41 - Download as DOC

Document Sample
41 - Download as DOC Powered By Docstoc
					4.1) Maturation des ARNs (splicing, ribozymes, RNA editing)

La maturation des ARNm chez les eucaryotes
Les hnRNP et l'ARN hétérogène (hnRNA)
Le produit initial de la transcription par l'ARN pol II, le transcrit primaire, subira plusieurs
modifications avant d'être exporté du noyau vers le cytoplasme. Ce transcrit se retrouve associé
à de multiples protéines dans le noyau, sous la forme de hnRNP (heterogenous nuclear
ribonucleoprotein particle). Le transcrit primaire est aussi appelé hnRNA (heterogenous nuclear
RNA). Les protéines formant le hnRNP se lient à l'ARN avec une grande affinité et une grande
spécificité. Tout comme pour les facteurs transcriptionnels, les protéines des hnRNP possèdent
une architecture modulaire, ayant un ou plusieurs domaines de liaison à l'ARN de même que
des domaines d'interaction avec d'autres protéines. Quoiqu'il y ait peu d'évidences
expérimentales, plusieurs rôles peuvent être associés aux protéines hnRNP. Elles empêcheraient
la formation de structures secondaires de façon à ce que l'ARN puisse interagir avec d'autres
macromolécules, une fonction similaire à celle des Ssb (single strand binding protein) pour l'ADN
lors de la réplication. Des évidences supportant cette fonction proviennent d'expériences
d'hybridation entre ARN complémentaires où la présence des protéines hnRNP accélère la
vitesse de réassociation. Elles auraient aussi un rôle dans l’épissage des exons. Certaines
protéines hnRNP vont et viennent entre le compartiment nucléaire et le cytosol, impliquant ces
dernières dans le transport des ARNm.
La coiffe en 5'

  La première modification affectant les transcrits primaires des eucaryotes est l'addition d'une
coiffe en 5' (5'cap). La coiffe en 5' est formée par l'ajout d'une guanosine (G) dans une liaison
inhabituelle 5'5', immédiatement après le début de la transcription. Une enzyme localisée dans
le noyau, la guanylyl transférase, catalyse l'ajout de la guanine alors qu'une guanine-7-
méthyltransférase ajoute un groupement méthyl en position 7 pour former la 7-méthyl-guanosine
(m7G). La coiffe est impliquée dans la protection du messager contre la dégradation, dans
l'initiation de la traduction (la coiffe est reconnue par le facteur eIF4f), de même que dans le
transport des ARNm vers le cytoplasme. Pour les messagers d'eucaryotes unicellulaires, seule la
m7G est produite. Une fois dans le cytoplasme, d'autres méthylations pourront se produire de
façon à donner une coiffe de type m2,2,7G. La méthylation additionnelle de la coiffe m2,2,7G se
produit sur les deux premiers nucléotides, en position 2' du ribose, et non pas sur la guanine, qui
n'est méthylée qu'une seule fois . L'implication de la coiffe dans le transport des ARN vers le
cytoplasme a été démontrée sur les petits ARN nucléaires (snARN) impliqués dans l'épissage des
introns. Les snARN U1, U2, U4 et U5 sont synthétisés par l'ARN pol II et possèdent une m7G en
5'. Ils sont exportés vers le cytoplasme où ils sont assemblés en snRNP et retournent au noyau.
Le snARN U6 est synthétisé par l'ARN pol III, ne possède pas de coiffe et n'est pas exporté
vers le cytoplasme. Si l'on place maintenant dans une construction d'ADN le gène U1 sous le
contrôle du promoteur de U6 (pol III), non seulement ne possèdera-t-il pas de coiffe, mais il ne
sera pas exporté vers le cytoplasme.
La polyadénylation des ARNm

  Dans les cellules eucaryotiques tous les ARNm, à l'exception des ARNm codant pour les
histones, possèdent une queue de poly (A) à leur extrémité 3'. La queue de poly (A) n'est pas
codée dans le génome et elle est produite de façon post-transcriptionnelle par un clivage
endonucléolytique au site de polyadénylation. Ce site est généralement précédé d'une séquence
de reconnaissance dont la séquence consensus est AAUAAA et située environ de 10 à 35 pb en
amont du site de polyadénylation. Le clivage endonucléolytique produit une extrémité 3' OH qui
servira d'amorce à la poly- A-polymérase (PAP) pour la synthèse d'une queue de 200
à 250 adénosines. Le mécanisme qui contrôle la longueur de la queue de poly (A) est inconnu. La
queue de poly (A) tant des hnARN que des ARNm est liée par une protéine, la PABP (poly (A)-
binding protein) pour les ARNm et la PABII pour les hnARN. Un monomère de PABP se lie à tous
les 10 à 20 A. L'extension C-terminale de l'ARN pol II, la queue CTD est importante pour
l'épissage, la terminaison de la transcription et la formation de l'extrémité 3' de l'ARNm
mature. La queue CTD permettrait le recrutement des facteurs nécessaires au clivage du pré-
ARNm après le signal de polyadénylation (AAUAAA).
La maturation des ARNr chez les eucaryotes

