Dystophia myotonica - RNA patogenese
Turið Holm Johannessen (080283-1048), 30. nov 2006
Resumé: Dystrophia myotonica (DM) er den almindeligste form for muskeldystrofi hos voksne. Der findes to
typer, DM1 og DM2, med mutationer i hhv. en kinase og et nukleinsyre bindende protein. Haploinsufficiens
af disse gener har vist sig at være utilstrækkeligt til at frembringe den komplicerede multisystemiske
fænotype, der består af bl.a. myotoni, insulinresistens, kardielle ledningsforstyrrelser og
hukommelsessvækkelse. Derimod tyder mere og mere på at mutationerne, hhv. et (CTG) n-repeat i 3’-UTR
og et (CCTG)n-repeat i intron 1, transskriberes og ophobes i kernen og derved påvirker regulatoriske
proteiner inde i kernen. Det er især muscleblind-like protein 1 (MBNL1), CUG-binding protein 1 (CUG-BP1)
og heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H (hnRNP H) der er fundet påvirket ved DM. MBNL1 bliver
nedreguleret, mens CUG-BP1 og hnRNP H bliver opreguleret. Alle tre proteiner virker ved at regulere
alternativ splicing, MBNL1 ved at fremme voksne spliceforme og CUG-BP1 og hnRNP H ved at fremme
føtale spliceforme. Splicing af flere proteiner er påvirket ved DM, de bedst karakteriseret er klorid kanalen i
muskelvæv og insulin receptoren. Begge proteiner splices ved DM til en føtal form, der resulterer i myotoni
og insulinresistens. Der er også fundet proteiner i hjernevæv der er alternativt splicet, muligvis er dette
grunden til hukommelsessvækkelsen der ses ved DM. Der er endnu ikke nogen behandling for DM, anden
end symptomatisk. Forsøg med at opregulere MBNL1 har vist begrænset effekt.
Nøgleord: Dystrophia myotonica, DM1, DM2, MBNL1, CUG-BP1, hnRNP H, RNA patogenese
Johannessen TH: Dystrophia myotonica - RNA patogenese
Indledning – hvad er dystrophia myotonica ........................................................................ 3
Problemformulering: ................................................................................................... 4
RNA foci dannelse .............................................................................................................. 5
Alternativ splicing ............................................................................................................... 6
Muscleblind familien ....................................................................................................... 6
CELF familien ................................................................................................................. 7
hnRNP ............................................................................................................................. 8
Transkriptionsfaktorer ..................................................................................................... 9
Målgener ............................................................................................................................ 10
Troponin T ..................................................................................................................... 10
Insulin receptor .............................................................................................................. 11
Klorid kanalen ............................................................................................................... 12
MAPT, NMDA NR1 og APP ........................................................................................ 14
Behandling ......................................................................................................................... 15
Diskussion ......................................................................................................................... 16
Referencer.......................................................................................................................... 18
Litteratur ........................................................................................................................ 18
Figurer/tabeller .............................................................................................................. 19
2
Johannessen TH: Dystrophia myotonica - RNA patogenese
Indledning – hvad er dystrophia myotonica
Dystrophia myotonica type 1 (DM1)
er den hyppigste form for muskel
dystrofi hos voksne, med en incidens
på 1/8000. Det er en autosomal
dominant nedarvet sygdom. Klinisk
er den meget varieret, med
symptomer fra flere organsystemer, Tabel 1. Korrelation mellem repeatlængde og fænotype ved
DM1. [0]
bl.a. myotoni, kardielle
ledningsforstyrrelser, testikulær atrofi, insulinresistens og hukommelsessvækkelse[1][2][3].
DM1 skyldes en mutation på 19q13.3 i DM protein kinase genet (DMPK). Det er en
(CTG)n repeat ekspansion i 3´-UTR af genet[3]. DM1 var den første autosomal dominante
sygdom man fandt, der skyldes en trinucleotid ekspansion der bliver transkriberet men ikke
bliver translateret[4]. Ekspansionen er meget ustabil og der ses udtalt mitotisk og meiotisk
forlængelse af repeatet[5]. Normale har ca. 5-35 repeats, mens de alvorlige kongenitte
former af sygdommen kan have flere 1000. Der ses et fald i debutalder samt en forværring
af symptomer jo længere repeatet er (Tabel 1)[1]. Der ses desuden anticipation, dvs. at
sygdommen forværres fra forælder til barn, især mor til barn[5].
Dyreforsøg har udelukket haploinsufficiens eller overekspression af DMPK genet som
eneste årsag til den komplicerede fænotype. DMPK knockout mus viser ingen eller kun
meget svage tegn på DM1[6]. Desuden er der ingen reporterede cases af punkt-mutationer i
DMPK som giver multisystemiske symptomer, dette forstærker teorien om at DMPK
haploinsufficiens ikke kan forårsage DM1[4]. Da (CTG)n repeatet udgør en meget stærk
nukleosom bindende site, så er det muligt at dette ændrer kromatin strukturen og derved
ekspression af nabo gener, en såkaldt ”field effect”[1]. Der er to gener fundet tæt på
DMPK, SIX5 og DMWD, hvor mutationen ligger i promoter regionen for SIX5. SIX5 er
spændende, da det minder meget om drosophila melanogaster genet sine oculis som er
nødvendigt for udvikling af øjne, derfor er det muligt at katarakt skyldes haploinsufficiens
af SIX5. Den katarakt type man har fundet SIX5 knockout mus er dog ikke den samme
specielle posteriore type som findes i DM1 patienter[4]. Funktionen af DMWD er uklar,
men genet udtrykkes i testis, og kunne have noget med gonade atrofi at gøre[2].
3
Johannessen TH: Dystrophia myotonica - RNA patogenese
Længere væk på kromosom 19 er der
fundet et gen, FCGRT, der koder for
en receptor der binder og derved
hindrer katabolisme af IgG. Der er
foreslået at en slags ”long-range” cis
inaktivation af genet kan være skyld
i IgG hyperkatabolismen der ses ved
DM1[2].
