Fibrosi Cistica II by Mg7kd8

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									        Fibrosi Cistica II




            Lezione 8
By NA
                    Linkage-lod score

         Il linkage e’ una relazione di vicinanza fra due loci ed e’ funzione della loro
        distanza. La definizione di un linkage fra due loci si basa su calcoli statistici
        che permettono di quantizzare la probabilta’ che i risultati ottenuti non siano
        dovuti al caso . Nel caso dell’uomo l’analisi della progenie di una singola famiglia
        raramente fornisce informazioni sia per lo scarso numero di meiosi sia per la
        difficolta’ di risalire alla fase. Bisogna mettere insieme i dati provenienti da
        piu’ famiglie.


                    P di un assortimento genetico in una progenie se i geni sono associati     (1-n r

          Odds
          ratio=                                                                               (1/2)n+r
                    P di un assortimento genetico nella progenie se i geni sono indipendenti



  Lod score: logaritmo in base 10 dei singoli rapporti di ogni famiglia, si possono cosi
  sommare. Un valore di 3 indica linkage.



By NA
                                 LOD SCORE
LOD SCORE (Z): logaritmo della probabilita’ che i loci siano associati (data la
frazione di ricombinazione q ) piuttosto che non associati (q=0.5). La probabilita’
complessiva di un gruppo di famiglie e’ il prodotto delle probabilta’ di ciascuna famiglia,
percio’ la somma dei lod score. Per q= 0.5, Z=0:infatti sono il rapporto fra probabilta’
identiche e log10(1)=0. Z=3(1000:1) e’ la soglia per accettare il linkage con una
probabilita’ di errore del 5%. Z=-2 esclude il linkage.

  Z
   4
   3
   2
   1
   0




        0   0.1    0.2     0.3      0.4      0.5
        Frequenza di ricombinazione


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           Fibrosi Cistica                  ancora storia


 1985: Analisi di linkage:          il gene della fibrosi cistica (CF) viene
associato ad un polimorfismo proteico (enzima paraossonasi) di cui si ignora
la localizzazione.

        Per una patologia autosomica
        recessiva l’analisi di linkage e’
        ostacolata dal fatto che non si
                                                   -/+            -/-
        conosce la FASE, per cui il
        calcolo si effettua prima
        considerando che i 2 loci(allele
        polimorfico e locus malattia)
        siano in cis e poi in trans e il
        valore di lod score sara’ la
        media tra i due valori ottenuti.
                                                    -/+     -/+   -/-



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                       Fibrosi Cistica          ancora storia
  1986: Furono trovati altri marcatori associati alla CF
 e il gene della paraossonasi viene mappato sul cromosoma 7.


        TRA   OGNUNO DI QUESTI
                                                 NESSUNO       DI     QUESTI
        MARCATORI E IL GENE DELLA
        CF SONO STATI TROVATI                    MARCATORI    E’   IL   REALE
        DEI RICOMBINANTI.                        RESPONSABILE DELLA CF.



            Identificata la regione, utilizzando gli RFLP della regione, si
           restringe la mappatura di CF alla bande citogenetiche 7q31-32. Si
           definirono inoltre i marcatori fiancheggianti: oncogene MET
           prossimale e D7S8 (clone anonimo) distale

                 Met                       CF                    D7S8



                            0.4                         0.3

By NA
        Fibrosi Cistica:ancora            storia

  1986-:          si identificano altri polimorfismi nella regione e si fonda un
 consorzio per cumulare i dati raccolti in piu’ centri. Viene attuato prima il
 chromosme walking, successivamente, per ovviare alla brevita’ delle sonde
 disponibili, si passo’ al chromosme jumping



  1989: si riesce ad evidenziare la presenza di linkage disequilibrium per
 i marcatori XV2.c e KM19 che risulteranno far parte del 5’ del gene



            Cos’e’ il linkage disequilibrium?
By NA
                Linkage disequilibrium

 Il linkage e’ una relazione fra loci, mentre l’associazione e’ la relazione fra alleli.
 Associazione allelica significa che se degli individui hanno un certo allele in un locus, la
 probabilita’ di avere un particolare allele di un altro locus e’ statisticamente piu’ alta
 di quella legata al caso e/o alla frequenza del secondo allele nella popolazione. Es. un
 particolare antigene HLA e’ presente nel 78% della popolazione con artrite
 reumatoide, ma e’ presente nel 36% della popolazione generale.



