Capacita��o Sensiblidade 2005 by k9zFa8A

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									                   Dra. Antonia Maria de Oliveira Machado
                                 Diretora Técnica
      Instituto Paulista de Doenças Infecciosas e Parasitárias Laboratórios
                       Laboratório Central - HSP - UNIFESP




Métodos de Teste
de Sensibilidade aos
Antimicrobianos (TSA)
                  Beta Lactâmicos

                               GRUPOS:
       Anel -lactâmico
                               Penicilina
                               Cefalosporinas
                               Monobactâmicos:
   O                               aztreonam

                               Carbapenêmicos:
                                   imipenem
Sítio de ação da -lactamase
                                   meropenem
                                   ertapenem
             Cefalosporinas



1a Geração                    3a Geração


 Cefazolin
                          Cefoperazona
                          Cefotaxima
2a Geração                Ceftazidima
                          Ceftizoxima
                          Ceftriaxona
Cefamandol
Cefonicid
Cefotetan                     4a Geração
Cefoxitina
Cefuroxima
                               Cefepima
     RESISTÊNCIA BACTERIANA AOS ANTIMICROBIANOS




                                  Aeróbios         Metronidazol
 Natural ou intrínseca
   ou Constitutiva
                                Anaeróbios         Aminoglicosídeos
                                                  Mutação de genes
     Adquirida               Cromossômica


                                                  Resistência única-
                                                  não é transmitida de
                         Produção: ß-             célula para célula a
                         lactamases,              menos que o gene
    Plasmidial                                    esteja em integron
                         fosfotransferases,
                         hidrolases, redutases.

Transmissível        Resistência múltipla
           Evolução Clínica

                   Paciente



       Imunidade                   Farmacologia




Microrganismo        Teste de       Antimicrobiano
                   sensibilidade
Reprodução da descoberta de   Reprodução da placa de Fleming para a
         Fleming              prova de sensibilidade aos antibióticos
    TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS




    METODOLOGIAS
Avaliação QUALITATIVA
       DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR
Avaliação QUANTITATIVA
       DILUIÇÃO EM CALDO
          Macrodiluição
          Microdiluição
       DILUIÇÃO EM ÁGAR
       AUTOMATIZADOS
       ETEST
               MACRODILUIÇÃO


        Método quantitativo  MIC


g/mL    100   50   25    12.5   6.25   3.12   .16   .8   .4   controle



                          Conceito
                          Precisão
                          Vantagens
                          Desvantagens
MACRODILUIÇÃO EM CALDO
     Determinação do MIC



               12.5   6.25   3.12   g/mL




                      MIC
É a menor concentração inibitória mínima
  que inibe completamente o crescimento
               bacteriano.
            MACRODILUIÇÃO


MIC
      g/mL 100   50   25   12.5   6.25   3.12   .16   .8   .4   controle




                                                  ••••
MBC                         • • •
                            • • •
                                                 •••••
                                                  ••••
MICRODILUIÇÃO
          TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR



   Utilizado rotineiramente
   Fácil execução
   Flexibilidade na escolha dos antibióticos
   Reprodutibilidade nos resultados
   Padronização dos resultados
   Baixo custo
TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR



      Princípio do método
Teste de sensibilidade aos
    antimicrobianos


 Leitura e Interpretação




        mm
        DILUIÇÃO EM ÁGAR

 Utilizado em estudos epidemiológicos
 Fácil execução

 Permite testar vários isolados simultaneamente

 Promove resultados quantitativos

 Permite o teste de bactérias fastidiosas

 Baixo custo (relativo)

 Poucos isolados
 Preparo das placas e estocagem
          DILUIÇÃO EM ÁGAR

Ágar com 6 g/mL de Vancomicina


                              Enterococcus spp.

