MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES by oyFN0b0

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									       MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
                   méthodes préparatives et/ou séparatives



DEPROTEINISATION
But
Elimination des protéines d’un milieu biologique complexe
Intérêt
Eviter l’interférence des protéines sur la méthode de dosage
              Trouble gênant la spectrométrie, la fluorimétrie
              Inhibition de réaction colorimétriques
Précipiter d’autres substances interférentes non souhaitées
Procédés
Physique : dénaturation par chauffage , précipitation puis ultrafiltration, dialyse
Immunologique :            précipitation sélective de complexe Ag-Ac
Chimique par déshydratation
                                        Alcools éthylique, méthylique, acétone
                                        Sels minéraux : sulfate d’ammonium, de sodium,
méthode appelée relargage qui évite la destruction de la structure spaciale des protéines
              par formation de sels insolubles
                                        en milieu neutre
sulfate de zinc, soude, baryte, mais absorption sur le précipité de substances non protéiques
contenues dans le milieu
                                        en milieu acide
acide trichloracétique, perchlorique, autres sels (picrates molybdates. ..)
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CENTRIFUGATION - SEDIMENTATION

Principe
Séparation des particules contenues dans un solvant
(cellules, organites subcellulaires, macromolécules)

Sédimentation
Résultante de l’effet de 2 forces : pesanteur, viscosité du milieu
Modifications de la sédimentation
     ralentissement : augmentation de la viscosité (dextran, ficoll)
     accélération : augmentation de la force de pesanteur = création d’une force
     centrifuge
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CENTRIFUGATION

Centrifugation
    Augmentation de la sédimentation proportionnelle au carré de la vitesse et au
    rayon de l’axe de centrifugation

Remarques
       Centrifugation horizontale ou oblique
       Vérifier la vitesse (surtout faible)
       Eviter la décélération brutale
       Récipients variables, volumes variables
       Possibilité  20000 g
       Réfrigération possible
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ULTRACENTRIFUGATION

Principe
Accélération élevée (> 100000g), température réfrigérée


Ultracentrifugation préparative
 Différentielle : mélange homogène  2 fractions (culot et surnageant)
 En gradients de densité
     Zonale : gradient de saccharose, séparation selon les coefficients de
     sédimentation
     Isopycnique : chlorure de césium, séparation selon la densité
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ULTRACENTRIFUGATION
Remarques :
 la forme du gradient est importante
Gradient linéaire  macromolécules, Gradient concave  lipoprotéines (flottation)
Gradient discontinu ou par paliers  cellules, organites subcellulaires, homogénats,
purification de virus, Gradient à paliers multiples
 la préparation est manuelle ou informatisée
 le remplissage est variable selon la nature du gradient
 la récolte des fractions se fait à la pipette ou par pompe
 l’analyse des fractions est discontinue ou en continu

Ultracentrifugation analytique
     Diffère de l’ultracentrifugation préparative par les résultats attendus
     Renseigne sur les caractéristiques physiques des molécules
     La migration est souvent suivie par stroboscopiecoût
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DIALYSE
Principe : séparation des substances selon leurs capacités à franchir une membrane de
     dialyse (porosité définie)
Membranes
     Cylindres allongés fermés à leurs extrémités
     Contiennent les substances à étudier
     Collodion ou cellophane, porosité : 2,4nm
     Variation possible de la porosité par étirement ou traitement chimique
Facteurs d’influence notion de temps de demi-dialysance
     Température
     Surface comparée au volume à analyser
     PH
Méthodes
     Préparation des membranes (conservation possible à 4°)
     Préparation des boudins de dialyse (fermeture, lestage)
     Changement du liquide de contre dialyse fréquent
     Adaptation des techniques au volume à analyser
Applications
     Dessalage, Concentration, Elimination de substances diffusibles
     Modification d’un pH
La dialyse
principe
modalités
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FILTRATION
Principe : sélection de substances par passage sur un filtre
Types de filtres
    En profondeur
          Nature : substances fibreuses (ammiante, cellulose,coton,verre)
                                                      agglomérées (verre frité, sable,
    charbon)
          Capacité de filtration (épaisseur, pression)
    Forme :          filtres papier plats ou plissés, filtres en fibre de verre, tubes
    filtrants, papier séparateur de phase, plaques fritées (filtration sous vide)
    Ecran
          Nature : nitrate de cellulose, chlorure de polyvinyle
          Marques : Millipore, Sartorius, Gellman
          Filtration par arrêt des particules à leur surface (préfiltration)
          Filtration stérilisante (rincer si application culture cellules, triton)
          Utilisation en cytologie (transparisation par huile d’immersion)
Principes                 Filtre en profondeur   Filtre écran
du filtre en profondeur
et du filtre écran




  Filtres en profondeur
Principe de montage
d’un filtre écran




  Exemples de filtres écran
  Unités Millex
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ULTRAFILTRATION
Principe : séparation des substances selon leur taille moléculaire
            Les membranes jouent le rôle de filtre écran au niveau moléculaire
Méthodes
Membranes (250 à 500 mm)
utilisées dans des cellules d’ultrafiltration (les plus utilisées = Diaflo)
Pression par azote ou centrifugation
Applications : concentrations de molécules, élimination de substances de faible
      PM, étude de la liaison macro-micromolécules, isolement de virus, suivi
      dechromatographie sur colonne

