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									     COMPARACÃO ENTRE DUAS METODOLOGIAS DE IDENTIFICAÇÃO DE
BACTÉRIAS ÁCIDO LÁCTICAS COM ATIVIDADE ANTI Listeria monocytogenes.

       Silveira, A.O. , Carro, S. , Rosa, L.S. , Zocche, F. , Jantzen, M.M.; Ludtke,C.B.;Soares, G.
                                          J.D., Silva, W.P.
      FAEM-UFPEL/Deptº. Ciência e Tecnologia Agroindustrial-Campus Universitário - Caixa Postal,
                             354 – CEP 96010-900 - Pelotas/RS, Brasil

                                       andressa@ufpel.tche.com



                                          1.INTRODUÇÃO

        As bactérias ácido lacticas (BAL) podem ser caracterizadas como bactérias
microaerofilicas, gram-positivas, não esporuladas, cujo principal produto da
fermentação de carboidratos é o lactato. As primeiras classificações taxonômicas de
BAL baseavam-se na fermentação de diferentes açúcares, produção de gás,
morfologia da colônia, tolerância ao oxigênio e temperatura ótima de crescimento, as
quais ainda vem sendo utilizadas, devido a sua grande praticidade [1]. Os principais
gêneros de BAL são: Streptococcus, Lactococcus (grupo N de Streptococcus),
Enterococcus (grupo sorológico D de Lancefield), Vagococcus, Lactobacillus,
Pediococcus, Leuconostoc e Carnobacterium, os quais, além de auxiliarem
envolvidos na preservação, também são responsáveis pelas características
sensoriais dos produtos lácteos fermentados [4]. A metodologia proposta por
Schillinger e Lücke [5] para diferenciação de gêneros de BAL é a mais clássica, sendo
baseada na diferenciação através de fermentação de glicose, produção de gás,
hidrólise de arginina, morfologia e crescimento bacteriano em diferentes temperaturas
e concentrações de sais. Um método mais moderno e mais prático é o API 20 Strep,
um sistema padronizado que associa 20 testes bioquímicos com elevado poder
discriminatório, permitindo um diagnóstico para a maioria das espécies de
estreptococos, enterococos e outros microrganismos relacionados geneticamente.
        Neste trabalho objetivou-se comparar duas metodologias diferentes para
identificação de BAL com poder inibitório frente a L. monocytogenes.


                               2. MATERIAL E MÉTODOS

       Dez amostras de queijos produzidos de forma artesanal, foram coletadas em
diferentes estabelecimentos da região de Pelotas, armazenadas em recipientes
estéreis, e mantidas a 4°C em caixas isotérmicas até o momento de análise no
laboratório de Microbiologia de Alimentos do Departamento de Ciência e Tecnologia
de UFPel. Dessas amostras foram identificados 11 isolados de BAL, selecionados por
seu antagonismo frente a Listeria monocytogenes Scott A (microrganismo indicador)
mediante o método direto “spot on the lawn”, em ágar Mann, Rogosa e Sharpe (MRS)
(Acumedia ®) com sobrecamada de ágar contendo L. monocytogenes, segundo
Lewus e Montville [3]. A triagem dos isolados realizou-se mediante coloração de
Gram, teste de catalase e caracterização microscópica. Posteriormente, os isolados
foram submetidos a identificação através do diagrama proposto por Schillinger e
Lücke [5] (Figura 1) e pelo sistema API 20 Strep BioMérieux®. Nos testes para
produção de gás utilizou-se caldo composto de 1% de proteose peptona, 0,5% de
extrato de levedura e 1% de glicose, tendo como indicador de pH, púrpura de
bromocresol e tubos de Durham para verificar a produção de gás. Nos testes de
crescimento a 15°C e 45°C utilizou-se o caldo MRS.

