PROTEOMIQUE by twK0Ey

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									            Cours Spectrométrie de Masse


                         Introduction

                         Sarah CIANFERANI

           Institut Pluridisciplinaire Hubert Curien (IPHC)
        Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganique
                       Dir : Alain Van Dorsselaer
            UMR 7178 CNRS - Université de Strasbourg




Tel: 03 68 85 26 79                              Cours ESBS
sarah.cianferani@unistra.fr                      Oct 2010
                                       Plan

Mardi 12/10 : Théorie de la MS : Les Bases de la Spectrométrie de Masse

      - Introduction à la spectrométrie de masse

      - L’ionisation MALDI

      - L’ionisation Electrospray

      - La Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS)



Mercredi 13/10 : Utilisation de la MS en biologie

      - Utilisation de la spectrométrie de masse en analyse protéomique

      - La spectrométrie de masse des complexes non covalents
                    Spectrométrie de masse :
                      introduction générale

Définitions
     1- Présentation d’un spectre de masse
     2- Unité de mesure: le Dalton
     3- Masse moléculaire monoisotopique
     4- Masse moléculaire moyenne (ou chimique)

L’instrument : structure d’un appareil de spectrométrie de masse
     1-Structure d’un instrument : source et analyseur
     2- Rôle des champs l’électrostatiques
     3- Rôle et systèmes de génération du vide
     4- Présentation des principales sources
         EI, FAB, MALDI, ESI
     5- Présentation des principaux analyseurs
         Magnétique, quadrupôlaire, trappe d’ion, TOF, FT-ICR
     6- La MS-MS
Qu’est-ce que la spectrométrie de masse ?

     C’est une méthode de mesure des rapports
               masse-sur-charge (m/z)
        de molécules individuelles et ionisées
        (spectrométrie de masse moléculaire)

                        ou

        de complexes non covalents ionisés
     (spectrométrie de masse supramoléculaire)
                                      Historique
1912 : spectres de masse de O2, N2, CO, CO2, COCl2 (JJ. Thomson)

1930 : Application de la MS à la chimie organique (R. Conrad)

1948 : Principe de l’analyseur à temps de vol (TOF) (AE. Cameron)

1951 : Application de la résonnance cyclotron à la MS (H. Sommer)

1953 : Brevet pour l’analyseur à quadripôle et l’ion trap (W. Paul)

1958 : 1ers spectromètres de masse couplés à la GC (en 1975 : appareils GC-MS de routine)


1966 : Ionisation chimique (MSB. Munson et FH. Field)
1967 : introduction de l’informatique !!!!!!!!!!!!


1981 : Ionisation par FAB (M. Barber)
1er spectre complet de l’insuline 5807 Da

1985 : Ionisation MALDI (F. Hillenkamp)

1989 : Ionisation Electrospray ESI (J. Fenn)
Quelles informations peut apporter la spectrométrie de masse ?


 1- La masse moléculaire d’un composé
 2- La masse des fragments de ce composé
 3- Une mesure de la quantité




  Nombre d’ions                            Pic Moléculaire


                    Fragments




                                                   m/z
Quelles informations peut apporter la spectrométrie de masse ?
1- La valeur m/z du pic moléculaire permet de calculer la masse moléculaire
2- Les pics de fragmentation permettent de reconstituer une partie de la structure
3- L’intensité des pics permet de faire de l’analyse quantitative


          Cholestane


                                                                                                             Pic moléculaire
   100                                                       217.0
                                    m/z 217
                    m/z 149
                                                                  218.0
    %                                 149.0
                          108.9                                                                                        357.1
                                                                                                                               372.1
         55.0 81.0 94.9           148. 0 150.0                    219.0
                                                 175. 0 203. 0
                                                                                  262. 1         302.1
                                                                          232.0                                                 373.2
                                                                                                         315.1   343.1                   410.1 416.2
    0                                                                                                                                          Da/e
         60    80    0
                     10    120     140   160     180   200       220   240    260          280     300    320    340     360   380     400 420



                                               Fragments
   Exemple: spectre en ionisation par impact électronique du cholestane.
      Pic moléculaire et masse moléculaire : définition


La masse moléculaire est déduite de la valeur m/z du pic moléculaire dans le
spectre. Celui-ci correspond à un ion qui contient TOUS les atomes de la
molécule étudiée, sans qu’il y ait eu rupture d’une liaison.

