Basi molecolari delle patologie by BMtU1K5N

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									Basi molecolari delle patologie
          Molecular disesae




Linus Pauling e l’a-elica
Itano e Singer dimostrarono nel
1946 mediante elettroforesi che Hb
falciforme aveva più cariche
positive. Questa fu una scoperta
sorprendente, alla quale Pauling
diede il nome di “Malattia
molecolare”
Monomero emoglobina
      Hb falciforme (HbS)

Val



                            Val
Glu   Val
La mutazione nel gene della b
          globina
La presenza
della valina
crea una zona
idrofobica che
interagisce
con la regione
idrofobica
della catena b
di una Hb
adiacente.
       Elettroforesi del DNA
                              normali
                         S   S AAA
• Elettroforesi di
  frammenti di DNA
  ottenuti tramite
  enzimi di
  restrizione dal gene
  della globina b
Elettroforesi della proteina




         +          _
  Identificazione tramite HPLC
           della proteina




                *




*= Hb glicata
Le patologie congenite
       nel cane
              Introduzione
• Nei cani di razza pura sono state
  identificate circa 500 patologie genetiche
• Sito Web “Inherited Diseases in Dogs”
  (IDID): www.vet.cam.ac.uk/idid
• Più di metà sono congeniti secondo la
  modalità recessiva autosomica
  mendeliana semplice (problema per gli
  allevatori!)
                 Patologie
• Atrofia retinica progressiva (Setter, Labrador,
  Corgi, Mastino, Bassotto, ecc)
• Malattia di von Willebrand (Bovaro bernese,
  Doberman, Pinscher, alcuni Terrier, ecc)
• Carenza di piruvato cinasi (Basenji, Chihuahua,
  Bassotto, ecc)
• Tossicità da ivermectina (Pastore tedesco,
  Collie, Bobtail ecc)
• Intossicazione da Cu
Carenza di piruvato cinasi
                        Piruvato cinasi
            Dominio B




Dominio A




                         Dominio C
       Struttura e caratteristiche
• 4 isozimi M1, M2, R e L codificati da 2 geni distinti:
       LR (nell’uomo sul cromosoma 1) codifica per
  isoforme R (specifica per eritrociti) e L (fegato, corteccia
  surrenali, intestino tenue);

       M (nell’uomo sul cromosoma 15) codifica per
  isoforme M1 (muscolo scheletrico adulto, cuore cervello)
  e M2 (fetale in tutti i tessuti, poi viene sostituita dalle
  altre isoforme tranne che in rene, tessuto adiposo,
  leucociti).

• Cinetica e regolazione
Metabolismo degli eritrociti


 Glucosio    Glucosio-6-P      6 Fosfogluconato




                            Pentosi fosfati


             PEP


            Piruvato         Lattato
• Carenze negli enzimi che controllano la glicolisi
  risultano in una bassa produzione di ATP,
  riducono la vita media degli eritrociti e
  provocano anemia (fosfofruttocinasi-PFK e
  piruvato cinasi-PK)
• Carenza di Glucosio-6-P deidrogenasi rende gli
  eritrociti suscettibili a danni ossidativi per
  carenza di glutatione ridotto

• (nell’uomo sono note 158 diverse mutazioni del gene PK-LR e
  l’incidenza è 1:20.000 nella popolazione bianca).
Scoperta nei primi
anni ’70 in Basenji e
Beagle, ma presente
anche in altre razze
• Questa carenza è trasmessa come
  carattere autosomico recessivo
• Gli omozigoti presentano minor
  resistenza all’esercizio, tachicardia,
  mucose pallide e splenomegalia. Gli
  eritrociti hanno una vita più breve, si
  ha anemia rigenerativa con elevata
  presenza di reticolociti
• Nei cani normali: Ht 48 e % Rtc 0,4
  (nell’uomo 1%)
• Nei cani ammalati: Ht 21 e % Rtc 40.
                           La prolungata anemia emolitica produce
                           un anormale assorbimento di ferro a
                           livello intestinale, con successivo
                           accumulo nel fegato (emosiderosi).
                           Anche nell’uomo, un accumulo di ferro
                           nel fegato si manifesta come
                           complicazione della carenza di PK




Iperplasia delle cellule
del Kupfer contenenti
granuli di emosiderina
              Basi molecolari
• Nei cani affetti da carenza di PK negli eritrociti
  manca l’isoforma R dell’adulto.
• Il tipo di mutazione varia a seconda della razza:
  ad esempio nel Basenji la mutazione è il
  risultato di una singola delezione che porta alla
  formazione di una proteina tronca che non
  presenta il sito catalitico funzionante.
• Negli eritrociti è invece presente l’isoforma M2,
  che è presente normalmente nei reticolociti.
             Test diagnostici
• Misura attività PK nell’emolisato: molto spesso
  normale, in quanto i reticolociti hanno attività
  molto alta
• Dal momento che M2 ha attività molto labile può
  aiutare un test di stabilità termica, lasciando
  l’emolisato a per 1h a 50°C.
• Altri test: immunoblotting, misura di intermedi
  glicolitici
• Diagnosi molecolare basata su DNA (PennGen:
  w3.vet.upenn.edu/research/centers/penngen/ser
  vices/alldiseases.html)
           Anche nei gatti




Abissino          gatto domestico a pelo corto
Malattia di von Willebrand
                Introduzione
• La malattia di von Willebrand (vWD) è il difetto
  genetico della coagulazione più comune
  nell’uomo e nel cane.
• Deriva da carenza qualitativa e/o quantitativa di
  una glicoproteina multimerica, il fattore di von
  Willebrand, necessario per il processo di
  adesione delle piastrine.
• Ci sono 4 tipi di vWD ereditaria.
• La malattia fu scoperta nel 1924 da un pediatra
  finlandese, E.A. von Willebrand
Fattore (proteina) di von Willebrand


                         Proteina di von
                         Willebrand
                         (blu) legata al
                         recettore
                         piastrinico
                         (giallo)
Nell’uomo: in gene per vWF si estende per 178kb e comprende
52 esoni
Il monomero contiene 2050 AA organizzati in vari domini
Viene glicosilato e dimerizza mediante ponti-S-S- nel reticolo
Nel Golgi forma multimeri estremamente grandi >20,000 KDa
che sono funzionalmente attivi
                Le mutazioni
• Il tipo di mutazione
  determina la severità della
  patologia
• Il fattore manca negli
  individui che presentano la
  forma severa della patologia
  (tipo III) (Scottish Terrier e
  Shetland Sheep).
• Forme meno severe (I ) con
  bassi livelli nel Doberman
  Pinscher.
         Il caso del doberman
• La mutazione nei doberman comporta la
  presenza di livellli normali di vWf intorno al 5-
  10%, mentre il restante 90-95% è patologico
• La mutazione in questo caso colpisce un sito di
  splicing (splice site mutation)
• Si tratta di una mutazione che modifica il sito di
  splicing portando alla permanenza di introni nel
  messaggero maturo con conseguente proteina
  aberrante

								
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