              Bactéria Ácido Lactica: gram positiva, catalase negativa

                           -              Gás a partir de glicose

                                                             +      Arginina        -

          Cocos                            Bastonetes    Lactobacillus    D Lactato DL
                                                                    Cocos              Bastonetes
+       Tétrades               -         Lactobacillus
                                      (Homofermentativos)           Leuconostoc   Lactobacillus

Pediococcus   -        45°C           +     -                 +
                                                   15°C
          +   10°C     -    - 6,5%        + Termobacterium Streptobacterium
                               NaCl
    Lactococcus    Streptococcus Enterococcus



      Figura 1 Identificação de bactérias ácido lácticas pelo diagrama de Schillinger
               e Lücke [5]

        O sistema API 20 Strep é um kit formado por uma galeria com 20 microtubos
contendo substratos desidratados, utilizados para a detecção de atividades
enzimáticas e fermentação de açúcares. Os testes enzimáticos foram realizados com
uma suspensão bacteriana densa a partir de uma cultura pura, a qual reconstitui os
meios desidratados para, após a incubação traduzir viragens de cor espontaneamente
ou pela adição de reagentes. Os testes de fermentação de açúcares foram realizados
em meios adicionados de indicador de pH. Realizou-se a leitura de acordo com as
indicações do fabricante e a identificação foi feita com um programa de software da
BioMérieux®. A análise estatística dos resultados foi realizada a partir do software
Statistica 6.0 no módulo “Basic Statistics and Table–Other Significance Tests”.


                                   3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

       Na Figura 1 é mostrado o esquema, Schillinger e Lücke [4], utilizado para a
diferenciação de gêneros de BAL, o qual baseia-se na avaliação de características
facilmente determináveis, permitindo a identificação de alguns gêneros de BAL. Os
resultados obtidos a partir desses testes morfofisiológicos são apresentados na
Tabela 1. Os gêneros/espécies identificados através do diagrama de Schillinger e
Lücke [5] e do Sistema API 20 Strep estão descritos conforme na Tabela 2. Através do
sistema API 20 Strep, 62% (8/11) das bactérias testadas foram identificadas como
Enterococcus, entretando, 54,5% (6/11) destas, foram identificadas como
pertencentes a esse gênero, pelos testes morfofisiológicos. Embora o sistema API 20
Strep tenha apresentado um maior poder de discriminação, não se constatou
diferença significativa (p = 0,7079) para um nível de significância de  = 5,0%, em
relação a metodologia proposta por Schillinger e Lücke [5], corroborando assim, a
validade de utilização desta técnica clássica. Das BAL isoladas, 45,5% (5/11)
pertenciam ao gênero Streptococcus, através de provas morfofisiológicas, no entanto,
pelo sistema API 20 Strep nenhuma delas pertencia a esse gênero bacteriano.
Conforme esta última metodologia, 18,2% (2/11) desses isolados foram classificados
como Lactococcus lactis lactis e 27,3% (3/11), como Enterococcus (Tabela 2).
Verificou-se diferença significativa (p = 0,02) com um valor de  = 5,0% entre as duas
metodologias na identificação do gênero Streptococcus.

 Tabela 1 Caracterização de bactérias ácido lácticas com atividade anti Listeria
monocytogenes por testes morfofisiológicos.
                                                         Crescimento
Isolado BAL*  Morfologia
                          Gram Catalase Gás 45°C
              da colônia                                    10°C    NaCl 6,5%

     04           Coco         +         -       -      +          -           +
     08           Coco         +         -       -      +          -           +
     12           Coco         +         -       -      +          -           +
     15           Coco         +         -       -      +          -           -
     16           Coco         +         -       -      +          -           -
     17           Coco         +         -       -      +          -           -
     18           Coco         +         -       -      +          -           -
     19           Coco         +         -       -      +          -           +
     20           Coco         +         -       -      +          -           +
     22           Coco         +         -       -      +          -           +
     26           Coco         +         -       -      -          -           -
* número do isolado de BAL