Filtres à membranes capillaires (25mm)
      4 types : HFU, HFD, HFO, HFG
      Montages en macrotubes, bécher, microbécher, microtube en T
      Précautions d’utilisation : rinçage, préfiltration millipore, température, pH,
      pression, solvants organiques, rinçage avant recyclage
      Applications : dessalage, concentration de liquides biologiques (CaCl2,
      PEG)
Ultrafiltration sur filtres
à membranes capillaires




Types de montages




Types de fibres capillaires
HFU : hollow fiber filtration                       PM >
30000
HFD : hollow fiber dialyse              PM > 5000
HFO : hollow fiber osmose               PM > 200
HFG : hollow fiber pour gaz             gaz

 Applications
 Dessalage, concentration de liquides biologiques
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CHROMATOGRAPHIE
Définition
Difficile, ensemble de méthodes basées sur des principes physiques différents.
Description
Méthode de séparation de composés fondée sur l’entraînement de ces composés par
une phase mobile, appelée éluant ou solvant ces composés étant séparés les uns
des autres par des interactions plus ou moins fortes une phase fixe ou stationnaire

Points communs :      utilisation d’un support (poudre très fine en grains, ou solide
           percé de canalicules  surface importante
                      la substance à analyser circule dissoute dans un solvant
                      convenable entre les particules du support ou les microcanalicules
                      il se crée des interactions physiques entre les particules du
                      support et la substance à analyser (van der Waals, polaires).
Les liaisons sont rapides et réversibles ; elles dépendent de la nature chimique des
substances et donc permettent leur séparation.
Classification
Plusieurs types de classification sont possibles : selon la nature des phases, selon les
mécanismes moléculaires mis en jeu ou selon les technologies pratiques mises en
œuvre. La description d’un procédé fait appel à toutes ces classifications qui sont
complémentaires
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CHROMATOGRAPHIE
Mécanismes moléculaires
Ils sont au nombre de 5 selon la nature des forces
Ils sont utilisés séparément ou en association

Adsorption :          liaisons hydrogènes ou de Van der Waals
                      cas particulier des liaisons hydrophobes (phase greffée)

Echange d’ ions :     le support est composé de molécules chargées
                      Si charges + échange d’anions
                      Si charges -  échange de cations

Filtration en gel :   support = tamis moléculaire - mbilles ou msphères calibrées de
            matière poreuse
                      Grosses molécules exclues du gel

De partage :          solvant au moins binaire : eau et toluène ou gaz et liquide
                      Séparation selon coefficient de partage entre phase mobile et
           phase stationnaire

D’affinité : support spécifique - utilise la liaison enzyme-substrat ou Ag-Ac
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CHROMATOGRAPHIE
Dispositifs

Chromatographie sur colonne en phase liquide
    Support de chromatographie
    Solvant de dilution de la substance à analyser (stationnaire)
    Solvant d’élution (mobile)
    Pression variable (basse, moyenne = 10 bars, haute >30 bars)
    Analytique, préparative ou gaz-liquide
Chromatographie papier
    Feuille de papier filtre placée verticalement en enceinte fermée imprégnée de vapeur
    d’eau
    Solvant organique ascendant ou descendant
    Séparation des substances entre eau et solvant
    Révélation des « taches »
Chromatographie couche mince = variante
    (couche de support sur verre)

Choix des méthodologies
selon substances et but à atteindre
chromatographie
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ELECTROPHORESE

Principe :     déplacement de molécules chargées dans un champ
               électrique continu

Facteurs
               Temps de migration,
               Force ionique du tampon
               Température
               Courant électrique continu
               Forces de freinage
               PH du tampon (important si substances amphotères)
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ELECTROPHORESE
Méthodes
sur papier
basse tension : protéines, révélation par colorants généraux ou spécifiques
haute tension : petites molécules
en esters de cellulose
matrice homogène, séparation rapide (voltage élevé 30v/cm)volume échantillon petits
protéines
en gel d’agarose
grande porosité : molécules haut PM et complexe supramoléculaires
(mmunoélectrophorèse, électrofocalisation)
en gel d’amidon
effet tamis marqué, séparation en fonction de taille et charge (20v/cm)
 : protéines (inconvénient quantité <.10mg)
en gel de polyacrylamide
séparation selon charge et poids, verticale ou horizontale
réticulation modifiable (% acrylamide)
analytique et préparative (isofocalisation ou isotachophorèse)
+ agents dénaturants (urée ou SDS, analyse de structure)
Électrophorèse
principe
méthodes
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Electrofocalisation
      séparation des protéines en fonction de leurs points isoélectriques
utilise des gradients combinés densité-ph, mélange de produits par intervalles
      de pH , grand pouvoir de résolution
utilisable en milieu liquide, en gel de polyacrylamide, en gel granité
Electrophorèse en 2 dimensions
      Association de électrofocalisation et électrophorèse en SDS
      Méthode très résolutive, analyse qques milliers de protéines
      Lecture des résultats par analyse d’image
Isotachophorèse
      Séparation des ions (différence de mobilité en milieu electrolytique
      discontinu. Méthode séparative si support en gel granulé
Immunophorèse
      Combinaison des méthodes
Electrophorèse en champ pulsé
      Appliquée à l’étude du génome (séparation de ADN haut PM)

								
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