                                  S   4 g/mL

                                  I      8-16 g/mL

                                  R   32 g/mL
  Diluição em Ágar - Desvantagens



Muito trabalhoso, tanto a preparação das placas
 quanto a preparação do inóculo, especialmente
 quando vários antimicrobianos devem ser
 testados

As placas de ágar não podem ser armazenadas
 por muito tempo
                                         Helio Sader - LEMC
      Etest

Princípio do método
Etest®Difusão
                        Teste de sensibilidade
                        aos antimicrobianos
                         Curva de regressão

                 100

                  50

                  25

                  12
MICs   (g/mL)
                 6.25

                 3.12

                  1.6

                  0.8

                  0.4

                        6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

                                   Diâmetro de zona de inibição (mm)
Relação entre o MIC, Zona de inibição
          e “Breakpoints”.
           MIC  DIFUSÃO



100   50   25   12.5   6.25    3.12   .16   .8       .4   controle

                       g/mL




                                                   30


                                                   50
                                                   25
                                                   12.5
                                                   6.25
                                                   3.12

                                                 18 mm
Interpretação do Etest
Interpretação do Etest
Interpretação do Etest
NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS

          CLSI - antigo“NCCLS”


                    Organização internacional,
                      interdisciplinar e educacional que
                      promove o desenvolvimento e a
                      ampla utilização de normas e
                      procedimentos laboratoriais
                      padronizados.
                     A subcomissão do CLSI é composta
                      de representantes de profissões,
                      do governo e indústria, incluindo
                      laboratórios de microbiologia,
                      educadores, farmacêuticos, etc.
   TESTE DE SENSISIBILIDADE AOS ANTIBIÓTICOS


                Padronização
 Processos Padronizados (POPs)
 Controle de qualidade dos itens:
        meios (efeito timidina ou timina)
        pH
        temperatura
        incubação
        discos (ATCCs)
        fitas de Etest
 Teste de sensibilidade aos
      antimicrobianos
       Procedimento
Bactéria e Preparo do Inóculo


        Suspensão direta
        Método de crescimento

        0,5 McFarland 1a 2x108 UFC/mL
Teste de sensibilidade aos
    antimicrobianos
      Procedimento
    Bactéria e Inóculo



                    Bactéria recentemente isolada
                    Colônias bem isoladas
CRESCIMENTO BACTERIANO
    TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR



                MEIOS

1- Ágar Mueller-Hinton

2- Ágar Mueller-Hinton suplementado

3- Ágar GC

3- Haemophilus Test Medium (HTM)
        TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR



        MEIO MUELLER- HINTON
 Reprodutibilidade do teste.

 Baixo teor de inibidores de sulfonamidas, trimetoprim
  e tetraciclinas.

 Permite crescimento satisfatório da maioria dos
  patógenos.
 Grande número de dados e experiência com o meio.
           TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR


    O que devemos saber sobre os meios?
 Hidratar e autoclavar

 60 a 70 mL      150 mm
                                4 mm
  25 a 30 mL          90 mm

 pH      7.2 a 7.4

 Conservação         2 a 8oC

 Teste de esterilidade
        TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR


  O que devemos saber sobre os meios?
 Umidade

 Efeito da Timidina ou Timina
 Inibidores das sulfonamidas e trimetoprim.

 Conservação            2 a 8oC

 Teste de esterilidade

 Efeitos da variação de Magnésio e Cálcio
       TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR



                      Discos
 Conservação               8oC ou 
                            freezer (não “frost free”)
Imipenem, Ertapenem Cefaclor e combinações de ác.clavulânico

 Retirar do refrigerador ou do freezer até
     2 horas antes do uso
 Evitar umidade
 Data de validade
          Teste de sensibilidade
           aos antimicrobianos
          Seleção dos antibióticos
   Laboratório Clínico

   Infectologistas

   Comissão de Infecção Hospitalar

   Comissão de Controle de Antimicrobianos

   Farmácia
           Teste de sensibilidade
            aos antimicrobianos
Quando e porquê realizar o antibiograma?