Der var længe en gruppe patienter
der havde en fænotype der havde
Tabel 2. Symptomer ved DM1 og DM2. [II]
slående lighed med DM1 (Tabel 2),
men de havde ikke mutation i DMPK genet. I 1998 fandt man en familie med DM1
lignende symptomer der havde en mutation på kromosom 3q21. Senere undersøgelser viste
så at de fleste tilfælde af proximal myotonic myopathy (PROMM) havde en mutation på
samme locus. Mutationen ligger i intron 1 i zincfinger protein 9 genet (ZNF9). Genet koder
for et nukleinsyre bindende protein. Mutationen er ligesom ved DM1 en transkriberet, men
utranslateret mikrosatellit ekspansion, et (CCTG)n-repeat[7]. Den længste normale repeat
man har fundet er (CCTG)26, mens DM2 patienter har meget varierende længde, mellem
75 og 11.000 CCTG repeats. Den somatiske ustabilitet ved DM2 er meget udtalt, illustreret
ved identiske tvillinger havde forskel på repeat størrelse på ~3000 repeats. Der er ikke lige
så god korrelation mellem repeatlængde og debut alder ved DM2 som ved DM1[7]. DM2
patienter er ofte ikke så svært afficerede som DM1 patienter, ligesom den kongenitte form
ikke ses ved DM2[4]. Det er meget usandsynligt at to mutationer i hhv. i en kinase og
nukleinsyre bindende protein kan give en fænotype der næsten er identisk, udelukkende
ved haploinsufficiens af generne. Ligeledes er ingen umiddelbar sammenhæng mellem
nabogenerne, som kan forklare lighederne mellem sygdommene[7].
Problemformulering:
I de senere år har man arbejdet med den model, at det er selve repeat ekspansionen som er
patologisk. Hvordan er (CTG)n/(CCTG)n repeat ekspansionen patologisk? Kan
(CTG)n/(CCTG)n repeat ekspansionen være skyld i den komplicerede fænotype ved DM?
4
Johannessen TH: Dystrophia myotonica - RNA patogenese
Hvilke symptomer ved DM kan forklares ved denne model? Kan der findes en behandling
for DM?
RNA foci dannelse
Man har vist at DMPK transkriptet bliver
ophobet i kernen hos DM1 patienter[6].
Derudover har det vist sig, at transkriptet
danner distinkte foci inde i kernen. Foci har
vist sig at være DNase stabile, RNase
følsomme og kan ikke detekteres med
(CTG)10 prober[3], derfra kan konkluderes at
foci er dannet af RNA og ikke DNA.
Yderligere eksperimenter har så vist at det kun
er selve (CUG)n-repeat sekvensen der er
nødvendig for at få foci dannelse (Figur 1).
Myoblaster fra mus danner distinkte foci når
(CTG)200 bliver udtrykt, selv uden DMPK
Figur 1. A: rask fibroblast, ingen foci dannelse. B:
genet[3]. DM1 fibroblast, foci dannelse. C: myoblast, kontrol
CAT vector, ingen foci dannelse. D: myoblast,
Foci dannelse forekommer ved (CTG)57, men CAT+DMPK(CTG5), ingen foci dannelse. D:
myoblast, DMPK+CTG57, foci dannelse. F:
ikke ved (CTG)5 eller (CTG)26. Dvs. at CAT+CTG200, foci dannelse. [III]
grænsen for foci dannelse er et sted mellem 26 og 57 CTG-repeats, dette stemmer meget
godt overens med hvor langt repeatet skal være for at udvikle DM1 fænotypen[3].
Retentionen af DMPK transkriptet inde i kernen er ikke fuldstændig ved de lavere repeat
længder, det er muligt at detekterer DMPK protein ved ELISA teknik. Først ved (CUG)>400
er der fuldstændig retention af transkriptet inde i kernen[3]. Det er også først ved (CUG)>400
at der er god korrelation mellem debutalder og repeat længde ved DM1[4].
Mus der har fået (CUG)250 sat på i 3’ enden at det humane skeletale aktin gen (HSALR),
danner nuklæere foci, karakteristiske histologiske muskelændringer og myotoni[10]. Dette
tyder på at det af det forlængede repeat der er afgørende om der dannes foci og klinisk
manifestation af DM og ikke selve DMPK transkriptet.
Hvorvidt foci dannelsen er en beskyttelsesmekanisme eller om den er patogenetisk har
været diskuteret[4]. Undersøgelser har vist at flere proteiner bl.a. transkriptionsfaktorer[8],
5
Johannessen TH: Dystrophia myotonica - RNA patogenese
MBNL[4], hnRNP[9] (se senere) bliver rekrutteret til foci og derved tabes fra deres ”sites of
action”. Derimod har en anden undersøgelse vist, at overekspression af det normale DMPK
også giver DM fænotypen. Da normalt DMPK ikke bliver tilbageholdt i kernen er det
måske dette ”frie” DMPK som er patologisk, og foci er en beskyttelsesmekanisme der
tilbageholder toksisk RNA, og sygdom opstår når denne mekanisme er mættet[11].
I eksperimenter har det vist sig at foci dannes både ved (CUG)n og (CAG)n ekspression,
men kun (CUG)n er patologisk. Derved kan konkluderes at foci i ikke patologiske i sig
selv[12].
Man har også kunne påvise foci dannelse med CCUG prober i DM2 celler. I modsætning
til DM1, hvor det er det hele DMPK transkriptet som er tilbageholdt i foci, er det kun selve
(CCUG)n i DM2[11].
Alternativ splicing
Alternativ splicing er en meget brugt mekanisme til at opnå protein diversitet og til at
kontrollere gen ekspression i mange biologiske processer. Alternativ splicing er strikt
reguleret. Forskellige vævsspecifikke regulatoriske proteiner sørger for at den korrekte
isoform bliver udtrykt i det rette væv[12].