La molécule a été ionisée grâce à la perte ou au gain d’une charge électrique.

La masse moléculaire correspond donc à la composition élémentaire (formule
brute) de l’ion moléculaire.

L’existence d’isotopes se traduit par la présence de plusieurs pics
moléculaires.
On observe, non pas UN pic moléculaire, mais UN GROUPE de pics
moléculaires (un « massif moléculaire » ou « cluster moléculaire »)

La présence d’isotopes complique donc la définition, et la mesure du « pic
moléculaire ».
Pour cette molécule de 10 atomes de carbone, un atome de C13 peut être
dans 10 positions différentes,mais la masse de la molécule est toujours la
même.


       C12- C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12                                Masse   Masse M
      C13- C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12

       C12- C13 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12

      C12- C12 - C13 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12

      C12- C12 - C12 - C13 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12

      C12- C12 - C12 - C12 - C13 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12
                                                                                                       Masse M+1
      C12-   C12   -   C12 -   C12   -   C12   -   C13   -   C12   -   C12 -   C12   -   C12

      C12- C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C13 - C12 - C12 - C12

      C12- C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C13 - C12 - C12

      C12- C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C13 - C12

      C12- C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C13
           Quelle masse mesure-t-on ?


Masse monoisotopique
c’est la masse du premier pic du profil isotopique c’est-à-dire celle
qui ne prend en compte que les masses des isotopes les plus stables
(C12, H1, O16, S32, N14, …).



Masse chimique ou moyenne
c’est le barycentre (centroïde) des masses des pics constituant le
profil isotopique c’est-à-dire la masse qui prend en compte la masse
des éléments donnée par le tableau périodique (C=12,011).
                     Quelle masse mesure-t-on ?

                                                   Masse moyenne
Pic monoisotopique




                                             m/z              m/z
               P P+1 P+2 P+3



      Masse monoisotopique: dans le
      massif isotopique, on l’appelle le pic P

      Les autres pics du massif
      isotopique sont appelés les pics P+1,
      P+2, P+3,….
      Il contiennent tous au moins 1 des
      isotopes lourds d’un éléments.
De quoi dépend la nature de la masse mesurée ?

                                 DM



  R = M/DM




                                                    Vallée à 10 %

                             M        M + DM
La résolution mesure l’aptitude d’un analyseur à séparer l’ion M de l’ion M+DM
                     Quelle masse mesure-t-on ?



                                                  Masse moyenne
Pic monoisotopique




               P P+1 P+2 P+3
                                m/z                          m/z
    Massif isotopique et résolution




M = 246 Da                   M = 502 Da
   Massif isotopique et résolution




M = 1059 Da                 M = 2101 Da
   Massif isotopique et résolution




M = 4957 Da               M = 20417 Da
Pour un peptide de 18 acides aminés,
le pic monoisotopique n’est déjà plus le pic majeur
                Quelle sont les unités de mesure ?

La masse m s’exprime en Dalton (Da)
           1 Da = 1/12 .12 . 10-3 kgmole-1 / N   (N = 6, 022045 . 1023)

Et donc:           1 Da = 1,66 . 10-27 kg




C12    =   12,000000000
C13    =   13,003354839
H1     =   1,0078250
H2     =   2,0141018
O16    =   15,9949146
S32    =   31,9720718
N14    =   14,0030740
Cl35   =   34,968852729
Cl37   =   36,965902624
  La sensibilité : combien de molécules peut-on détecter
                        et mesurer ?




1 mole        6.1023 molécules
1 millimole   6.1020 molécules
1 micromole   6.1017 molécules

1 nanomole    6.1014 molécules      Quantités utilisées
1 picomole    6.1011 molécules      habituellement
1 femtomole   6.108 molécules       en SM

1 attomole    6.105 molécules
1 zeptomole   6.102 molécules
               Un spectrométre de masse
           mesure la masse de molécules isolées



Pour cela, le spectromètre de masse doit assurer les opérations suivantes:

1- Volatiliser
    Séparer les molécules les unes des autres: on passe de l’état de matière
    condensée à un état gazeux.