  Environ 80% des ARN totaux dans une cellule sont des ARNr. Les ARNr 28S et 5.8S associés à
la grosse sous-unité ribosomale (60S), de même que l'ARNr 18S associé à la petite sous-unité
(40S) sont transcrits par l'ARN pol I, sous la forme d'un long précurseur de 45S d'une longueur
de ≈13.7 kb chez les eucaryotes supérieurs. Ce transcrit primaire doit alors être maturé pour
libérer ses composantes individuelles. La maturation implique, tout comme pour l'épissage, la
présence de snARN, appelés des snoARN (sno pour small nucleolar) qui se retrouveront associés
à des protéines pour former des snoRNP. En plus des maturations, le pré-ARNr subit aussi plus
de 100 méthylations sur des bases ou des riboses spécifiques. Ces modifications impliquent aussi
des snoARN. La synthèse et la maturation des ARNr, de même que la formation des ribosomes
s'effectuent au niveau du nucléole, une région discrète du noyau eucaryotique créée par la
transcription des gènes d'ARNr ; ne pas oublier l'organisation en tandem des unités de pré-
ARNr). Le pré- ARNr joue en fait le rôle d'organisateur nucléolaire. La présence du pré- ARNr
"attire" les autres composantes nécessaires à la formation du ribosome.
L'ARN 5S, qui fait aussi parti de la sous-unité 60S est quant à lui transcrit par l'ARN pol III. La
synthèse et la maturation des pré-ARNr 5S a lieu dans le nucléoplasme et non pas au niveau du
nucléole. Une fois synthétisé et maturé, l'ARN 5S migre vers le nucléole où il est assemblé avec
la sousunité 60S.
La queue poly (A) et la coiffe affectent la stabilité et la traduction des ARNm

  La quantité de protéines produites à partir d'un ARNm dépendra entre autres choses de sa
longévité dans la cellule, ou autrement dit, de sa stabilité. L'ARNm devra donc être protégé
contre l'action des exonucléases présentes dans la cellule et qui auront pour rôle d'éliminer les
ARNm dont la cellule n'aura plus besoin. La coiffe et la queue de poly (A) sont deux barrières
naturelles contre l'action des exonucléases agissant dans la direction 5'3' ou 3'5'. Lorsque
liée aux protéines PABP, il semble que la queue de poly (A) puisse protéger les messagers contre
la dégradation. La polyadénylation initiale des ARNm est effectuée dans le noyau et comporte
l'addition d'environ 200 adénines. Une fois dans le cytoplasme, la queue de poly (A) est
graduellement dégradée. Par contre, des queues de taille inférieure à 30 A ne sont pas
observées, suggérant que 30 A est la longueur minimale requise pour la stabilité des ARNm.
L'élimination de la queue de poly (A) inhibe l'initiation de la traduction in vitro et l'absence de
protéines PABP a le même effet in vivo chez la levure. La présence des PABP sur la queue de poly
(A) est aussi postulée être capable de favoriser la réinitiation de la traduction en rapprochant
dans l'espace la grosse sous-unité ribosomale après la terminaison de la traduction et une petite
sous-unité liée au codon d'initiation du même ARNm. La présence d'une queue de poly (A) à
l'extrémité 3' des messagers est une caractéristique bien utile puisqu'il sera donc possible de
purifier les ARNm par chromatographie d'affinité sur une colonne remplie de billes couplées à un
polymère d'oligo (dT).




La présence des introns et l'épissage

  La présence des introns fut mise en évidence par des expériences d'hybridation ARNm/ADN
génomique visualisées par microscopie électronique. La présence de boucles dans l'ADN
génomique ne s'hybridant pas avec le messager correspondant permit d'émettre l'hypothèse
qu'il y avait des régions qui ne se retrouvaient pas dans l'ARNm mature, quoiqu'étant colinéaires
dans le fragment génomique. La comparaison des séquences des ARNm (sous forme d'ADNc) avec
les séquences génomiques correspondantes a permis de découvrir qu'il y avait effectivement des
régions non-codantes intercalées, qui séparaient les gènes en introns et en exons et qui devaient
être enlevées des transcrits primaires avant leur exportation vers le cytoplasme pour y être
traduits. Un gène typique de mammifère contiendra de 7 à 8 exons (donc de 6 à 7 introns)
répartis sur ≈16 kb et produira un messager ≈2.2 kb. Le mécanisme par lequel les introns sont
enlevés des transcrits primaires et par lequel les exons sont réunis s'appelle l'épissage ( splicing).
Le complexe ribonucléoprotéique (incluant plusieurs snARN) nécessaire pour effectuer ce travail
est communément appelé le spliceosome. La localisation précise des introns par la comparaison
des séquences des ARNm et de l'ADN génomique correspondant a permis de dégager certaines
régions conservées dans les séquences des introns. La bordure 5' de l'intron est presque
toujours GU, alors que la bordure 3' est AG, d'où la règle GU-AG