Alternativ splicing er ikke kun spatielt varieret, dvs. specifikke isoformer udtrykkes i
specifikke væv, men også temporalt varieret. Ekspressionen af nogle proteiner hænger nøje
sammen med hvor i udviklingen vi er. To af disse temporalt styrede regulatoriske protein
familier er muscleblind-like familien og CELF familien[12].
Muscleblind familien
Muscleblind-like (MBNL) familien består af tre proteiner, MBNL1, MBNL2 og MBNL3.
Alle tre co-lokaliserer med foci i DM[13]. Muscleblind-like familien er analog med
Drosophila genet muscleblind som er essentielt for muskel og øje differentiation[10].
Desuden har flere undersøgelser vist at MBNL medvirker i differentiation af
fotoreceptorer, neuroner, adipocytter og blodceller[12].
6
Johannessen TH: Dystrophia myotonica - RNA patogenese
MBNL1 er involveret i muskel differentiation, og udtrykkes stærkest i skeletmuskulatur,
men findes også i anden muskulatur, hjerne, nyrer, lever og pancreas. MBNL3 ser ud til at
virke modsat af MBNL1 og udtrykkes hovedsagligt i placenta. MBNL2 udtrykkes i
lignende nivuear i alle væv og medvirker i integrin α3 subcellulær lokalisation[12]. Det er
især MBNL1 der er interessant når man snakker om DM.
Ekspressionen af MBNL familien er udviklingsstyret, den promoverer splicing af gener der
udtrykkes i voksent væv. Overekspression af MBNL1, MBNL2 eller MBNL3 promoverer
ekspression af voksne spliceforme. Modsat fører small interupting RNA (siRNA) medieret
nedregulering af MBNL familien til ekspression af føtale spliceforme. MBNL1 styrer
splicing af sine målgener ved at binde til en konsensus sekvens YGCU(U/G)Y (hvor Y er
en pyramidine)[12].
Det første man fandt som tydede på at MBNL var involveret i patogenesen ved DM var at
proteinet co-lokaliseres med foci i DM celler. Det er også vist at denne ophobning fører til
en væsentlig reduktion af MBNL fra andre steder i cellen[13].
Hvorvidt tab af MBNL var patologisk blev undersøgt ved at lave MBNL1 knockout mus,
hvor exon 3 var deleteret (Mbnl1∆E3/∆E3). Disse mus viste mange af symptomerne ved DM
inkl. myotoni og katarakt[10].
CELF familien
CELF familien består i dag* af 6 proteiner. Alle har regulatoriske roller i splicing af pre-
mRNA. To af dem har cytoplasmatiske funktioner, CUG-binding protein 1 (CUG-BP1) og
elav-like RNA binding protein 3 (ETR3)[14]. Det er disse to CELF-proteiner der er
dominerende i skeletmuskulatur og hjertemuskulatur. De er udviklingsstyrede og er
betydeligt nedreguleret i voksent væv, selv om deres mRNA stadigt bliver udtrykt [14]. De
fremmer føtale spliceforme[4].
For at udøve sin funktion binder CUG-BP1 til U/G rige motiver i flankerende introns[15].
Disse regioner er et krav for CUG-BP1 kan udøve sin funktion, og hvis de slettes ophører
CUG-BP1 indflydelse på den alternative splicing[16].
*
Data fra februar 2005, [14]
7
Johannessen TH: Dystrophia myotonica - RNA patogenese
CUG-BP1 koncentrationen er forhøjet i DM1 celler, i to DM1 cellelinier fandt man at
CUG-BP1 var hhv. ~2,4 og ~1,9 gange forhøjet (Figur 2A), forhøjelsen var også repeat
længde afhængig, med højere koncentration, jo længere repeatet var (Figur 2B)[9]. Denne
forhøjelse er ikke sekundær til at MBNL bliver ophobet i foci, da siRNA medieret
nedregulering af MBNL ikke har indflydelse på CUG-BP1 koncentrationen[9].
For at finde ud af om forhøjede CUG-BP1 koncentrationer er patologiske er der blevet
fremstillet transgene mus (MCKCUG-BP1) der udtrykker CUG-BP1 i skeletmuskulatur og
hjerte, to væv der er ramt ved DM. Disse mus har histologiske ændringer i
skeletmuskulaturen, samt alternativ splicing i både hjerte og skeletmuskulatur som svarer
til DM patienter[14].
hnRNP
En anden familie af regulatoriske proteiner
der er påvirket ved DM er heterogeneous
nuclear ribonucleoprotein (hnRNP). hnRNP
H og F co-lokaliserer med foci i DM celler,
men denne ophobning fører ikke til noget
udtalt tab af proteinet fra andre steder i
cellen[13].
Udover at co-lokalisere med foci fandt man
at hnRNP H koncentrationen er ~2,3 og ~2,1
gange forhøjet i to DM cellelinier i forhold til
normale celler (Figur 2A)[9].
Denne forhøjelse var også repeatlængde
afhængig. Med (CTG)17 som kontrol viste
(CTG)167 en ~1,5 gange forhøjelse og
(CTG)667 en ~2,1 gange forhøjelse (Figur 2B).
Ved at hæmme MBNL1 og MBNL2 ved
siRNA i normale celler fandt man at hnRNP
H koncentrationen ikke stiger, dvs. at
Figur 2. A: Western blot af hnRNP H, CUG-BP1 og
GAPDH som kontrol. Koncentrationen er forhøjet af
både hnRNP og CUG-BP i DM1 celler i forhold til
normale celler. B: Western blot af koncentrationen af
hnRNP H, CUG-BP1 og GAPDH som kontrol i
fibroblaster tranduceret med (CTG)17, (CTG)167 og
8
(CTG)667. [IV]
Johannessen TH: Dystrophia myotonica - RNA patogenese
forhøjelse af hnRNP H er ikke sekundært til tab af MBNL, men muligvis et resultat af
downstream signalerings kaskade som følge af (CTG)n-repeatet[9].