2- Ioniser
     Transformer les molécules en ions, car un spectromètre de masse fonctionne
     grâce à des champs électriques

3- Mesurer les rapports m/z
    La masse moléculaire est calculée à partir du rapport    masse (m)/nb de
    charges (z)
                                 Principes de la MS
• Production d’ions en phase gazeuse
• Les ions sont ensuite séparés en fonction de leur masse ou plus précisément du rapport
masse-sur-nombre de charges m/z
• Les ions sont ensuite détectés en proportion de leur nombre


  Système d’introduction de la       (chromatographie en phase
     substance à analyser                 gazeuse, liquide,
                                        électrophorèse, etc.)




                Source                 Analyseur(s)              Détecteur

               Ionise la
                                 Sépare les ions produits en       Compte le
             substance à
                                 fonction de leur rapport m/z    nombre d’ions
               analyser

                                                                       Système de traitement
                                                                           des données
 Un spectromètre de masse est donc constitué de deux parties :

1- La source d’ion : pour volatiliser et ioniser
Ces opérations peuvent se faire simultanément ou successivement selon le type de source
d’ions. Leur mécanisme intime est souvent mal connu.

2- L’analyseur: pour mesurer m/z
Il mesure les valeurs du rapport: masse / nb de charge (appelé m/z)
C’est une partie de l’appareil où règne un vide suffisant pour que le libre parcours moyen des
ions soit supérieur à la distance à parcourir dans l’appareil pour atteindre le détecteur.




 CECI IMPLIQUE:

 • Des champs électrostatiques très précis pour guider et déplacer les ions
 dans l'appareil (lentilles électrostatiques, optique ionique)

 • Un vide suffisant pour que les ions puissent se déplacer sans être détruits
 ou déviés par des molécules résiduelles (notion de libre parcours moyen)
   Les unités de mesures des pressions sont nombreuses.

L’unité officielle est le pascal (Pa):
1 pascal = 1 N/m2

On utilise également:

L’atmosphère        1 atm = 101 325 Pa (soit 1 013,25 hecto Pa) et 1 atm = 1,013 bar
Le bar              1 bar = 105 Pa (=106 dyne/cm2)
Le millibar         1 millibar = 10-3 bar = 102 Pa
Le Torr             1 Torr = 1mm Hg
Le Psi              1 Psi = 1 pound / square inch = 0,07 atm et 14 PSI = 1 atm


Pour la plupart des spectromètres de masse, le vide est indiqué en millibar.


Les valeurs du vide dans l’analyseur sont en général:
10-5 mbar : pour un analyseur trappe ionique (orbite circulaire)
10-6 mbar : pour un analyseur quadripôlaire (1 mètre de long).
10-7 mbar :           pour un analyseur magnétique (2 à 3 mètres de long).
10-7 mbar :           pour un analyseur à temps de vol (2 à 3 mètres de long).
10-9 mbar :           pour un analyseur ICR (orbite circulaire).
   La source d’ions : son rôle est de volatiliser et d’ioniser

Il existe de nombreux types de sources d’ions et chacun de ces types de sources repose
sur un principe physique différent.


Le principe physique qui permet de volatiliser et d’ioniser un type de composé est choisi
par l’opérateur en fonction des caractéristiques de la molécule à analyser. Les étapes de
volatilisation et d’ionisation se font successivement ou simultanément selon le type de
source.


Les critères de choix principaux sont:
• la volatilité et la stabilité thermique du composé à analyser
• sa labilité chimique
• les fonctions chimiques présentes et leur aptitude à induire une ionisation
• la taille des molécules
• les quantités de produit disponibles
• le type d’introduction souhaitée (directe ou en couplage chromatographique)
                Les sources d’ions se classent en
           sources « dures » et en sources « douces »




• De très nombreuses méthodes d’ionisation ont été inventées pour ioniser et volatiliser
des molécules de plus en plus fragiles, grandes et polaires.


• Les « ionisations dures » génèrent souvent des ions moléculaires qui se fragmentent
beaucoup et parfois même totalement avant d’avoir eu le temps de sortir de la source.
Leurs fragments peuvent être analysés et donnent des informations de structures.


• Les « ionisations douces » génèrent des ions moléculaires qui sont relativement stables
et qui ont des durées de vie suffisantes pour traverser l’analyseur, arriver jusqu’au
détecteur, et donc être mesurés.
               Quelles informations peut apporter
                une source à ionisation dure ?