   Isolado requer terapia antimicrobiana
   Isolado cuja susceptibilidade não é preditiva
   Isolado capaz de exibir resistência
   Orientação terapêutica
   Permite individualizar padrões de resistência
            Teste de sensibilidade
            aos antimicrobianos
               Procedimento
                   Inóculo

 Métodos:
 Crescimento

 Suspensão direta
            Teste de sensibilidade
             aos antimicrobianos
                 Procedimento
       Inóculo - Método do crescimento

 3 a 5 colônias         4 a 5 mL de TSB

 Incubar a 35oC - (2 a 6h)

 Ajustar a turbidez



   0,5 McFarland
    1a 2x108 UFC/mL
              Teste de sensibilidade
               aos antimicrobianos
                  Procedimento
            Inóculo - Suspensão direta
 3 a 5 colônias            4 a 5 mL de TSB ou salina

 Ajustar a turbidez



     0,5 McFarland
       1 a 2 x 108 UFC/mL


 Estabilizar 15 min.
Teste de sensibilidade
aos antimicrobianos
   Procedimento
       Inóculo
Teste de sensibilidade
aos antimicrobianos
   Procedimento
     Inoculação
             Teste de sensibilidade
             aos antimicrobianos
                Procedimento
                  Inoculação

 Superfície do ágar não deve estar úmida

 Inoculação homogênea

 Esperar diminuir a
  umidade antes da
  aplicação dos discos
                   Teste de sensibilidade
                   aos antimicrobianos
                      Procedimento
                   Aplicação dos discos
 Bateria pré determinada

 Aplicar e pressionar o disco

 Aplicar no máximo
   12 discos na placa de 150mm
    5 discos na placa de 90mm
 Inverter a placa e incubar 15
minutos após a aplicação
                 Teste de sensibilidade
                 aos antimicrobianos
                    Procedimento
                       Incubação

 Temperatura            35oC

 Atmosfera           atm ambiente

     exceção Haemoplilus spp., N. gonorrhoeae e
     estreptococos



              CO2
Teste de sensibilidade
aos antimicrobianos
Leitura e Interpretação
TESTE DE SENSIBILIDADE
 AOS ANTIMICROBIANOS


     O que testar?
    Como interpretar?
                         “CLSI-2005 ”



  A lista de cada
                      Quais são os antibióticos devemos utilizar?
  microrganismo
                      Grupo A:    1ª escolha - testados e
   compreende                     reportados
agentes de eficácia   Grupo B:    1ª escolha - testados e
                                  reportados seletivamente
comprovada e que
                      Grupo C:    suplementares e reportados
      tem um                      seletivamente
 comportamento        Grupo U:    testados em isolados de urina
   aceitável nas      Grupo O:    outros não rotineiramente
                                  utilizados
  provas in vitro.
                      Grupo inv: em investigação
                     “CLSI”



 Recomendações na escolha dos antimicrobianos

 Padronização das técnicas

 Critérios para a interpretação dos resultados

 Parâmetros para o controle qualidade do teste.
   Interpretação do Resultado

             Susceptível (S)
A categoria susceptível implica que a infecção
causada pela cepa bacteriana isolada pode ser
  adequadamente tratada com a dosagem do
 antimicrobiano recomendada para o tipo de
       infecção e o agente infeccioso.

        Desde que não haja contra indicação.
  Interpretação do Resultado

           Intermediária (I)
   A categoria intermediária inclui isolados
 cujos MICs são próximos aos do sangue e
  tecidos. Ela permite a aplicabilidade do
antimicrobiano em infecções em sítios onde
      as drogas são fisiologicamente
  concentradas ou quando doses maiores
           podem ser utilizadas.
   Interpretação do Resultado

             Resistente (R)
A categoria resistente inclui isolados que não
 são inibidos pelas concentrações usuais do
antimicrobiano na dosagem padrão e/ou falha
    quando um específico mecanismo de
           resistência é expressado.
              Avaliação da Sensibilidade
              Streptococcus pneumoniae


 Mueller-Hinton agar com 5% de sangue de carneiro

 Inóculo       suspensão direta, 0,5 McFarland

 Incubação     35oC ± 2o em atm. 5% CO2

 Leitura       20 a 24h

 Controle de qualidade  S.pneumoniae ATTC* 49619



                                            CLSI, M100-S15, 2005
                       Avaliação da Sensibilidade
                       Streptococcus pneumoniae