I normale celler hvor koncentrationen af hnRNP H er forhøjet til ca. det niveau der ses ved
DM1 vha. transfektion med Flag-hnRNP H ses alternativ splicing som ved DM. Derimod
ses ingen ændring i splicing i normale celler hvor koncentrationen af hnRNP H er sænket
vha. siRNA[9]. I celler hvor CUG-BP1 er hæmmet ved siRNA (97% hæmmet) er en
forhøjelse af hnRNP H ikke ligeså effektiv i at inducere alternativ splicing, og modsat er
CUG-BP1 ikke så effektiv i at inducere alternativ splicing når hnRNP H er hæmmet. Dette
tyder på at både CUG-BP1 og hnRNP H skal være tilstede for at inducere maksimal
alternativ splicing. Yderligere undersøgelser viste at hnRNP H og CUG-BP1 danner et
RNA afhængigt supressor complex[9].
Som sagt har nedregulering af hnRNP H ikke indflydelse på den alternative splicing, men
samtidig nedregulering af hnRNP og overekspression af MBNL1 retter den alternative
splicing i DM1 cellerne betydeligt. Dette er fordi der er en RNA uafhængig interaktion
mellem MBNL1 og hnRNP H, som så hæmmer hnRNP H i at danne supressor complex
med CUG-BP1[9].
Transkriptionsfaktorer
Ud over MBNL og hnRNP H bliver transkriptionsfaktorer, især Specificity protein 1 (Sp1),
signal transducer and activator of transcription 1 og 3 (STAT1 og STAT3) og retinoic acid
receptor gamma (RARγ), også rekrutteret til foci. Derved mindskes koncentrationen af
disse fra det aktive kromatin og transkription af visse gener nedsættes inkl.
transkriptionsfaktorerne selv. Ud af 16 undersøgte gener fandt man at transkriptionen af 8
var nedsat inkl. kloridkanalen ClC-1 (se senere). Dette er muligvis en grund til den
mulitsystemiske fænotype ved DM. Undersøgelsen var på DM1 mutationen, men
forfatterne skriver at det er muligt at samme mekanisme gør sig gældende i DM2[8].
9
Johannessen TH: Dystrophia myotonica - RNA patogenese
Målgener
Man fundet 13† pre-mRNA der bliver alternativt splicet ved DM[17], bl.a. cardiac troponin
T, fast skeletal muscle troponin T, insulin receptor, kloridkanal, microtubule-associated
protein tau, N-methyl-D-aspartate receptor NR1, amyloid precursor protein og
myotubularin[5].
Det er meget der tyder på denne meget brede misregulering af alternativ splicing er
grunden til den multisystemiske manifestation ved DM.
Troponin T
Kardialt troponin T (cTNT) er et protein
der findes i tværstribet muskulatur, inkl.
hjertemuskulatur. Det er det første gen
man fandt misreguleret ved DM[5]. I DM
skeletmuskulatur og hjertemuskulatur er
exon 5 inkluderet. Denne form udtrykkes
tidligt i udviklingen af hjertet og muskulatur, men ikke det voksne hjerte[4]. Misregulering
af dette protein er muligvis skyld i de Figur 3. Mus der overudtrykker CUG-BP viser abnorm
splicing af Tnnt2 i muse hjerter. Øget inklusion af exon
kardielle symptomer ca. 70% af DM 5 i forhold til wild type. [V]
patienter oplever[2].
Dmpk+/- knockout mus har dog kardielle
ledningforstyrrelser som set hos DM
patienter, men dette ville ikke forklare
ledningsforstyrrelser hos DM2
patienter[3].
†
Data fra oktober 2005, [17]
10
Johannessen TH: Dystrophia myotonica - RNA patogenese
Flankerende til exon 5 ligger en GUG rig zone, CUG-BP1 binder til den og stimulerer
inklusion af exon 5, den føtale spliceform. I forsøg med transgene mus der overudtrykker
CUG-BP1 har man kunnet reproducere
∆E3/∆E3
Figur 4. A: retention af Tnnt2 exon 5 i Mbnl1
den alternative splicing af Tnnt2‡ (Figur musehjertevæv. B: Retention af Tnnt3 føtalt exon (F) i
∆E3/∆E3
Mbnl1 voksne mus. [VI]
3)[14]. I Mbnl1∆E3/∆E3 mus ses ligeledes
en øget retention af Tnnt2 exon 5 (Figur 4A).
Fast skeletal muscle troponin T (Tnnt3) er også misreguleret ved DM. Det er den subunit
af troponin komplekset der binder til tropomyosin. I Mbnl1∆E3/∆E3 ses retention af føtalt
exon F (Figur 4B)[18]. Forsøg med både hnRNP A1 og CUG-BP1 har ikke kunne påvise at
overekspression af disse proteiner fører til øget retention af exon F[18].
Insulin receptor
Eksperimenter med underarmsmuskler fra
DM1 patienter har vist op til 70% lavere
sensitivitet overfor insulin end
normale[16].
Der findes to isoformer af insulin
receptoren(IR), IR-A og IR-B. IR-B bliver
udtrykt i insulin følsomt væv, fedtvæv, Figur 5. Nedsat inklusion af exon 11 ved CUG1440 og
ved overekspression af CUG-BP som ophæves når
lever og skeletmuskulatur. I DM væv ses bindingstedet for CUB-BP slettes. A: Ekspression af IR-
minigen i myocytter alene (alone), sammen med DMPK
en øget mængde af IR-A, dette er uden CTG repeat (CUG0), sammen med DMPK med
1440 CTG repeats (CUG)1440, sammen med CUG- BP.
tilstrækkeligt til at give den nedsatte B: samme blot efter at en 1.8 kb stor CUG-BP bindende
region i intron 10 er slettet. [VII]
insulinfølsomhed, der ses ved DM[16].