1- La masse moléculaire d’un composé
2- La masse des fragments de ce composé
3- Une mesure de la quantité




Nombre d’ions                              Pic Moléculaire


                   Fragments




                                                    M/z
               Quelles informations peut apporter
                 un soure à ionisation douce ?

1- La masse moléculaire d’un composé
2- Pas de fragmentation
3- Une mesure de la quantité




Nombre d’ions                              Pic Moléculaire




                                                    M/z
             Les Sources d’Ionisation les plus utilisées


Ionisation à Impact électronique (IE)
                                            Petites molécules volatiles et   DURES
                                            thermostables
Ionisation Chimique (IC)


Ionisation par bombardement d’ions ou d’atomes rapides           molécules < 6000 Da
(LSIMS ou FAB)
                                                                     ASSEZ DOUCES


Ionisation par électronébullisation
(électrospray ES ou ESI)                    Biomolécules (1 300 kDa) et
                                            complexes non-covalents,
Désorption/Ionisation Laser assistée par    protéomique
Matrice (MALDI)
                                                             DOUCES
                                   Prix Nobel de chimie 2002
                             From the official Nobel press release :
  « Mass spectrometry is a very important analytical method used in practically all chemistry
laboratories the world over. Previously only fairly small molecules could be identified, but John
   B. FENN and Koichi TANAKA have developed methods that make it possible to analyse
                              biological macromolecules as well ».
                       L’analyseur : pour mesurer m/z

Il existe différents types d’analyseurs. Ils sont tous basés sur des principes physiques différents,
mais tous les analyseurs mesurent des valeurs m/z.
C’est une partie de l’appareil où règne un vide suffisant pour que le libre parcours moyen des
ions soit supérieur à la distance à parcourir dans l’appareil pour atteindre le détecteur.


B:        Déflexion par un champ magnétique (c'est l'analyseur le plus ancien)
Q:        Déflexion par un champ quadrupolaire
IT:       Confinement dans un piège à ion (Ion Trap)
TOF:      Mesure d’un temps de vol (Time Of Flight)
FT-ICR:   Résonnance Cyclotronique d’Ions à Transformée de Fourrier

Les ions formés dans la source sont dirigés (extraction et focalisation) vers l’analyseur par des
champs électrostatiques qui peuvent être de quelques volts (Q, IT, FT-ICR) ou de plusieurs
dizaines de kilovolts (TOF, B). La vitesse de déplacement des ions dans l’analyseur dépend de
l’intensité du champ d’extraction

On peut coupler plusieurs analyseurs (MS-MS et MSn) pour faire de la spectrométrie de masse
à plusieurs dimensions en utilisant successivement le pouvoir séparateur de chaque
analyseurs. Ceux-ci peuvent être identiques ou différents.
 Les caractéristiques principales d'un analyseur sont :



• La résolution R
• La gamme m/z qu'il peut analyser
• La rapidité de balayage en m/z
• La sensibilité
• La vitesse avec laquelle les ions le traversent



Souvent, avec un même analyseur, on peut augmenter l'une de ces
caractéristiques aux dépends des autres, mais seulement dans certaines
limites.
Chaque type d'analyseur a son "point fort".
                           Résolution d’un analyseur
 Pour un pic : Résolution R détermine la finesse des pics et donc la capacité à distinguer des pics
 proches. Plus la résolution est élevée, plus le pic sera fin et plus il sera possible de distinguer des
 pics proches.

                                                                            DM

                                     R = M/DM
Vallée à 50 %
 = Largeur à
  mi-hauteur
                DM
                          Vallée à 10 %            Vallée à 10 %


                 M                                                      M        M + DM



Entre deux pics : la Résolution R est la capacité à séparer deux pics distants d’une différence de
masse DM ie aptitude d’un analyseur à séparer l’ion M de l’ion M+DM
             Caractéristiques des analyseurs



Analyseurs            Résolution      Gamme m/z

Quadripôle (Q)        2 000           8 000

Magnétique (EB)       20 000          20 000

Temps de vol (TOF)    20 000-60000    500 000

Trappe ionique        5 000-20000     6 000

Cyclotron à résonance
des ions (FT-ICR)     1 000 000       4 000
       L’analyseur à temps de vol




                    Analyseur : TOF
Source : MALDI


                          Ultraflex
                         Principe de l’analyseur TOF
                                • Les ions sont expulsés de la source par paquets