L’associazione e’ un’ asserzione statistica che segnala la ricorrenza contemporanea
di alcuni alleli o di fenotipi. L’associazione ha cause diverse,non necessariamente
genetiche, mentre il linkage e’ una relazione specifica legata alla vicinanza fisica di due
locus. Es. se il locus A e’ fisicamente associato ad un locus malattia, in una specifica
famiglia un particolare allele di quel locus segrega con la malattia, in un altra e’ un altro
allele, ma nella popolazione generale entrambi gli alleli sono presenti anche associati al
gene normale.



By NA
                   Linkage disequilibrium

  LINKAGE EQUILIBRIUM: l’associazione in cis o trans di 2 alleli su un
  cromosoma e’ casuale. Se definiamo APLOTIPO la particolare combinazione di
  alleli sul cromosoma, la frequenza di ogni aplotipo e’ pari al prodotto delle
  frequenza dei singoli alleli.

        LOCUS ALLELI   FREQUENZA   APLOTIPI FREQUENZA

               A         p            A       pr
         1     a         q            B
                                                        NON SEMPRE E’
               B         r            A       ps              COSI….
         2     b         s            b


                                      a       qr
                                      B

                                      a
                                      b       qs
By NA
                 Linkage disequilibrium

   Il     linkage disequilibrium e’ una situazione per cui un particolare
  aplotipo e’ statisticamente piu’ probabile in un sottogruppo di una
  popolazione. Indica che la popolazione deriva da un comune ancestore o, nel
  caso delle mutazioni patogene, che la mutazione e’ avvenuta su un
  cromosoma ancestrale comune alla popolazione. Il linkage disequilibrium non
  ha niente a che fare con la presenza della mutazione patogena e’ una
  osservazione che facilita la mappatura genetica. Indica che fisicamente
  associato al locus A polimorfico c’e’ un altro locus che, quando mutato
  origina la malattia. Essendo un fenomeno legato all’origine comune degli
  individui della popolazione, in un’altra popolazione il disequilibrium
  riguardera’ un altro allele del locus A




By NA
             Linkage disequilibrium

  E’   necessario considerare tutte le cause   dell’associazione: il linkage
 disequilibrium e’ solo una delle cause


  Causa-effetto      e selezione naturale: Un certo allele rende piu’
 suscettibili a manifestare la malattia o permette alle persone malate di
 sopravvivere e di avere figli



  Errori    per la stratificazione della popolazione o per mancata
 correzione statistica: se una popolazione e’ composta di sottoinsiemi
 geneticamente distinti entrambi i marker possono essere piu’ frequenti, ma
 senza che questo implichi un’associazione. Nel secondo caso i dati non
 vengono confermati da studi successivi


By NA
            Fibrosi Cistica e linkage disequilibrium
            Il gene della Fibrosi Cistica e’ stato clonato grazie alla
            presenza del linkage disequilibrium.
                                                 CHR CF              CHR NORMALI
                                              (254 con mut)          (318 wild-type)
        APLOTIPO   ALLELE di   ALLELE di   numero    percentuale   numero   percentuale
                    XV-2C       KM-19
        A             1           1         17          6.7         74         28.9

        B             1           2         218         86.5        35         16.4

        C             2           1          7          2.8         110         44

        D             2           2         10           4          31         10.7

        Incerto                              2                       4



        Dati ottenuti su 114 famiglie britanniche con un figlio affetto.
        Il cromosoma CF, identificato perche’ presente nell’affetto,
        tende a portare gli alleli X1 e K2.

By NA
        Possibili cause del linkage disequilibrium
  Potrebbe     essere causa dell’effetto del fondatore: la mutazione potrebbe essere
  comparsa in un antenato della popolazione Nord-Europea che portava l’aplotipo B e
  probabilmente gli eventi di ricombinazione non hanno avuto sufficiente tempo per
  rispristinare una situazione di equilibrio, cioe’ ad una associazione casuale. Cio’ significa
  anche che gli eventi di ricombinazione sono rari tra il gene CF e i due marcatori cioe’ il
  locus malattia e’ strettamente associato ai due marcatori XV-2C e KM-19



  La     presenza di un particolare aplotipo potrebbe conferire un vantaggio selettivo
  nell’individuo che lo porta (come accade per gli antigeni HLA: particolari aplotipi
  sembrano migliorare la risposta immunitaria e percio’ sono sottoposti a pressione
  selettiva)



  La     conoscenza del linkage disequilibrium oltre a dare una indicazione della
  localizzazione precisa del locus malattia, risulta utile per la consulenza: permette di
  calcolare con maggiore precisione il rischio di trasmissione. Es: normalmente 1/25
  portatori nella popolozione nord-europea, ma se un individuo ha aplotipo BB il rischio
  e’ maggiore, mentre e’ molto ridotto per aplotipi AA.