Ved stimulation med insulin er optagelsen og inkorporering af glukose i glykogen
væsentligt højere i normalt væv end i DM1 væv, pga. mangel på den insulinfølsomme
isoform af receptoren. Ved stimulation med metformin ses samme øgning i glukose
optagelse og inkorporering i glykogen i DM væv og hos normale, dvs. den insulin-
‡
Svarer til cTNT hos mennesker
11
Johannessen TH: Dystrophia myotonica - RNA patogenese
uafhængige glukose omsætning er ikke påvirket ved DM1[16]. Samme resultater er set ved
DM2[5].
Isoform switchet der ses ved DM kunne være et resultat af muskel regeneration, men dette
er usandsynligt, da muskelcellerne ikke udtrykker andre gener der er typiske for
regeneration (cTNT og fMHC). Disse gener udtrykkes hos patienter med Duchenne muskel
dystrofi (DMD), hvor man ser en stor regeneration af muskler, mens DMD patienter
udtrykker IR-B[16].
I fibroblast muskel kulturer fra normale og DM1 patienter kunne man se at fibroblaster
udtrykte normal fordeling mellem IR-A og IR-B, men når de udviklede sig til myoblaster
kunne man se isoform switch mod IR-A. Dette hænger sandsynligvis sammen med DMPK
bliver udtrykt i myocytter, og dermed inducerer isoform switchet[16].
Forskellen mellem IR-A og IR-B er exon 11, dette exon bliver ekskluderet i umodne
muskelceller og ikke-muskel væv[19]. Ved DM1 ses en øget eksklusion af exon 11 (Figur 5)
[16].
Exon 11 eksklusion er øget ved overekspression af CUG-BP1[16]. Ved nærmere
undersøgelse af de flankerende regioner fandt man et CUG-BP1 bindingssted i intron 10.
Når man slettede dette CUG-BP1 bindingsstedet fandt man at fordelingen af IR-A og IR-B
var normal, også i mus der overudtrykker CUG-BP1 (Figur 5)[16]. Exon 11 eksklusion er
også øget i Mbnl1∆E3/∆E3 mus[10].
Klorid kanalen
Et af kardinalsymptomerne ved DM
og ofte et af de tidlige symptomer er
myotoni, dvs. forsinket
muskelrelaksation efter frivillige
kontraktioner, fx svært ved at give
slip efter et håndtryk. Myotoni
skyldes hypereksitabilitet af muskel
fibre[15]. Lignende symptomer ses
ved punktmutationer i generne der
Figur 6. A: ClC-1 koncentrationen er mindsket eller helt
forsvundet i DM1 skeletmuskel membraner. Western blot af
normale (N), Duchennes muskel dystrofi (DMD) og dystrofia 12
myontonica (DM1). Identisk blot for membranproteinet calnexin.
B: Western blot for SCN4A, koncentrationen upåvirket ved
DM1. [VIII]
Johannessen TH: Dystrophia myotonica - RNA patogenese
koder for kloridkanalen ClC-1 eller natriumkanalen SCN4A, som begge er specifikke for
muskelfibre[19].
Hos DM1 patienter er det blevet vist
at ClC-1 er stærkt nedsat eller helt
væk, mens SCN4A ikke er
nedsat(Figur 6). Dvs. myotonien hos
DM patienter skyldes en defekt
klorid kanal[15]. Figur 7. 3 alternative splice forme, set i DM1 væv. Alle tre fører
til præmature stopkodon og nonsense mediated decay. [IX]
Ved brug af RT-PCR blev RNA’et
undersøgt nærmere. RNA mellem exon 4 og 8 blev opformeret og resultatet blev 3 ekstra
PCR produkter oveni det forventede (Figur 7). Alle tre alternative produkter resulterer i
præmature stopkodon, og derved bliver RNA’et nedbrudt via nonsense mediated decay. En
fjerde alternativ spliceform blev også fundet, inklusion af intron 2, dette resulterede
ligeledes i præmaturt stopkodon[15]. Nedbrydningen af RNA resulterer naturligvis i tab af
kloridkanalen fra cellemembranen, og derved en ændret klorid konduktans førende til
myotoni. Inklusion af exon 7a er en føtal spliceform[14]. Hvorvidt inklusion af intron 2 og
exon 6b er føtalt er uvist[15].
Når man undersøgte intron 2 nærmere fandt man flere bindingssteder for CUG-BP1[15].
Og overekspression af CUG-BP1 fører til øget retention af intron 2, også i ikke-DM
celler[19]. I Mbnl1∆E3/∆E3 mus ser man en øget retention af exon 7a og intron 2, desuden ses
at SCA4 er normal[10].
En tredje mekanisme foreslået for ClC-1 mangel hos DM1 patienter er at
transkriptionsfaktorer bliver rekrutteret til foci, og derved ikke kan udøve deres normale
funktion. Et eksperiment hvor DM afficerede celler blev transduceret med en plasmid som
indeholdt ”high-expressing” Sp1, viste det sig at ClC-1 niveauet i cellen rettede sig og
nærmede sig det normale. Det var ikke en generel opregulering af transkription, da et
kontrolgen (FCGRT) ikke ændrede koncentration[8]. Denne model ville dog ikke kunne
forklare den ændrede splicing af genet.
13
Johannessen TH: Dystrophia myotonica - RNA patogenese
MAPT, NMDA NR1 og APP
Patogenesen i muskulaturen er rimelig godt beskrevet, dels fordi man kan tage biopsier
uden store indgreb. Patogenesen for de neurologiske symptomer ved DM er meget mindre
belyst.
I en undersøgelse[13] af hjernevæv fra 10 afdøde DM1 patienter samt 13 kontroller (6 uden
neurologisk sygdom, 2 med Alzheimers, 4 med Huntingtons, en med epilepsi) har man
fundet 3 proteiner der er misreguleret ved DM1. Microtubule-associated protein tau
(MAPT), N-methyl-D-aspartate receptor NR1 (NMDA NR1) og amyloid beta precursor
protein (APP).