                                • 2 régions principales :
                                           - une région d’accélération des ions
 25 kVolts                                 - une région libre de champ E
              0 volts



Cible



                                  Zone de vol libre d’accélération
        Zone
        d’accélération                                                 Détection
                                                                       Mesure du temps écoulé
                                                                       depuis le départ des ions
 Départ
 Formation des ions par un
 bref tir laser (5 nano sec.)
                     Principe de l’analyseur TOF
Principe :
1.   Les ions sont formés ou échantillonnés en paquets et sont ensuite accélérés
     pour acquérir une énergie cinétique fixe.
2.   A un ion de masse m et de charge z, une tension U est appliquée dans une
     zone dite zone d’accélération.
3.   L’ion acquiert une énergie cinétique Ec correspondant à une vitesse v :

                                1
                             E  m.v  z.U
                                C
                                             2


                                2
4.   Dans un tube de vol de longueur L, le temps de vol t (time of flight) ou durée du
     parcours est lié à la vitesse v et le temps de vol est égal a :

                                                                     1

                            L                          m           2


                         v                      t  L
                            t                          2U .z 
                                                              
                     Analyseur TOF

Exemple :
   • Longueur du tube de vol L = 1 m
   • U = 3000 V
   • z=1
          • m1 = 1000 uma                           m
          • m2 = 1001 uma
                                        t  d
                                                   2zeV
          • m3 = 2000 uma
          • m4 = 2001 uma

On a donc un temps de vol :
           • t1 = 41,5905 msec    Dt = 0.0208 msec = 20.8 nanosec
           • t2 = 41,6113 msec
           • t3 = 58,8178 msec
           • t4 = 58,8325 msec    Dt = 0.0147 msec = 14.7 nanosec
                         L’analyseur TOF : Résumé

• C’es un analyseur pulsé : les ions sont envoyés par paquets (≠ quadripôle à balayage continu)

                               Sensibilité très élevée des TOFs


• Dans la pratique : gamme de masse illimitée (la limitation technique vient du détecteur) et
résolution maximale jusqu’à 60000 (en général 20000).
En général, résolution mono-isotopique

                              TOF = analyseur haute résolution




• Grande transmission : 90% des ions arrivent au détecteur (≠ quadripôle à balayage continu)
                             L’analyseur quadripolaire
Formé de quatre barres de métal parallèles (section hyperbolique) entre lesquelles les ions
sont injectés avec une énergie cinétique de quelques électron volts.
                                                                         Détecteur


                                      Ion résonnant

                              Ion non résonnant


                 Interface
                                                      - (Vdc - Vrf cos t)
                                                             +



                   Source

                   +(Vdc + Vrf cos t)


Un ion + sera attiré vers une barre -. Si le potentiel de la barre change de signe avant que l’ion
ne soit déchargé sur la barre, alors l’ion change de direction.


C’est un analyseur basé sur la « stabilité de la trajectoire » des ions entre les barres
L’analyseur quadripolaire
                  L’analyseur quadripolaire: Résumé

• Le quadripôle fait partie des analyseurs à stabilité de trajectoire
                inconvénient : beaucoup de perte d'ions (trajectoire instable)
                                 et donc perte de sensibilité


• Dans la pratique : gamme de masse jusque 4000 Da et résolution maximale jusqu’à 3000.
En général, insuffisant pour résolution mono-isotopique, résolution unitaire = résolution
suffisante pour distingué 2 masses différentes de 1 Da.

                            quadripole = analyseur basse résolution



• Balayage à vitesse uniforme sur l'ensemble de la gamme de masse indépendant de l'énergie
cinétique (au contraire du TOF).



• En mode RF : le quadripôle sert à focaliser la trajectoire des ions pour avoir une meilleure
translmission
                                La trappe ionique
La trappe ionique est constituée de 3 électrodes :
- un électrode annulaire en forme de diabolo
- deux électrodes quasi-hyperboliques

Les ions entrent et sortent de la trappe par des orifices au niveau des électrodes
chapeaux.

