Transgenic Plant Lab.
ACADEMIA SINICA
ACADEMIA SINICA
水稻轉殖
以農桿菌為媒介之水稻轉殖：由成熟種子誘導癒傷組織進
行農桿菌感染
Agrobacterium-mediated transformation of rice（TN67）
with embryogenic callus induced from mature seeds
1. 挑取飽滿的成熟種子，去殼。
2. 以 2﹪ NaOCl + 2~3 drops Tween-20 消毒種子十五分鐘
3. 以無菌水清洗至少五次。
4. 將消毒過的種子播在 NB media 中，26℃黑暗培養 18-21 天。
5. 取介於 explants 及 media 之間的 embryonic units 移至新鮮的
NB media 中，26℃黑暗培養 10-15 天。
6. 感染前兩天，挑取 Agrobacterium single colony，28℃下養成 5mL
YEP broth（含適當抗生素）。
， 。
7. 隔天 將菌養在含 100μM acetosyringone 及適當抗生素之 YEP 50 ml
8. 以 CCL media 調整 Agrobacterium 菌液濃度至 OD600=1。
9. 取 50-100 個 embryogenic nodular units 浸在 25ml 菌液中
10-15min。
1
10.以滅過菌的紙巾吸乾，置於 CCS media 中，10units/plate， 26℃
黑暗培養 3 天。
11.移至含抗生素的 R2S media ，5-7 units/plate， 26℃黑暗培養 14
天。
12.此時 callus 轉成深棕色，表面有棕色透明小突起。
，
13.將 callus 移到 NBS media 7 天後長出棕色球狀物 將之舖在 media
上，再養 10-15 天。
14.長成球狀圓形結實不透明的黃色 calli 後，移至 PRAG media 26℃
黑暗培養 7 天。
15.長出乳白色分裂狀 callus ，表面光滑乾燥，移至 RN media ，4-5
units/plate，26℃黑暗培養 2 天。
16.維持在 RN media 中，移到 26℃，光週期 16hr，培養 3 週。
17.切下 shoot，移至 P media 26℃，光週期 16hr，培養約 3 週即發根。
參考文獻
C. Sallaud, et al. （2003）Highly efficient production and characterization of
T-DNA plants for rice（Oryza sativa L.）functional genomics. Theor. Appl.
Genet. 106:1396-1408
培養基配方：
：
NB basic N6 major salts and iron source + B5 minor salts and vitamins + 30g/L
sucrose
2
NB：NB basic + 2 mg/L 2,4-D + 500 mg/L proline + 500 mg/L glutamine + 300
mg/L casein hydrolysate （pH5.8）+ 2.6 g/L phytagel
R2 basic：R2 major and minor salts，vitamins and iron source（Ohira et al.
1973）+2.5 mg/L 2,4-D
CCL：R2 basic + 10g/L glucose（pH5.2）+ 100 μM acetosyringone
CCS：CCL + 7 g/L agarose
R2S：R2 basic + 30 g/L sucrose（pH6.0）+ 400 mg/L cefotaxime + 其他篩選
用抗生素 + 7 g/L agarose
NBS：NB basic + 2.5 mg/L 2,4-D + 500 mg/L proline + 500 mg/L glutamine +
300 mg/L casein hydrolysate （pH6.0）+ 400 mg/L cefotaxime + 其他
篩選用抗生素 + 7 g/L agarose
PRAG：NB basic + 2 mg/L BA + 1 mg/L NAA + 5 mg/L ABA + 500 mg/L
proline + 500 mg/L glutamine + 300 mg/L casein hydrolysate （pH6.0）
+ 400 mg/L cefotaxime + 其他篩選用抗生素 + 7 g/L agarose
RN：NB basic + 3 mg/L BA + 0.5 mg/L NAA + 篩選用抗生素（pH5.8）+
4.5g/L phytagel
P：MS salts，vitamins and iron source + 50 g/L sucrose（pH5.8）+ 2.6 g/L
phytagel
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