DM1 hjernevæv indeholder en øget mængde APP transkripter der ikke indeholder exon 7,
dette er en føtal spliceform (Figur 8)[13].
MAPT er ligeledes alternativt splicet i
exon 2, 3 og 10 (Figur 8). Exon 10 koder
for et ekstra microtubule bindende
domæne, dette exon er ikke tilstede i
føtalt hjernevæv, mens over 50% af
transkripterne i voksent indeholder dette
exon. Exon 2 og 3 er ligeledes
udviklingsstyret, ingen af dem er i føtalt
hjernevæv, mens voksent væv primært
indeholder exon 2[13].
Det er observeret at mutationer i MAPT
der fører til exon 10 eksklusion kan føre
til frontotemporal demens og
parkinsonisme. Ydermere fører
ekspression af humant tau protein i
transgene mus til neurofibrillære tangles
og axonopathy. Det er dog ikke sikkert Figur 8. A: Alternativ splicing af NMDA-NR1(inklusion af
exon 5), APP(eksklusion af exon 7), MAPT(eksklusion af
at de observerede ændringer i MAPT exon 2 og 10) ved DM1. B: Kvantifikation af RT-PCR,
ex=exon. [X]
splicing er tilstrækkelige til at give de
14
Johannessen TH: Dystrophia myotonica - RNA patogenese
neurologiske symptomer der ses ved DM1[13].
Hos DM1 patienter er der desuden er 3-fold stigning i NMDA NR1 transkripter der
indeholder exon 5(Figur 8). Inklusion af dette intron influerer bl.a. cellulær distribution af
receptoren (somatisk i stedet for somatodentritisk). NMDA NR1 er nødvendig for "long
term potentiation" af hippocampus og indlæring. Denne inklusion af exon 5 er derfor
muligvis skyld i den hukommelsessvækkelse der ses ved DM1[13].
D
D
d
Behandling
Hidtil har behandling af DM
været fokuseret på de
forskellige symptomer ved
sygdommen, især fordi man
ikke har kunnet identificere en
primær patofysiologisk LR
Figur 9. Myotoni var bedømt med EMG på HSA mus injiceret med
mekanisme[5]. AAV i højre m. tibialis anterior og uinjicerede venstre m. tibialis
anterior og m. gastrocnemius. EMG skalaen: 0:ingen myotoni;
Mange undersøgelser støtter 1:myotoni i 50% af målingerne;
3:myotoni ved nærmest alle målinger. [XI]
den hypotese at det er mangel
på MBNL1 som er hovedårsagen til DM fænotypen. En behandling der er rettet mod denne
patologiske mekaniske ville derfor være en der enten sørge for overekspression af MBNL
eller hindre MBNL interaktioner med CUG/CCUG[18]. Dette blev undersøgt at indsprøjte
en adeno-associeret viral (AAV) vektor indeholdende MBNL1 ind i m. tibialis anterior på
HSALR mus. Dette resulterede i overekspression af MBNL1[18]. Efter 23 uger var
myotonien næsten forsvundet. Ligeledes kunne man påvise at ClC-1 var næsten på
vildtype niveau. Derimod var de morfologiske ændringer i DM muskel væv tilstede ved
alle undersøgelser. Myotonien var dog tilbage efter 43 uger, dette skyldes sandsynligvis
øget immunrespons mod viruset. Et af problemerne med denne undersøgelse er at (CUG)n-
repeatet blev transkriberet med humane aktin gen, som udtrykkes i meget højere grad end
15
Johannessen TH: Dystrophia myotonica - RNA patogenese
DMPK, det er derfor ikke sikkert af behandlingen ville have samme effekt på DM
patienter[18].
En anden indgangsvinkel ville være at eliminere det ”toksiske” RNA som ophobes i kernen
ved at hæmme transkription af DMPK. Da det var uvist om dette ville hjælpe blev der lavet
2 muse linjer, hvor man kunne inducere DMPK ekspression med tetracyklin, DMPK
transkriptet havde hhv. 5 og 200 CUG-repeats. Begge muselinjer udviklede DM fænotypen
ved inducering, dvs. at overekspression af det normale DMPK gen også var patologisk. Da
induktionen blev stoppet efter en uge (da musene havde både myotoni og kardielle
ledningsforstyrrelser), kunne man se at musene stabiliseredes. De mus der kun var let
afficerede (1. grads blok) kunne man se en fuldstændig remission[11].
Diskussion
Der er bevis for at det er (CTG)n/(CCTG)n ekspansionen som er patologisk ved DM. Især
det at HSALR mus udvikler symptomer der minder meget om DM, selv om CTG
ekspansionen sidder på et andet gen[17]. Også det fakta at der er to næsten identiske
sygdomme der sidder på vidt forskellige gener, det eneste de har tilfælles er repeat
ekspansionen[7].
Man mener at mekanismen hvorved en utranslateret mikrosatellit ekspansion er patologisk
er ved at påvirke en række regulatoriske proteiner, der styrer alternativ splicing. CUG-BP1
og hnRNP H bliver opreguleret ved en uvis mekanisme. MBNL1 bliver nedreguleret fordi
den bliver rekrutteret til foci inde i kernen og tabes derfor fra sine ”sites of action”. CUG-
BP1 og hnRNP H danner et kompleks der fremmer føtale spliceforme, mens MBNL1
fremmer voksne spliceforme[9].
