lab.
Aspectos a tener en cuenta en el análisis de
residuos de plaguicidas en vegetales por
LC/MS/MS
F. Mocholí
Seminarios ABI, Noviembre 2007
Tiempos Pasados
lab.
Costosa preparación de la muestra para conseguir extractos
muy limpios
Evitar contaminación cromatográfica
Mantener el sistema inerte
Maximizar sensibilidad y obtener la máxima selectividad
Pobre selectividad/sensibilidad en HPLC (tecnología de
columnas, detector UV detector, Derivatizar y detector de
Fluorescencia)
Difícil confirmación (mala selectividad en HPLC)
Se han llevado a cabo diferentes estrategias para conseguir
mejoras
2
Tiempos pasados
lab.
Smash the vegetable
sample (50g)
+60ml EtOAc + 13g Na2SO4
Homogeneize (20sec)
Filter
+60ml EtOAc + 13g Na2SO4
Homogeneize (20sec)
Evaporate
SPE/GPC
Evaporate
Reconstitute with 5ml
Cyclohexane
10 fold concentration 3
Tiempos pasados
lab.
Distintas técnicas para
distintos compuestos (UV,
DAD, 2mg/Kg standard
derivatización para
Fluorescencia, etc.)
Pobre selectividad (longitud
de onda, espectro UV)
Baja sensibilidad
Limitado número de
compuestos
Duración de los
cromatogramas
4
GC-LC/MS Polaridad/Peso Molecular
lab.
Ionic
LC/MS Ionspray
Analyte Polarity
GC/MS
Non-Ionic
101 102 103 104
10 105
Molecular Weight
5
Evolución de LC/MS
lab.
Necesidad de confirmación por MS
Número de analitos en aumento
Gran esfuerzo en interfases (sensibilidad, robustez)
Avances en in tecnología de columnas (resolución, tiempo
de análisis), sistemas de HPLC (inyección, volumen muerto,
presión, etc.)
La ionización en LC/MS solo da 1 ion MS/MS
Elección entre tecnologías (Trap, Triple Quad, etc.)
Número de analitos en aumento
Identificación de desconocidos
Número de analitos en aumento
6
Ionización por Electrospray
lab.
7
Ion Spray (ESI)
lab.
8
Ion Spray (ESI)
lab.
9
Ion Spray (ESI)
lab.
10
Ion Spray (ESI)
lab.
11
Fuentes de ionización para ESI
lab.
Electrospray
hasta 1 ml/min
Dependiente de la Concentración
Ionspray (Electrospray asistido neumáticamente)
Flujos de líquido 5-200 ul/min
Mejor sensibilidad que electrospray en este intervalo de flujos
Dependiente de la Concentración
TurboIonSpray (Ionspray con gas de secado caliente)
Flujos de líquido 5-1000 ul/min
Mejor sensibilidad que ionspray en este intervalo de flujos
Dependiente de la Concentración
Fuente Turbo V (TurboIonspray con doble calefactor y dinámica de los gases)
Flujos de líquido 5-2000 ul/min
Mejor sensibilidad que turboionspray en este intervalo de flujos
Comportamiento dependiente de la masa en algunos intervalos de flujos
Estrategias para mejorar la robustez
lab.
Problema: Baja tolerancia o intolerancia a sustancias poco
volátiles
Solución: Hacer que los iones describan un camino má o menos
tortuoso (Balance entre sensibilidad y robustez)
Off axis Pepperpot Orthogonal
Crossflow LCZ aQa
13
Estrategias para mejorar la robustez
lab.
OSA
Angle
N2
N2
TurboIonSpray® Turbo V source®
14
ESI: Mecanismo supresión iónica
lab.
Supresión Iónica Reducción señal Analito
Pares iónicos
Evite reactivos que puedan formar pares iónicos fuertes con los iones
deseados y puedan neutralizar los iones en disolución. (Se reduce la
evaporación de los iones)
Efectos competitivos durante la evaporación de los iones
Alta concentración de iones de carga similar en la matriz, tampones, etc.
compiten en el proceso de evaporación iónica en las microgotas.
15
Supresión señal iónica
lab.
Menos señal a mayor
concentración del tampón
16
Comparación matrices Vegetales full scan
lab.
Lechuga
Naranja
Uva
17
Efecto Matriz
lab.
Columna 5 cm Columna 15 cm
Lechuga 0.010mg/Kg
Uva 0.010 mg/Kg
18
MS/MS
lab.
Fuente Q1 Q2 Q3
Ioniz.
SIS
CID
FULL SCAN
Fuente
Ioniz.
19
¿Qué “Dwell time” debo utilizar?
1 transición MRM (1 compuesto)
lab.
X Como media, se requieren 15 puntos (o al
XX menos 10) para integrar con precisión un
pico cromatográfico
X X
(Anchura del pico)/(número de puntos)=
X X 30/15 = 2 segundos
Se necesita 1 punto cada 2 segundos
X X (2000 ms)
X X
X X
X X
30 segundos
20
¿Qué “Dwell time” debo utilizar?