(ou GT- AG lorsque l'on considère l'ADN) des bordures des introns. On appelle aussi la bordure
5' (GT), le site donneur et la bordure 3' (AG), le site accepteur. Les nucléotides adjacents à GU
et AG sont aussi plus ou moins conservés. De plus, entre la bordure 3' et l'adénine du site de
branchement, on retrouve une région riche en pyrimidines. L'absence de complémentarité entre
les extrémités des introns exclut un mécanisme simple d'épissage qui aurait passé par la
formation d'une structure secondaire permettant de rapprocher dans l'espace les sites donneurs
et accepteurs. L'analyse des intermédiaires de la réaction a permis de déterminer le mécanisme
de l'épissage. L'excision de l'intron et la réunion des exons passent par deux réactions de
transestérification.




L'épissage peut être divisé en trois étapes:

(1) Coupure de l'extrémité 5' par une attaque endonucléolytique de l'extrémité 2' OH du ribose
de l'adénine du site de branchement sur le phosphate 5' de la guanine du site donneur GU. C'est
la première transestérification. Ceci provoque la formation du lasso. Le premier exon est alors
"libre", quoique toujours associé au spliceosome.
(2) Coupure de l'extrémité 3' par une attaque du groupement 3' OH libre de l'extrémité du
premier exon sur le groupement phosphate 5' de la première base du second exon. C'est la
deuxième transestérification. Elle permet la ligation des 2 exons. L'intron avec sa structure en
forme de lasso est alors libéré.




(3) La liaison au site de branchement formant le lasso est alors coupée (débranchement) et
l'intron redevient entièrement linéaire. L'intron est ensuite dégradé. Le site de branchement est
assez bien conservé chez la levure (UACUAAC), alors que chez les eucaryotes supérieurs, il ne
l'est pas, sauf pour une préférence assez nette pour une région se conformant à la suite
Py80NPy80Py87Pu75APy95 (où Py spécifie une pyrimidine, C ou U, et Pu spécifie une
purine, A ou G). Le site de branchement est situé de 18 à 40 nt de l'extrémité 3' de l'intron. La
mutation ou la délétion du site de branchement empêche la réaction d'épissage chez la levure. Le
rôle du site de branchement semble donc celui de choisir l'extrémité 3' la plus proche qui servira
à l'épissage et à sa ligation avec l'extrémité 5'.




Le rôle des snARN durant l'épissage

  Les petits ARN nucléaires (snARN, Small Nuclear RNA) jouent un rôle primordial lors de
l'épissage, soit celui de la reconnaissance des jonctions 5' et 3', de même que du site de
branchement. Les snARN sont de petits ARN de 100 à 300 nt chez les eucaryotes supérieurs et
certains atteignent 1 kb chez la levure. Ils se retrouvent sous la forme de snRNP, c. à d. associés
à des protéines spécifiques. Un snRNP contient généralement un snARN et ≈10 protéines
associées. Le snARN U1 possède une région complémentaire au site donneur (l'extrémité 5'). Le
snARN U2 possède une région complémentaire au site de branchement. Les snARN U4 et U6
s'apparient ensemble et forme un complexe avec le snARN U5. Le snARN U6 forme aussi un
appariement différent cette fois avec le snARN U2. Les snARN interagissent donc non
seulement avec le pré-ARNm, mais aussi entre eux, par la complémentarité de certaines de leurs
régions. L'interaction des snRNP avec l'intron suit une séquence stricte, mettant en
évidence les interactions entre les différents snRNP. En plus des snRNP, le spliceosome est aussi
constitué de plusieurs protéines additionnelles appelées facteurs d'épissage. On estime qu'une
centaine de protéines au total participent à l'épissage ce qui rend ce processus d'une complexité
comparable à l'initiation de la transcription ou la synthèse protéique.