 Escolha dos discos  Tabela 2G
       Oxacilina  Penicilina
       não recomendado para outros estreptococos



 Diâmetros de inibição específicos (Tabela 2G)


 Interpretação

       Oxacilina         20 mm  Sensível
                         19 mm
                                                       MIC
                                 penicilina, meropenem e ceftriaxona ou cefotaxima
                                                                         CLSI, M100-S15, 2005
      Streptococcus pneumoniae
                                Azitromicina
CLORANFENICOL              3    Claritromicina
                                                 Ampicilina, Amoxacilina,
ERITROMICINA               1
                                                 amoxacilina/ác.clav.
OFLOXACINA                                       ampicilina/sulb.,
OXACILINA 1g  PENICILINA 1      20mm          cefaclor, cefepima,
                                                 cefotaxima, ceftriaxona,
RIFAMPICINA                3       S             cefuroxima, imipenem e
GATIFLOXACINA              3
                                                 meropenem
SULFA/TRIMET               1
VANCOMICINA                2

                                                 Levofloxacina
     < 17 mm                                     Moxifloxacina

                         Penicilina
   19 mm       MIC      Meropenem
                         Ceftriaxona

                                                    CLSI, M100-S15, 2005
       Avaliação da Sensibilidade
          Streptococcus spp.

 Mueller-Hinton agar com 5% de sangue de carneiro

 Inóculo       suspensão direta

 Incubação     35oC ± 2o em atm. 5% CO2

 Leitura       20 a 24h

 Controle de qualidade  S.pneumoniae   ATTC* 49619



                                           CLSI, M100-S15, 2005
            Avaliação da Sensibilidade
                  - Enterococos

 Ágar Mueller-Hinton

 Inóculo      crescimento ou suspensão direta

 Incubação  35oC ± 2o em atm. ambiente

 Leitura      16 a 18h,
                24h para Vancomicina  R

                                   MIC
                                           CLSI, M100-S15, 2005
        Enterococcus resistente à
        Vancomicina (VRE)

    1º Isolado
final dos anos 80


                    30 anos após
                    Vancomicina



                               > 20% das infecções
                                  pelo Enterococo
         Enterococcus resistente à
         Vancomicina (VRE)


Resistência Intrínseca
  Enterococcus gallinarum e E. casseliflavus


Resistência adquirida
  Enterococcus faecium e E. faecalis
               Detecção do pigmento - Enterococcus spp.
                                    BHIA




 E. faecium
 E. faecalis
E. gallinarum




  Pigmento amarelo     Sim   Motilidade 30ºC   Negativo        E. mundii

                                Positivo                  E. casseliflavus
                    Avaliação da sensibilidade
                     dos Enterococcus spp.
                      S              Imipenem
                                     E. faecalis
AMPICILINA                  1                       Penicilina            S
CIPROFLOXACINA              U
CLORANFENICOL               3                        Amoxicilina, Amoxacilina/ác.clav.,
                                                    ampicilina/sulbactan, piperacilina e
GENTAMICINA 120 g          3                            piperacilina/tazobactan.
STREPTOMICINA 300 g        3                      Para cepas não produtoras de  lactamases
TEICOPLANINA
                 24 h de incubação
VANCOMICINA                  2                        15-16 mm      MIC
QUINUPRISTIN/DALFOPRISTIN 2


                                                      Sinergismo positivo
    Detecção de  lactamases
                                                      Sinergismo negativo

               +
                                                       7-9 mm      MIC
        R Penicilina                                E. faecalis ATTC® 29212
                                                                           CLSI.M100 -S15, 2005
VRE