2 transiciones MRM (1 compuesto Cuant y Cual)
lab.
Si “dwell time” permanece constante;
X el tiempo para cada compuesto es
X 2000 ms: 2000 ms
+ 2000 ms
-----------
X
X 2 compuestos: 4000 ms
X 30 segundos / 4000 ms
X
X X = 7.5 puntos sólo!
X
X X
X XXX
X
XXXXXXXX X X X X X X X XX
30 segundos 21
¿Cómo determinar el máximo número de MRMs
que se pueden monitorizar simultáneamente?
lab.
Anchura de pico 30 s
“Dwell time” constante
=> El número de puntos para definir el pico cae rápidamente
Time MRM Puntos
2000 1 15
2000 2 7
2000 3 5
Número de puntos por pico constante
=> “Dwell time” debe disnimuir!
Dwell time (ms) MRM Puntos 3DTrap QqQ
2000 1 15 Sí Sí
1000 2 15 Sí Sí
667 3 15 Sí Sí
200 10 15 Sí/No Sí
100 20 15 No Sí
10 200 15 No Sí 22
¿Cómo determinar el máximo número de MRMs
que se pueden monitorizar simultáneamente?
lab.
Anchura de pico 10 s
Para 10 puntos por pico cromatográfico
=> “Dwell time” debe disminuir!
Dwell time (ms) MRM Data points 3DTrap QqQ
1000 1 10 Sí Sí
500 2 10 Sí Sí
333 3 10 Sí Sí
100 10 10 Sí/No Sï
50 20 10 No Sí
10 100 10 No Sí
5 200 10 No Sí
23
Prueba Columnas LC/MS. Analitos
lab.
Acephate Demeton-S-methyl sulfoxide Imazalil Omethoate
Acetamiprid Dichlorvos Imidacloprid Oxamyl
Aldicarb Diflubenzuron Indoxacarb Picoxystrobin
Aldicarb Sulfone Dimetomorph Linuron Propoxur
Aldicarb Sulfoxid Diuron Lufenuron Pyraclostrobin
Benfuracarb Ethiofencarb sulfone Methamidophos Spiroxamine
Carbendazim Ethiofencarb sulfoxide Methiocarb Tebufenocide
Carbofuran Fenhexamid Methiocarb sulfone Thiametoxam
Carbofuran 3OH Fludioxonil Methiocarb sulfoxide Thicloprid
Carbosulfan Flufenoxuron Methomyl Trifloxystrobin
Clofentezine Hexaflumuron Monocrotophos
Total analytes, 43
24
Columnas Probadas
lab.
Atlantis T-3 (Waters), 100 mm, 2.1 mm, 3mm
Hypersil Gold (Thermo), 100 mm, 2.1 mm, 3mm
Hypersil Gold aQ (Thermo), 100 mm, 2.1 mm, 3mm
QS Strategy 3RP (Interchim), 100 mm, 2.0 mm, 3mm
Polaris C18 A (Varian), 100 mm, 2.0 mm, 3mm
Ascentis RP-Amide (Supelco), 100 mm, 2.1 mm, 3mm
Ascentis Express C18 (Supelco), 100 mm, 2.1 mm, 2.7mm
Sinergy Hydro (Phenomenex), 100 mm, 2.0 mm, 2.5mm
Cada columna tiene su codigo individual en los datos siguientes
25
LC/MS Columns Linearity Test
lab.
40 38
37 37 37
35 34
33
30
30 29
25
20
15
10
5
0
1 2 3 4 5 6 7 8
Número de compuestos con r2>0.99
6 diferentes concentraciones desde 0.001 a 0.200 mg/Kg,
3 replicas por concentración (18 inyecciones). 26
Prueba de anchura de pico LC/MS
lab.
Anchura de pico (anchura a mitad de altura) en segundos
Leyenda:
Muy Ancho
Ancho
Bueno
Estrecho (muy bueno)
Todos los cromatogramas tienen la misma achura (2 min)
27
Prueba de anchura de pico en columnas LC/MS
lab.