L'épissage en trans

 Nous avons vu précédemment que l'épissage opérait en cis, c. à d. que des régions contiguës,
séparées par un intron et faisant partie du même précurseur, étaient liées ensembles (épissées)
pour donner naissance au messager mature. Une autre forme d'épissage a été découverte chez
des organismes tels les trypanosomes, certains protozoaires euglénoïdes et le ver Caenorhabditis
elegans. Dans ce type d'épissage, l'un des exons, représentant la partie 5' de l'ARNm mature,
est ajouté à un autre exon. La particularité réside dans le fait que ces deux exons proviennent de
deux unités transcriptionnelles différentes, d'où le nom d'épissage en trans. Chez les
trypanosomes, tous les ARNm possèdent un mini-exon en 5' ajouté par épissage en trans et qui
semble important pour l'initiation de la traduction des ARNm. Plusieurs des unités
transcriptionnelles chez ce protozoaire sont organisées sous une forme polycistronique,
ressemblant de ce fait aux opérons bactériens. L'ajout en 5' de ce mini-exon sur chacun des
cistrons permet la formation de messagers individuels monocistroniques à partir d'un précurseur
plus long et à l'origine, polycistronique.
La maturation des ARNt chez les eucaryotes

  Les ARNt représentent environ 15% des ARN totaux d'une cellule et sont transcrits sous la
forme d'un précurseur par l'ARN pol III. Les ARNt cytoplasmiques contiennent de plus de
nombreuses bases modifiées que l'on ne retrouvent pas dans le transcrit primaire. Certains ARNt
contiennent même de courts introns, comme l'ARNt Tyr de levure, qui contient un intron de 14
pb! Ces introns ne suivent pas la règle GT-AG et les exons sont épissés par un mécanisme
différent de celui opérant chez les pré-ARNm. Les pré-ARNt comportent tous une extension en
5' de longueur variable qui sera enlevée par la ribonucléase P (RNase P), une enzyme
ribonucléoprotéique. En plus de l'épissage et du clivage en 5', ≈10% des bases des pré-ARNt sont
modifiées enzymatiquement. Trois types de modification sont connus: 1) le remplacement
de U à l'extrémité 3' par le triplet CCA que l'on retrouve chez tous les ARNt; 2) l'addition de
groupement méthyl et isopentényl sur certaines purines et la méthylation de certains riboses; 3)
la conversion de certaines uridines en dihydro-uridines, pseudo-uridines ou ribo-thymidines.
L'édition des ARN
L'édition des ARN ou RNA editing fut découverte en comparant les séquences d'ADN avec les
ARNm correspondants de certains gènes mitochondriaux de protozoaires et de plantes, de même
que chez certains gènes chloroplastiques. On y trouva des additions et des délétions importantes
de séries de U. Ces additions ont lieu de façon post-transcriptionnelle et modifient
extensivement l'ARNm. Chez les mammifères, une forme d'édition de l'ARN permet la
production de deux protéines à partir du gène de l'apolipoprotéine B (apo-B). Dans les
hépatocytes, la forme apo-B100 est exprimée, alors que dans l'épithélium intestinal, c'est la
forme apo-B48. Les deux formes proviennent d'un seul et même gène et sont identiques de l'aa
#1 à # 2152. La production de ces deux formes ne passe pas par un épissage de type alternatif,
mais plutôt par la modification post-transcriptionnelle d'un codon CAA en codon UAA dans le
messager, produisant ainsi un codon de terminaison. Cette modification est produite par une
enzyme (cytidine désaminase) qui reconnaît spécifiquement cette région et enlève le groupement
amino en position 4 de la cytosine (désamination oxydative) pour la transformer en uridine.




La forme la plus impressionnante d’édition des messagers se retrouve chez les mitochondries de
trypanosomes. Ces protozoaires parasites possèdent une seule grosse mitochondrie appelée
kinétoplaste. Plusieurs des précurseurs d’ARN sont extensivement modifiés soit par l’addition de
bases, soit par la délétion de bases de façon à rendre fonctionnel l’ARN. La copie d’ADN dans le
génome du kinétoplaste est donc imparfaite et doit être corrigée pour produire un ARN et donc,
une p r o t é i n e fonctionnelle. Cette forme c o m p l e x e d’édition se retrouve chez les
trypanosomes les plus primitifs et pourrait représenter une relique moléculaire (un fossile!) de la
machinerie de synthèse des ARN durant une phase précoce de l’évolution de la cellule. Comme
l’ADN codant pour ces gènes n’est pas fonctionnel sans les modifications apportées à l’ARN, la
machinerie d’édition a été conservé au cours de l’évolution de ces organismes. Les modifications
sur le transcrit primaire nécessitent un ARN guide
qui va s’apparier aux régions à modifier par complémentarité et guider le complexe d’édition.

				
DOCUMENT INFO
Shared By:
Categories:
Tags:
Stats:
views:6
posted:12/11/2011
language:French
pages:15