Utilizaci�n de T�cnicas Moleculares en la Identificaci�n by UtR7cvEB

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									Utilización de Técnicas
           Moleculares
                    en la
       Identificación de
Organismos Patógenos



         Lcdo.Gualberto Ortiz, MT (ASCP)
   Reconocer las limitaciones actuales en el
    diagnóstico de patógenos

   Presentar las técnicas moleculares
    desarrolladas

   Presentar ejemplos específicos
    actualmente en uso




Objetivos
1.   Tratamiento

2.   Control de Infección

3.   Epidemiología

4.   Investigación Científica y Educación




Debemos Identificar el Patógeno ?
   BACTERIOLOGIA           PARASITOLOGIA

Inocular Medios              Preparar material :
                             feces, tejido,orina,etc
Tinción
                             Tinción : Yodo ,Gram,
Morfología :                     Giemsa ,Gomori
 colonia
 celular                     Encontrar el parásito:
                                 trofozoito,larva,
                                 quiste, huevo,
Reacciones Bioquímicas           proglótido




“Gold Standard” de Identificación
BACTERIOLOGIA                PARASITOLOGIA

   Contaminación del           Encontrar el parásito
    inóculo
                                Parásitos cuya
   Técnicas de cultivo no       morfología no se
    disponibles o no             distingue
    prácticas
                                Parásitos escondidos en
   Dependientes de              el tejido
    tiempo (24 – 48 hrs,
    días, semanas)              Baja sensitividad

Problemas con Métodos
Tradicionales
Xenodiagnóstico
Análisis Tradicional de Chaga
PERSONAL ALTAMENTE
           DIESTRO
           ! ! !!
¿Los puedes reconocer?
Tendremos la
SOLUCION ??
     TAL VEZ …………..
   1.    Bioquímico


        2.    Inmunológico


             3.   Acidos Nucléicos ( N A A T )




Análisis Molecular
   ISOENZIMAS
                          Traducidas por el
                            código genético
Igual FUNCIONALIDAD
                          POR TANTO :
Pero : diferente patrón    Diferente patrón
 de movimiento en          representa un
 gel electroforético       organismo
                           geneticamente
                           distinto

1. Diagnóstico Molecular
           Bioquímico
Análisis Isoenzimático de
Enfermedad de Chaga
   Variedad de enzimas

   Múltiples muestras tipificadas

   Técnica sencilla de electroforesis

   Capacidad de distinción entre especies
    cuya morfología es muy similar


Ventajas Análisis Bioquímico de
Enzimas
   Diagnóstico erróneo : enzimas lábiles

   Técnica simple pero equipo costoso

   Casos de utilización de tejido :
    i.e. Leishmaniasis (hígado,bazo),
    Pneumocystis (pulmón)

   Tiempo de análisis



Desventajas
Basado en la Id de Ab’s   Específicos




2. Diagnóstico Molecular
       Inmunológico
Diag Molecular basado en Ab’s
CATT = Card Agglut Test for Typanosoma ( Anti-Tryp IgM)
 1.

          2.

               3.




Malaria
Inmunodiagnóstico Enf de Céstodos
Rx de proteínas específicas de cysticercosis
Ventajas                   Desventajas

   Muestreo No-Invasivo      Desarrollo de técnica
       saliva , heces          es caro –
       fecales                 investigación previo
                               comercialización
   Especificidad/Sens :      No distingue
    Ig subclases
                               organismos
                               morfologicamente
   Rapidez, Muestreo de
    campo                      similares



Diag basado en Ab’s
       Sondas de DNA o R N A
                (Southern, Northern)

       PCR    ( Reacción de Polimerasa
                en Cadena)

       FISH – Utiliza fluoróforos



3. Diagnóstico molecular basado
    en D N A
   COMPLEMENTARIEDAD de las BASES

 Amplificación de secuencias específicas
  (aumento en sensitividad )
 Utilización de trazas de material (biopsia)
 DNA genómico es constante – patógeno y
  huésped tienen un genoma secuencial
  único




Técnicas de Biología Molecular
Diagnóstico               .
Veterinario
  Eimeria – protozoario
  Southern Blot :
 - utiliza sondas de
         RNA ribosomal
 - requiere mcg de DNA

  PCR : identificación
             de 500 pb
Usa 1 pg DNA - <10
 oocysts



Ejemplos
   ANALISIS MICROSCOPICO
       50,000 oocyst / gm de feces


PCR
  - amplifica secuencia de 400 pb

     - suficiente con 6 oocyst / gm de feces



Cryptosporidium parvum
   Virología               Microbiología
        Enterovirus/         MRSA
        Parechovirus             detección de
                             complejo genético :
       Chikungunya               CCR
       (nuevo virus)             mecA gene

       Mumps-Paperas
    -aún en individuos
    inmunizados


PCR
   Costo Elevado : PCR

   Contaminación y falsos positivos

   Utilización de radioactividad – se están
    desarrollando nuevos fluoróforos

   En el caso de parásitos – las sondas de
    DNA no distinguen si esta vivo o muerto



Desventajas
 La ciencias de laboratorio clínico han
  entrado en una nueva era
 La información genética y los mecanismos
  moleculares son capaces de ser precisos
  en dx enfermedades e identificar
  patógenos
 La nueva tecnología molecular requiere :
   nuevas herramientas, justificar costos,
  adiestrar personal y mercadear servicios


Conclusión

								
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