RT Analyte 1 2 3 4 5 6 7 8
2.72 Methamidophos 27 37 18 18 16 28 24 20
4.77 Acephate 25 35 15 28 33 30 38 17
5.24 Omethoate 27 38 8 27 28 26 9 9
5.46 Aldicarb Sulfoxid 12 10 6 9 13 9 8 8
5.65 Aldicarb Sulfone 8 8 6 7 10 8 7 8
5.74 Oxamyl 8 7 6 6 9 6 7 6
5.87 Carbendazim 9 10 8 10 12 9 10 9
5.92 Demeton-S-methyl sulfoxide 8 8 7 8 7 7 8 7
6.01 Methomyl 6 6 7 6 8 7 8 6
6.11 Thiametoxam 4 4 4 4 4 4 4 4
6.29 Monocrotophos 7 7 6 7 7 6 6 8
6.61 Ethiofencarb sulfone 7 6 6 7 7 6 6 6
6.72 Imidacloprid 5 5 5 5 5 5 6 5
6.73 Ethiofencarb sulfoxide 7 7 7 9 5 7 6 6
6.94 Methiocarb sulfoxide 6 5 6 6 6 6 6 6
7.16 Carbofuran 3OH 6 6 6 7 6 6 6 7
7.20 Acetamiprid 7 7 7 8 7 7 8 8
7.37 Methiocarb sulfone 6 6 6 7 6 6 6 7
7.65 Thicloprid 7 6 7 7 6 7 7 7
8.13 Aldicarb 6 5 6 6 5 6 6 6
8.73 Dichlorvos 7 6 6 7 6 7 7 7
28
8.77 Imazalil 6 8 6 8 7 6 9 7
LC/MS Columns Peak Width Test
lab.
RT Analyte 1 2 3 4 5 6 7 8
8.85 Propoxur 7 7 7 7 6 7 6 8
8.90 Carbofuran 8 6 7 8 7 8 9 6
9.58 Spiroxamine 8 9 11 11 22 6 20 9
9.95 Diuron 6 7 7 8 6 7 7 9
10.40 Linuron 7 7 6 6 6 5 6 7
10.50 Methiocarb 7 6 5 6 5 5 7 7
10.60 Dimetomorph 22 22 16 18 9 23 23 21
10.60 Fludioxonil 4 3 3 4 3 12 4 5
11.00 Fenhexamid 5 4 5 6 5 6 5 5
11.20 Diflubenzuron 6 5 5 6 8 6 5 5
11.20 Picoxystrobin 7 5 7 6 7 7 6 8
11.30 Tebufenocide 6 5 7 7 6 7 6 7
11.60 Pyraclostrobin 7 6 7 8 6 6 8 7
11.70 Clofentezine 6 6 6 4 10 7 7 8
11.80 Indoxacarb 5 5 4 6 6 5 4 5
11.90 Trifloxystrobin 7 5 7 8 6 8 6 6
12.00 Hexaflumuron 4 4 4 5 4 4 4 4
12.20 Benfuracarb 5 5 5 5 5 5 5 5
12.30 Lufenuron 4 6 3 5 4 4 12 5
12.50 Flufenoxuron 5 5 6 7 7 6 5 5
13.00 Carbosulfan 3 3 4 4 2 5 6 4
29
Methamidophos 0.100 mg/Kg
lab.
1 2 3 4
5 6 7 8
30
Acephate 0.100 mg/Kg
lab.
1 2 3 4
5 6 7 8
31
Omethoate 0.100 mg/Kg
lab.
1 2 3 4
5 6 7 8
32
Oxamyl 0.100 mg/Kg
lab.
1 2 3 4
5 6 7 8
33
+Hexaflumuron 0.100 mg/Kg
lab.
1 2 3 4
5 6 7 8
34
Tecnologías MS
lab.
Trap 3D
Sensibilidad Q TRAP
Full Scan
MS3 (o más)
Sensibilidad Full
QqQ Scan
Sensibilidad MRM
MS3
Pérdida de Neutros
Sensibilidad MRM
Barrido de
Pérdida de Neutros
Precursores
Barrido de 35
Precursores
Adquisición Dependiente de la Información (IDA)
lab.
Búsqueda de desconocidos Barrido de MRM
Barrido en “Multiple Reaction
Monitoring” de cientos de compuestos
(solamente 1 transición por analito...)
Criterio IDA (umbral...)
Adquisición automática de espectros Umbral de señal Exclusión Dinámica
en modo “Enhanced Product Ion
Scans” en la trampa
Sustracción de Fondo Dinámica y
Exclusión Dinámica
Scans dependientes
Búsqueda en bibliotecas de espectros
36
Metalaxil en uva
lab.
Library CE=20V CE=20V
Fit 0.956
RFit 0.956
Purity 0.955
Library CE=35V CE=35V
Fit 0.953
RFit 0.955
Purity 0.951
Library CE=50V CE=50V
Fit 0.735
RFit 0.618
Purity 0.607
Metalaxyl 0.009 mg/kg (0.010 mg/kg LMR en alimento infantil) 37
Conclusiones
lab.
A través de los últimos años, se han desarrollado nuevas tecnologías en
LC/MS (Interfases ESI, columnas, Triple Quadrupolo, MS/MS, sistemas
más rápidos, Híbridos, etc.) permitiendo:
Una disminución increíble en los límites de detección
Aumento en el número de compuestos en un único análisis
Gran Selectividad
Preparación de la muestra más sencilla
Inequívoca confirmación espectral, full scan MS/MS o
Robustez del método que hace más fácil el trabajo en rutina de un
laboratorio de plaguicidas.
Y la historia continua...
38
lab.
lab.