Når man kigger på hvilke spliceforme der er i DM væv ser man at det er alternative
Figur 10. Mekanismen bag patogenesen i dystrophia myotonica (DM). DM1 skyldes et (CTG)n repeat i DMPK
genet, som resulterer i lange CUG transkripter. DM2 skyldes et (CCTG) n repeat i ZNF9 som ligeledes
resulterer i lange CCUG transkripter. Disse unormale RNA binder til og ændrer funktionen af RNA bindende
proteiner (bla. CUG-BP1 og MBNL1). GUG-BP1 bliver opreguleret mens MBNL1 bliver hæmmet. Dette fører
til alternativ splicing af en række transkripter der har betydning for vigtige fysiologiske procersser. De
alternativt splicede proteiner (øvre række) fører til forskellige symptomer (nedre række). APP: amyloid 16
precursor protein; ClC-1: klorid kanal 1; DMWD: dystrophia myotonica-containing WD repeat motif; NMDR R1:
N-methyl-D-aspartate receptor 1; RyR1: Ryanodine receptor 1; SERCA: Sarcoplasmatisk/endoplasmatisk
2+
reticulum Ca -ATPase; SIX5: sine oculis-related homeobox 5 homologue; MAPT: microtubule associated
protein tau; MTMR1: myotubularin-related 1. [XII]
Johannessen TH: Dystrophia myotonica - RNA patogenese
splicing frem for abnormale spliceforme[16]. Det er at nogle transkripter retenerer føtale
exoner mens andre ekskluderer voksne exoner tyder også på at det er en fejl i regulering og
ikke en generel fejl i splicing[16].
CUG-BP1/hnRNP H og MBNL1 har antagonistiske funktioner, CUG-BP1/hnRNP H
fremmer føtale spliceforme, mens MBNL1 fremmer voksne spliceforme. I flere at de gener
der bliver alternativt splicet ved DM ses identiske spliceforme ved hhv. overekspression af
CUG-BP1 og nedregulering af MBNL1[9]. Der er dog undtagelser, og man har ikke kunne
påvise alternativ splicing af Tnnt3 ved overekspression af CUG-BP1 eller hnRNP A1,
mens genet bliver alternativt splicet i Mbnl1∆E3/∆E3 mus[18]. Det er ikke simpel antagonisme
mellem CUG-BP1/hnRNP H og MBNL1[12]. De har også forskellige bindingssteder hhv.
U/G rige motiver og YGCU(U/G)Y[15][12]. Det kan være at en del af antagonismen består i
at MBNL1 binder hnRNP i et RNA uafhængigt kompleks[9].
Da det ikke er et specifikt gen der er skyld i DM, men hellere en ekspansion der påvirker
alternativ splicing i alle væv hvor DMPK/ ZNF9 bliver udtrykket, så ville denne model
kunne forklare den multisystemiske fænotype ved DM.
Man har fundet 13 gener der er misreguleret ved DM[17]. De to bedst karakteriserede er
kloridkanalen ClC-1 og insulin receptoren. Disse to har man kunne relatere direkte til to
hoved symptomer ved DM, nemlig myotoni og insulinresistens[15][16]. Derudover har man
fundet flere andre proteiner der er alternativ splicet i DM muskelvæv, bl.a. Tnnt3 og
sarcoplasmatisk/endoplasmatisk reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) 1 og 2. Disse har
muligvis noget med muskel atrofi/svækkelse[17]. Der er også funder 3 alternativt splicet
transkripter i hjernevæv fra DM patienter MAPT, APP og NMDA R1. Disse kan have
noget at gøre med de CNS symptomer der ses ved DM, især DM1[13]. Kardielt troponin T
er fundet alternativt splicet i hjertemuskulatur[4], dette er muligvis grunden til de kardielle
ledningforstyrrelser som flere DM patienter oplever. Der er stadig flere at symptomer ved
DM der ikke har en forklaring, men yderligere undersøgelser vil sikkert finde flere
transkripter der bliver alternativt splicet ved DM. Se i øvrigt Figur 10.
Der er ikke nogen behandling for DM. Der er foreløbigt kun lavet et forsøg med
indsætning af MBNL1 vha. AVV, selv om der var betydelig forbedring af symptomer, var
forbedringen kun midlertidig[18]. Der vil sikkert vare længe inden der kommer en egentlig
behandling af DM, dette skyldes dels, at selv om der er kommet megen information om
17
Johannessen TH: Dystrophia myotonica - RNA patogenese
patogenesen ved denne sygdom i de senere år, så er der stadig rigtig mange spørgsmål der
skal besvares.
Referencer
Litteratur
[1] Johnson KJ, Boucher A, King SK, Winchester model of RNA toxicity and cardiac conduction
CL, Bailey MES et al. Is myotonic dystrophy a defects on Myotonic dystrophy. Nature
single gene disorder? Biochemical Society Genetics 2006; 38; 1066-70
Transactions 1996; 24; 510-13 [12] Pascual M, Vicente M, Monferrer L. The
[2] Junghans RP, Ebralidze A, Tiwari B. Does Muscleblind family of proteins: an emerging
(CUG)n repeat in DMPK mRNA ‘paint’ class of regulators of developmentally
chromosome 19 to suppress distant genes to programmed alternative splicing.
create the diverse phenotype of myotonic Differentiation 2006; 74; 65-80
dystrophy?: A new hypothesis of long-range [13] Jiang H, Mankodi A, Swanson MS, Moxley
cis autosomal inactivation. Neurogenetics RT, Thornton CA. Myotonic dystrophy type 1
2001; 3; 59-67 is associated with nuclear foci of mutant RNA,
[3] Amack JD, Paguio AP, Mahadevan MS. Cis sequestration of muscleblind proteins and
and trans effects of the Myotonic dystrophy deregulated alternative splicing in neurons.