Tabela 2 Identificação de bactérias lácticas com atividade anti               Listeria
       monocytogenes por testes morfofisiológicos e sistema API 20 Strep.
Isolado BAL* Testes Morfofisiológicos          API 20 Strep
      04       Enterococcus spp.               Enterococcus faecalis
      08       Enterococcus spp.               Enterococcus faecalis
      12       Enterococcus spp.               Lactococcus lactis lactis
      15       Streptococcus                   Lactococcus lactis lactis
      16       Streptococcus                   Enterococcus avium
      17       Streptococcus                   Enterococcus faecalis
      18       Streptococcus                   Enterococcus faecalis
      19       Enterococcus spp.               Enterococcus avium
      20       Enterococcus spp.               Enterococcus durans
      22       Enterococcus spp.               Enterococcus faecalis
      26       Streptococcus                   Lactococcus lactis lactis
* número do isolado de BAL

       É interessante ressaltar que o sistema API Strep permitiu a discriminação em
nível de espécie, com 45,5% (5/11) dos isolados identificados como Enterococcus
faecalis, 18,2% (2/11) como Enterococcus avium, 9% (1/11) como Enterococcus
durans e 27,3% (3/11) como Lactococcus lactis lactis (Tabela 2).
       A crescente utilização de técnicas moleculares tem promovido significativas
contribuições com alterações taxonômicas dos microrganismos. Por isso, bactérias
que antes eram incluídas em um determinado gênero, hoje com as evidências
genéticas baseadas em estudos de hibridização de DNA-DNA e DNA-rRNA se
encontram reclassificadas em outros gêneros e até mesmo, novos gêneros estão
sendo criados [6]. Desta forma, as diferenças nos resultados entre as duas
metodologias podem ser explicadas por alterações na nomenclatura utilizada no
diagrama de Schillinger e Lücke [5], já que além dos gêneros tradicionais de BAL
(Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y Streptococcus), tem sido incluídos neste
grupo os gêneros Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus y Vagococcus.
Destaca-se que nestes três gêneros se incluem cepas que antigamente eram
consideradas Streptococcus [2]. Atualmente, o grupo sorológico D de Lancefield
(Streptococcus avium, Streptococcus bovis, Streptococcus faecalis y Streptococcus
faecium) se encontra reclassificado dentro do gênero Enterococcus [7], o que pode
ser observado neste estudo com as colônias n° 16, 17 e 18, quando se utilizou o
sistema API Strep para a identificação. Verifica-se que a utilização do diagrama de
Schillinger e Lücke [5] para a identificação de Streptococcus deve ser considerada
com cuidado tendo em vista que, embora ainda existam dentro das BAL espécies
desse gênero, os cinco isolados foram classificados erroneamente como
Streptococcus por essa metodologia.

                                      4. CONCLUSÃO

O sistema API 20 Strep apresentou maior poder de discriminação para identificação
do gênero Enterococcus, embora não tenha havido diferença significativa em relação
à metodologia clássica proposta por Schillinger e Lücke [5].
O sistema API 20 Strep permitou a identificação das BAL em nível de espécie.

                         5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS


[1] CARR, F.; CHILL, D.; MAIDA, N. The latic acid acteria: a literature survey. Critical
Review in Microbiology, 28:281-370, 2002.
[2] JAY, J. Microbiología moderna de los alimentos. Ed. Acribia. 4ta. Edición. 638 p.
2002.
[3] LEWUS, B.C.; MONTVILLE, T..J. Detection of bacteriocins produced by lactic acid
bacteria. Journal of Microbiological Methods. 13: 145-150. 1991.
[4] MENENDEZ, S.; GODÍNEZ, R.; CENTENO, J.A.; RODRÍGUEZ-OTERO, J.L.
Microbiological, chemical and biochemical characteristics of “Tetilla” raw cows-milk
cheese. Food Microbiology. 18: 151-158. 2001.
[5] SCHILLINGER,U.;LÜCKE,F.K. Identification of lactobacilli from meat and meat
products. Food Microbiology, 4:199-208, 1987.
[6] SCHLEIFER, K.H.; EHRMANN, M.; BEIMFOHR, C.; BROCKMANN, E.; LUDWIG,
W.; AMANN, R. Application of molecular methods for the classification and
identification of lactic acid bacteria. International Dairy Journal, v.5, p.1081-1094,
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[7] SILVA, N.; JUNQUEIRA, V.; SILVEIRA, N. Manual de métodos de análise
microbiológica de alimentos. Livraria Varela. São Paulo. Brasil 2001.

								
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