planapo di gran marca nuovo oggi è fuori discussione, costa quasi
   come un’automobile ma sul mercato dell’usato si possono rinvenire ottiche supercorrette del
   medesimo tipo con aperture numeriche di 1.40 a prezzi di poco superiori al milione di
   vecchie lire. Fate un salto sul sito di eBay o rivolgetevi a qualche noto fornitore nazionale di
   ottiche e microscopi di seconda mano, potreste anche voi diventare possessori di un’ottica
   dalle prestazioni pari ad una Ferrari senza firmare cambiali per una vita.

6) il contrasto dell’oggetto sotto osservazione. Provate ad osservare una diatomea montata in
   balsamo del Canada ed un’altra montata in Naphrax e poi ditemi qualche cosa… Il contrasto
   che potete ottenere è tale da aumentare di oltre un buon 30% il potere risolvente del vostro
   microscopio e non dico altro.



Concludendo e riferendomi alle diatomee che sono il campo che maggiormente mi interessa,
posso affermare che con un filtro blu scuro, un’ottica ben corretta, un’apertura numerica elevata,
l’immersione del condensatore anch’esso ben corretto e regolato e, ultimo solo per citazione,
l’uso di un montante studiato apposta per rinvigorire il contrasto di queste bellissime alghe,
quale il naphrax o lo ZRAX, posso ottenere poteri separatori doppi di quelli che avrei se non
badassi a tutti questi accorgimenti. Non è poco, tenendo anche conto che non ho speso una
fortuna. Oggi riesco ad osservare i punti che compongono le strie alveolate di alcune Pinnularie
che, come da misure al microscopio elettronico, distano tra loro non più di 0.17 micron ovvero
praticamente il limite invalicabile che Madre Natura ha imposto alle potenzialità del
microscopio ottico.

								
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