      +   –
        Avaliação da Sensibilidade
              Estafilococos

 Ágar Mueller-Hinton

 Inóculo         suspensão direta

 Incubação       33 a 35oC em atm. ambiente

 Leitura         16 a 18
              24h  Oxacilina/Cefoxitina e Vancomicina
                     MRSA e MRS                 CLSI, S15, 2005
       Staphylococcus                                             Staphylococcus
       aureus                                                     não aureus
                                            Levofloxacina
         CIPROFLOXACINA        3                                     CIPROFLOXACINA        3
                                             Ofloxacina
         CLINDAMICINA          2                                     CLINDAMICINA          2
         ERITROMICINA          2                                     ERITROMICINA          2
         GENTAMICINA           3             Azitromicina            GENTAMICINA           3
         OXACILINA 1g         1            Claritromicina           OXACILINA 1g         1
         CEFOXITINA                      Rotineiramente não são      CEFOXITINA
         PENICILINA            1           reportado em urina        PENICILINA            1
         SULFA/TRIMET          2                                     SULFA/TRIMET          2
         TEICOPLANINA                                                TEICOPLANINA
         VANCOMICINA           2           <14mm  MIC               VANCOMICINA           2
         Quinupristin/Dalfopristin 3                                 Quinupristin/Dalfopristin 3
         LINEZOLIDA            3                                     LINEZOLIDA            3


Gene mec A
              MRSA                                                               MRS
                         As penicilinas, cefens e outros  lactâmicos como
                    amoxi/ác.clav., ampi/sulb., ticarcilina/ác.clav. e carbapenems

             Oxa s e PS  S            Oxa s e PR   lactamase        Oxa R  PR
                                                                                        CLSI, S15, 2005
       NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL
    LABORATORY STANDARDS “NCCLS”- 2001


          Staphylococcus spp.

Vancomicina
 halo  14 mm                    MIC
                         Incubação por 24horas a 33 a 35°C


 MIC  4 g
                      Encaminhar a
                 Laboratório de Referência
    Detecção do VISA e VRSA




  Diluição
  em ágar

BHIA 6 g/mL
Vancomicina
Detecção do VISA e VRSA


                E-test
              Avaliação da Sensibilidade
    Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp., Stenotrophomonas
                 maltophilia e Burkholderia cepacia




 Ágar Mueller-Hinton

 Inóculo    método do crescimento ou suspensão direta

 Incubação  35oC ± 2o em atm. ambiente

 Leitura    16 a 18h        S. maltophilia e B. cepacia         20 a 24 horas
                              P. aeruginosa na Fibrose cística

 Controle de qualidade  P. aeruginosa ATTC* 27853
                           E. coli ATTC* 35218
                           E. coli ATTC* 25922                  CLSI.M100 -S15, 2005
Pseudomonas aeruginosa                   Acinetobacter spp.



 AMICACINA          2                           AMICACINA           2
 TOBRAMICINA        2                           GENTAMICINA         1
 GENTAMICINA        1                           AMPICILINA/Subac.
                         Cefotaxima
 CEFEPIMA           2                           CEFEPIMA            2
 CEFTAZIDIMA        1                           CEFTAZIDIMA         1
 CIPROFLOXACINA     2                           CEFTRIAXONA         3
 IMIPENEM           2   Levofloxacina           CIPROFLOXACINA      2
 MEROPENEM          2                           IMIPENEM            2
 PIPERACILINA       1                           MEROPENEM           2
 TICARCICINA        1                           PIPERACILINA        1
 PIPE/Tazo          O                           TICARCICINA         1
 TICARC/ Ác.clav.   O                           PIPE/Tazo           O
  POLIMIXINA                                    TICARC/ Ác.clav.    O
                                                POLIMIXINA
                              Pode ser reportado quando         CLSI,M100 -S15, 2005
                                 a cepa for resistente
Stenotrophomonas maltophilia   Burkholderia cepacia




     LEVOFLOXACINA     2             CEFTAZIDIMA              1

     MINOCICLINA       0             MEROPENEM                2

     TRIMETOPRIM -                   MINOCICLINA              0
        SULFAMETOXAZOL 3
                                     TRIMETOPRIM -
                                        SULFAMETOXAZOL 3




                                                   CLSI.M100 -S15, 2005
            Avaliação da Sensibilidade
                 Enterobactérias