(DM) mutation in a cell culture model. Human Human Molecular Genetics 2004; 13; 3079-88
Molecular Genetics 1999; 8; 1975-84 [14] Ho TH, Bundman D, Armstrong DL, Cooper
[4] Ranum LPW, Day JW. Myotonic Dystrophy: TA. Transgenic mice expressing CUG-BP1
RNA Pathogenesis Comes into Focus. reproduce splicing mis-regulation observed in
American Journal of Human Genetics 2004; Myotonic dystrophy. Human Molecular
74; 793-804 Genetics 2005; 14; 1539-47
[5] Day JW, Ranum LPW. RNA pathogenesis of [15] Charlet-B N, Savkur RS, Singh G, Philips AV,
myotonic dystrophies. Neuromuscular Grice EA, Cooper TA. Loss of the Muscle-
Disorders 2005; 15; 6-16 Specific Chloride Channel in Type 1 Myotonic
[6] Harris S, Moncrieff C, Johnson K. Myotonic Dystrophy Due to Misregulated Alternative
dystrophy: will the real gene please step Splicing. Molecular Cell 2002; 10; 45-53
forward! Human Molecular Genetics 1996; 5; [16] Savkur RS, Philips AV, Cooper TA. Aberrant
1417-23 regulation of insulin receptor alternative
[7] Ranum LPW, Day JW. Dominantly inherited, splicing is associated with insulin resistance in
non-coding microsatellite expansion disorders. myotonic dystrophy. Nature Genetics 2001;
Current Opinion in Genetics & Development 29; 40-47
2002; 12; 266-71 [17] Gatchel JR, Zoghbi HY. Diseases of unstable
[8] Ebralidze A, Wang Y, Petkova V, Ebralidze K, repeat expansion: Mechanisms and common
Junghans RP. RNA Leaching of Transcription principles. Nature Reviews Genetics 2005; 6;
Factors Disrupts Transcription in Myotonic 743-55
Dystrophy. Science 2004; 303; 383-87 [18] Kanadia RN, Shin J, Yuan Y, Beattie S,
[9] Paul S, Dansithong W, Kim D, Rossi J, Wheeler TM et al. Reversal of RNA
Webster NJG et al. Interaction of muscleblind, missplicing and myotonia after muscleblind
CUG-BP1 and hnRNP H proteins in DM1- overexpression in a mouse poly(CUG) model
associated aberrant IR splicing. The EMBO for myotonic dystrophy. PNAS 2006; 103;
Journal 2006; 25; 4271-83 11748-53
[10] Kanadia RN, Johnstone KA, Mankodi A, [19] Mankodi A, Takahashi MP, Jiang H, Beck CL,
Lungu C, Thornton CA et al. A muscleblind Bowers WJ et al. Expanded CUG Repeats
Knockout Model for Myotonic Dystrophy. Trigger Aberrant Splicing of CIC-1 Chloride
Science 2003; 302; 1978-80 Channel Pre-mRNA and Hyperexcitability of
[11] Mahadevan MS, Yadava RA, Yu Q, Balijepalli Skeletal Muscle in Myotonic Dystrophy.
S, Frenzel-McCardell CD et al. Reversible Molecular Cell 2002; 10; 35-44
18
Johannessen TH: Dystrophia myotonica - RNA patogenese
[20] Ranum LPW, Day JW. Pathogenic RNA
repeats: an expanding role in genetic disease.
Trends in Genetics 2004; 20; 506-12
Figurer/tabeller
I. Modificeret efter: Harris S, Moncrieff C, Johnson K. Myotonic dystrophy: will the real gene please
step forward! Human Molecular Genetics 1996; 5; s. 1418
II. Modificeret efter: Ranum LPW, Day JW. Myotonic Dystrophy: RNA Pathogenesis Comes into Focus.
American Journal of Human Genetics 2004; 74; s. 794
III. Amack JD, Paguio AP, Mahadevan MS. Cis and trans effects of the Myotonic dystrophy (DM)
mutation in a cell culture model. Human Molecular Genetics 1999; 8; 1975-84, s.1977
IV. Paul S, Dansithong W, Kim D, Rossi J, Webster NJG et al. Interaction of muscleblind, CUG-BP1 and
hnRNP H proteins in DM1-associated aberrant IR splicing. The EMBO Journal 2006; 25; s. 4272
V. Ho TH, Bundman D, Armstrong DL, Cooper TA. Transgenic mice expressing CUG-BP1 reproduce
splicing mis-regulation observed in Myotonic dystrophy. Human Molecular Genetics 2005; 14; 1542
VI. Kanadia RN, Johnstone KA, Mankodi A, Lungu C, Thornton CA et al. A muscleblind Knockout
Model for Myotonic Dystrophy. Science 2003; 302; s. 1980
VII. Savkur RS, Philips AV, Cooper TA. Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is
associated with insulin resistance in myotonic dystrophy. Nature Genetics 2001; 29; s. 44
VIII. Charlet-B N, Savkur RS, Singh G, Philips AV, Grice EA, Cooper TA. Loss of the Muscle-Specific
Chloride Channel in Type 1 Myotonic Dystrophy Due to Misregulated Alternative Splicing. Molecular
Cell 2002; 10; s. 46
IX. Charlet-B N, Savkur RS, Singh G, Philips AV, Grice EA, Cooper TA. Loss of the Muscle-Specific
Chloride Channel in Type 1 Myotonic Dystrophy Due to Misregulated Alternative Splicing. Molecular
Cell 2002; 10; s. 48
X. Jiang H, Mankodi A, Swanson MS, Moxley RT, Thornton CA. Myotonic dystrophy type 1 is
associated with nuclear foci of mutant RNA, sequestration of muscleblind proteins and deregulated
alternative splicing in neurons. Human Molecular Genetics 2004; 13; s. 3083
XI. Kanadia RN, Shin J, Yuan Y, Beattie S, Wheeler TM et al. Reversal of RNA missplicing and
myotonia after muscleblind overexpression in a mouse poly(CUG) model for myotonic dystrophy.
PNAS 2006; 103; s. 11750
XII. Modificeret efter: Gatchel JR, Zoghbi HY. Diseases of unstable repeat expansion: Mechanisms and
common principles. Nature Reviews Genetics 2005; 6; s. 751
Forside: Modificeret efter: Gatchel JR, Zoghbi HY. Diseases of unstable repeat expansion: Mechanisms and
common principles. Nature Reviews Genetics 2005; 6; s. 751
19