                                   Electrode annulaire
              Electrode chapeau                          Electrode chapeau




              Entrée des ions                               Sortie des ions




                                                         Gaz tampon : Hélium




                                    V cos t
          Les 5 éléments d’une trappe ionique

                             Electrode annulaire




                        Bagues d’isolation




Electrode chapeau d’entrée                         Electrode chapeau de sortie
              Schéma d ’un ES-trappe ionique
                                        RF quadripolaire

          N2                                                RF dipolaire
        chauffé      Skimmer
                                                                           Int.
              Cap.        Octopole


Spray                                         gaz : He

                                              électrode                                    m/z
             Pompes à vide                    annulaire


             Source ES                    Trappe ionique       Détecteur          Spectre MS

                                                                           Esquire (HP, Bruker)



Principe : les ions de différents m/z sont présents simultanément dans la trappe et on cherche
à les expulser en fonction de leur masse pour avoir un spectre
(≠ quadripôle : on règle les potentiels de manière à n’avoir qu’un seul m/z qui traverse les
barres)
                  L’analyseur Trappe ionique : Résumé

• La trappe ionique fait partie des analyseurs à stabilité de trajectoire




• Dans la pratique : gamme de masse jusque 6000 Da et résolution maximale jusqu’à 5000.

                         Trappe ionique = analyseur moyenne résolution




• Principale limitation : capacité de piégeage des ions




• Avantage : permet de faire de la MS multiple MSn n2 (pour le quadripôle n=2 seulement)
                     Nouvelle génération de trappe : piège orbital
   Makarov
                                      Orbitrap

                                                                                Oscillation
                                                                               axiale suit la
                                                                                 relation
                                                                                       k
                                                                              
Electrode extérieure en forme de                                                      m/ z
tonneau, électrode centrale en
fuseau
Trajectoire des ions due à
            - rotation ωφ
            - oscillation radiale ωr
            - oscillation axiale ωz
  Spirales entremêlées autour de l’électrode centrale

                                                                Fréquences déterminées par
                                                                transformée de Fourier
     •   Résolution          > 60 000 à m/z 400
     •   Précision < 5 ppm
     •   Sensibilité         sub-femtomolaire
     •   Vitesse             1 scan/sec à 60 000 resolution
                             4-5 scans/sec à 7 500 resolution
                                                                                   Thermo46
  Spectromètres de masse commerciaux:
  De nombreux couples source /analyseur sont possibles


                                           Q
  EI/CI
                                           BE
  FAB
                                          TOF
MALDI/LD
                                           IT
ES/APCI
                                        FT-ICR
      La spectrométrie de masse à plusieurs dimensions:
           Il y a plusieurs analyseurs qui se suivent

Les analyseurs peuvent être couplés et agir de façon séquentielle.
On parle alors de spectrométrie de masse à plusieurs dimensions


Un premier analyseur sélectionne les ions avec un certain m/z
On purifie donc un ion présent dans un mélange d’ion qui peut être très
complexe
L’ion « purifié » est alors fragmenté dans une chambre de collision.


Un deuxième analyseur mesure alors les m/z des fragments.
C’est de la MS-MS (spectrométrie de masse en tandem)

Si on répète l’opération, on fait de la MS-MS-MS ou MS3
Certain appareils permettent de faire de la MS10


La MS-MS est un puissant outil de détermination de structure
              Principe de la MS/MS:
                  étude d’ions fils



Source    MS1          Cellule      MS2     Détecteur
                     de collision




          Ion                       Ions     Spectre
 Ions              Fragmentation
         parent                      fils    MS/MS
                       (CID)

         Le premier
         analyseur
         ne balaye pas
            Obtention d’un spectre de masse MS/MS

Intensité


                                 Spectre de masse MS


                     m/z




                                 Sélection de l’ion parent
Intensité




                                 (précurseur)


                     m/z




                                 Spectre de masse MS/MS
Intensité




                                 (fragmentation)
                                 Rupture des liaisons les plus fragiles
                     m/z         Obtention d’informations structurales
        Principe de fragmentation dans la chambre de collision
                (Collision Induced Dissociation : CID)

                           Cellule de collision
Mi, z


                                                                       m1
                                                                       m2
                                                                       m3


                          mg


                                  DV
           Ec = Elab = ze DV                 Ecm = Elab mg / Mi + mg
                              Les analyseurs MSn



La MS-MS peut être réalisée par :
Deux quadrupôles                                                Q-Q
Un quadrupôle et un analyseur à temps de vol                    Q-TOF
Deux analyseurs à temps de vol                                  TOF-TOF
Un piège à ions (Ion Trapp)                                     IT
Une résonnance cyclotronique d’ion à transformée de Fourrier    FT-ICR




La MSn peut être réalisée par :
Un piège à ions (Ion Trapp)                                     IT
Une résonnance cyclotronique d’ions à transformée de Fourrier   FT ICR
         Les énergies de la collision en MS/MS dépendent
                    du type d’analyseur utilisé.