By NA
                  Clonaggio del gene della CF
                        Tecniche utilizzate




        Gene walking      Chromosome jumping     Zoo- blot




                       RICERCA DELLE MUTAZIONI


By NA
                                          CFTR
              1989:   una volta clonato il gene putativo, bisogno’ dimostrare che era il
              gene della fibrosi cistica. Furono pertanto esaminati gli affetti e si trovo’
              che il 70% dei cromosomi CF presentavano la delezione di una tripletta
              (F508) senza che venisse alterata la ORF. Il prodotto del gene e’ stato
              definito CFTR( cystic fibrosis transmembrane conductance regulator).



        OUT




        IN

        Nterm                 NBD1              R            NB21
                      ATP                     Domain                  ATP
                      ADP+                                            ADP+
                       Pi                                              Pi
                                                  Cterm
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        Conferma del coinvolgimento di CFTR

        La presenza in omozigosi della F508 in individui gravemente
        affetti non era conclusiva, anche se molto convincente: la
        delezione avrebbe potuto essere un polimorfismo come altri in
        linkage disequilibrium strettissimo con il gene. La identificazione
        del coinvolgimento di CFTR nel trasporto dello ione cloro
        attraverso le membrane apicali e la caratterizzazione di alcune
        mutazioni il cui effetto era piu’ evidente sull’espressione del gene
        confermarono che CFTR era il gene della Fibrosi cistica.




                                            CFTR
                                                           cloro




By NA
                              Diagnosi di CF
  Oggi sono state descritte oltre 700 mutazioni nel gene
 CFTR
        Molte vengono definite mutazioni private, perche’ individuate in una sola
        famiglia. In molti casi non e’ certo che siano patogene, potrebbero
        essere sequenze varianti in un cromosoma in cui e’ presente un allele CF.
        Non ci sono altre mutazioni molto frequenti, sono tutte mutazioni con
        frequenza che non supera qualche punto percentuale. Sono state trovate
        mutazioni di diverso genere lungo tutto il gene e probabilmente altre
        devono essere ancora scoperte


            La presenza di centinaia di mutazioni diverse rende
            molto difficili i test diagnostici per la CF


      Screening per PCR e                     Amplificazione specifica con primer
    successiva amplificazione                    che legano sequenze mutate

By NA
                       Tipi di mutazione
    SONO STATE TROVATE MUTAZIONI DI VARIO GENERE:
    Mancata produzione della proteina(frameshift e non senso)
        Mancato processamento della proteina e conseguente
    ripiegamento anomalo della stessa e incapacita’ di fuoriuscire nel
    lume cellulare(F508)
    Non corretta regolazione della proteina: il canale ionico e’
    regolato tramite fosforilazione da parte di kinasi cAMP dipendenti,
    mutazioni nei domini regolatori della proteina portano al mancato
    funzionamento di questo sistema.
    Mutazioni puntiformi che distruggono il canale stesso.
    Alcuni soggetti presentano mutazioni in omozigosi e sono affetti
    piu’ gravemente.
        Esistono anche casi di eterozigosi composta con mutazioni
    diverse nello stesso soggetto.



By NA
         Ricerca delle mutazione nel gene CFTR
 Le mutazioni CF sono piu’ di 700, le piu’ comuni hanno frequenza
 diversa nelle popolazioni:
 F508 va dal 50% nel mediterraneo all’85% in Danimarca e nei paesi
 baschi, in media il 70% degli ALLELI MUTATI sono F508. Altre 12
 mutazioni hanno una frequenza combinata del 15%. quindi le frequenze
 medie dei genotipi dei MALATI di fibrosi cistica sono :

        49% F508/F508
        21% F508/mutaz. comune non F508
        21% F508/mutaz.rara
        4.5% mutaz. comune non F508/mutaz. rara
        2.25% mutaz. comune non F508/ mutaz. comune non F508
        2.25% mutaz. rara/mutaz. rara

  Circa il 90% degli affetti ha almeno un allele F508 e sara’ comunque
  possibile in Europa identificare circa il 70% dei genotipi utilizzando i
  test per le mutazioni comuni
By NA

								
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