 Ágar Mueller-Hinton

 Inóculo     método de crescimento e suspensão direta

 Incubação  35oC ± 2o em atm. ambiente

 Leitura     16 a 18h

 Controle de qualidade  E. coli ATTC* 25922
                           E. coli ATTC* 35218
                                                  NCCLS.M100 -S15, 2005
                 Enterobactérias
AMICACINA                2     Amoxacilina
AMPICILINA               1
AMPICILINA/Sulbactan     2      Amoxacilina/ác.clavulânico
AZTREONAM                3
CEFALOTINA               1
CEFEPIMA                 2
                                     Cefotaxima
CEFTAZIDIME              3
CEFOXITINA               2
CEFTRIAXONA              2
CIPROFLOXACINA           2          Levofloxacina
GENTAMICINA              1
IMIPENEM                 2
ERTAPENEM                2
                              Meropenem
PIPERACILINA/Tazobactan 2
SULFA/TRIMET             2
TICARCILINA/Äc.clavulânico2

                                                    CLSI.M100 -S15, 2005
    Avaliação da Sensibilidade
         Haemophilus spp

 Ágar Haemophilus Test Medium (HTM)

 Inóculo     suspensão direta

 Incubação  35oC em atm. 5% CO2

 Leitura     16 a 18h

 Controle de qualidade  H. influenzae   ATTC* 49247

                           H. influenzae ATTC* 49766
                           E. coli ATTC* 39218   NCCLS.M100 -S15, 2005
             Avaliação da Sensibilidade
                  Haemophilus spp

 Ágar Haemophilus Test Medium

 Inóculo          suspensão direta

 Incubação  35oC em atm. 5% CO2
                                                            +         –
 Leitura          16 a 18



O teste Positivo é preditivo de resistência à penicilina, ampicilina e amoxacilina
       Neisseria gonorrhoeae


 Suspeita de falência terapêutica
 Vigilância
 Estudos para orientar terapia empírica


                                   NCCLS.M100 -S15, 2005
“RESISTÊNCIA INTRÍNSECA”


                 CEFOXITINA
                 C. freundii
                 Enterobacter spp
                 Serratia spp

Amp/A.clavulânico e Amp/sulbactam
        Citrobacter spp
        Enterobacter spp
        Serratia spp       Man Clin Microb, 7ªedição, 1999
   “RESISTÊNCIA INTRÍNSECA”

       Enterobacteriaceae

                  Citrobacter freundii
                  Enterobacter spp
                  M. morgani
CEFALOTINA        P. vulgaris
                  P. penneri
                  Providencia spp
                  Serratia spp
                  Yersinia enterocolitica
                            Man Clin Microb, 7ªedição, 1999
  “RESISTÊNCIA INTRÍNSECA”

      Enterobacteriaceae

                    Citrobacter freundii
                    Enterobacter spp
                    Klebsiella spp
                    M. morgani
                    P. vulgaris
AMPICILINA          P. penneri
                    Providencia spp
                    Serratia spp
                    Yersinia spp
                          Man Clin Microb, 7ªedição, 1999
             Perfis encontrados nos testes de
               sensibilidade que requerem
               nova avaliação da amostra.
Microrganismos             Perfil de sensibilidade a ser investigado

Enterobacteriacea          Resistência a carbapenems

E. coli e K. pneumoniae    Resistência às cefalosporinas de 3ª geração
                           ou monobactans

P.aeruginosa e A.baumannii Resistência à polimixina

S. maltophillia            Sensibilidade aos carbapenems e/ou
                           resistência ao sulfam/trimetoprim

N. meningitidis            Resistência à penicilina

N. gonorrhoeae             Resistência à ceftriaxona
                                               Man Clin Microb, 7ªedição, 1999
               Testes de Sensibilidade a
                   Antimicrobianos


 A avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos representa
  uma das tarefas mais importantes do laboratório de
  microbiologia.

 O constante aparecimento de novos mecanismos bacterianos
  de resistência e novos antimicrobianos tornam os testes cada
  vez mais complexos

 É necessário uma atualização constante dos protocolos e a
  freqüente implementação de novos testes e metodologias.

 Microbiologistas, patologistas clínicos e médicos assistentes
  são obrigados a estarem em constante atualização
Muito obrigada!




              Antonia Maria de Oliveira Machado
                 amachado-labc@dhsp.epm.br

								
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