On peut obtenir des schémas de fragmentation différents selon les énergies utilisées

      Collision haute énergie                 Collision basse énergie

      en keV                                  en eV

      EB/EB ou BEB                            QQ

      EB/Q                                    Q-TOF

      EB/TOF                                  IT

      TOF/TOF                                 FT-ICR

      TOF (PSD)
MS/MS pour un appareil de type Q-TOF
        Analyse MS et (MS)n dans une trappe ionique

                                      Excitation
                                  3
Accumulation
  des ions            Isolation                        Fragmentation
1              2                                   4




    *
                                  5


2                                                         6
               Int.                                                       Int.


                                  Accumulation
                         m/z      des fragments                                  m/z

    Détection Spectre MS                                      Détection Spectre (MS)n
             Nomenclature des fragments peptidiques
                                          Bieman, Roepstorff, Fohlmann


                an        bn       cn



NH             CH        CO        NH        CH              COOH

               Rn                           Rn+1
dn, vn, wn                 xn        yn       zn
                                                      dn+1, vn+1, wn+1

             Fragments observés en haute et basse énergie

             Fragments observés seulement en haute énergie
              Spectre ESI-MS d’un digeste trypsique (m/z=681)

                    462.14
Intens.

 x104



                                                              864.96
 1.25
                                            MS/MS
                                                          809.97
 1.00      371.1

               391.26
                                      622.86                       887.36
 0.75                                                778.42
                                            681,33                              1076.29
                                 618.22
                                               720.30
                             543.37
 0.50                   529.35 577.29            756.82                     1010.39

                                                                                      1090.87
 0.25
                                                                                                1223.54



     300                              600                          900                     1200
ESI-IT-MS-MS de l’ion [M+2H]2+ à m/z=681

                            A
                        G

                   E
                                I/L
             K

       D
                               Interprétation d’un spectre MS/MS
      Intens.                                                                                                                                                       +MS2(870.3), 0.6-1.0min #(30-39)
        x10 5

                288.1

                                                                          Spectre MS/MS d’un peptide de masse 1738.6 sur
       1.25                                                                l’ESI-trappe (doublement chargé à m/z = 869.8)


                                                            E
                                                          129.0
       1.00
                                              A
                                                                           I/L
                                             71.0
                                                                          113.1
                                   G
                                  56.9
                          G                                       717.3                       F
                         57.0                                                               147.1
       0.75
                                                                                                              E
                                                                                                            129.0                      T
                                                                                                                                     101.0           T
                                                                                                    977.5                                          101.0
                                                  588.3
                                                                                                                         S                                      G
                                                                                                                        87.0                                   57.0                   Série Y
       0.50                               517.3                                     830.4




                                                                                                                                 1193.5


       0.25
                                                                                                                    1106.5

                                                                                                                                              1294.5


                                  460.4
                                                                                                                        1134.4
                                                                                            892.4                                                                    1452.5
                                                                           777.8
                              428.3                                                                                                       1262.5                                      1566.6
                                                                                                                                                           1395.5

       0.00

                        400                         600                       800                      1000                       1200                     1400                                 m/z




                                                                                                                         G T T S E F I/L E A G G
Détermination de proche en proche d'un Tag
                Interprétation d’un spectre MS/MS
                                                                                                            Série y



   GQ                       PA                    R
                                                                                            Ion parent
   XXMEAWDGXXLLLFSDX
                                                                                                            GQ


                                                                                                            185.08
  D
115.01                                                            D
                                                                115.03

                               I/L
                        I/L  113.06              PA                        W
               F      113.09            I/L               G              186.08
             147.06                   113.12            57.00
       S
     87.00                                     168.05
                                                                                    A
                                                                                  71.09
                                                                                            E
                                                                                          128.92     M
                                                                                                   131.00

                                                                                                              MH+-H2O



                                         920.46

								
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