TP DE GENETIQUE MOLECULAIRE APPLIQUEE IUP3
Vectorisation eucaryote
par transduction peptidique
PASCALE LE GOFF ET DENIS MICHEL
Aspects techniques vus dans ce TP :
Production de protéines recombinantes. Chromatographie d'affinité. Activité enzymatique -
galactosidase mesurée in situ. Vectorisation protéique-transduction. Mutagenèse simple. Préparation
de bactéries compétentes et transformation bactérienne. PCR analytique. Extraction d’ADN
plasmidique.
Organisation des trois jours
J1 Préparation du mutant Bam--gal : digestion BamHI du plasmide TAT--gal.
Ré-ensemensement des BL-21 et suivi de DO pour la préparation de bactéries compétentes
Analyse de la digestion par électrophorèse sur gel d'agarose
Préparation des boîtes agar-ampi avec et sans X-gal/IPTG
Cultures de 200 ml des colonies TAT--gal et -gal (Bam) pour atteindre DO 0,6.
Induction à l'IPTG
Ligation
Préparation de bactéries compétentes
Transformation plasmide TAT--gal contrôle et du mélange de ligation Bam
Etalement de chaque plasmide sur boîtes agar-ampi avec et sans X-gal/IPTG (4 boîtes en tout)
Récupération et congélation des bactéries
Equilibration des billes Ni:NTA
J2 Sur les boîtes de transformation : examen du nombre et de la couleur des colonies
Choisir 3 grosses colonies de TAT- -gal et de Bam sur chaque boîte sans X-gal/IPTG
Ensemencer des minicultures de 1 ml
Extractions des protéines recombinantes TAT--gal et -gal à partir des culots bactériens
Lancer les PCR à partir des mini cultures et compléter les volumes à 5 ml
Ensemencement des cellules COS-7 et CHO
Préparation SDS-PAGE
Dosage de Bradford des aliquots prélevés au cours de la purification
J3 Incubation des cellules avec TAT--gal et -gal purifiées
Coloration in situ des cellules incubées avec TAT--gal ou -gal
Migration des SDS-PAGE
Analyser les PCR sur gel 2,5 % agarose
Préparations de l'ADN plasmidique et vérification par électrophorèse
Coloration et décoloration des gels d’acrylamide
Regarder les colorations -gal in situ au microscope
L'ordre des manipulations n'est qu'indicatif et peut être modifié pour une meilleure organisation du
temps
1
Sommaire
Organisation des trois jours. p1
Rappels théoriques.
1-Extraction d’ADN plasmidique. p3
1-1-Lyse alcaline. p3
1-2-« Boiling method ». p3
2-Réaction de polymérisation en chaîne : PCR. p4
2-1-Principe. p4
2-2-Mise en place d’une réaction de PCR. p5
3-Le vecteur d’expression bactérien pTAT-HA. p7
4-IMAC : Immobilized Metal Affinity Chromatography. p10
4-1-Principe. p10
4-2-Purification d’une protéine produite en système bactérien
par IMAC. p11
Manipulations.
1-Elimination de la partie TAT du plasmide TAT--gal. p14
1-1-Elimination de la partie TAT du palsmide pTAT--gal. p14
1-2-Préparation de bactéries compétentes et transformation p15
1-3-Criblage des colonies par PCR. p16
1-4-Mini préparation d’ADN plasmidique p17
2-Purification des protéines TAT--gal et -gal. p18
2.1-Culture des bactéries et induction par l’IPTG. p18
2.2-Purification des protéines recombinantes TAT--gal et -gal. p19
2.3-Analyse par SDS PAGE de la purification. p20
3-Transduction peptidique. p23
3.1-Repiquage des cellules eucaryotes. p23
3.2-Transduction peptidique. p24
3.3-Détection in situ de l’activité -galactosidase. p24
Bibliographie. p25
Annexe. p26
2
Rappels théoriques.
1-Extraction d’ADN plasmidique.
Il existe deux principales techniques qui permettent d’extraire l’ADN plasmidique.
1-1-Lyse alcaline.
La lyse alcaline (Birnboim, 1983; Birnboim and Doly, 1979) est vraisemblablement la technique
la plus souvent utilisée au cours des extractions d’ADN plasmidique. Les bactéries sont lysées par un
traitement court avec une solution contenant du SDS et du NaOH. Le SDS dénature les protéines
bactériennes tandis que l’ADN du chromosome bactérien et l’ADN plasmidique est dénaturé par la
soude. Le mélange est ensuite neutralisé par de l’acétate de potassium ce qui permet à l’ADN
plasmidique de se renaturer rapidement. L’ADN bactérien et les protéines précipitent ainsi que le SDS
qui forme un complexe avec le potassium. Cet ensemble est éliminé par centrifugation. L’ADN
plasmidique en solution peut être directement récupéré après précipitation éthanolique.
1-2-« Boiling method ».
Cette technique également très répandue consiste, dans un premier temps, à fragiliser les
bactéries en présence de lysozyme, qui clive les composés polysaccharidiques de la paroi bactérienne.
L’utilisation d’un détergent non ionique (tritonX-100) et de la chaleur (le mélange est généralement
porté 1 à 2 min à 100°C) va briser la paroi bactérienne déjà fragilisée par l’action du lysozyme
(Holmes and Quigley, 1981). L’ADN plasmidique ainsi que l’ARN sont libérés mais pas l’ADN
bactérien qui reste emprisonné dans les cellules lysées. Ce culot qui contient les débris cellulaires et
l’ADN bactérien est éliminé par centrifugation.
Pour de nombreux emplois comme la transfection ou le séquençage il est indispensable d’ajouter
au moins une étape supplémentaire de purification. Il peut s’agir d’une extraction phénolique suivie ou
non d’une précipitation en présence de polyéthylène gycol ou bien encore d’une précipitation en
présence d’un détergent cationique, le CTAB (cétyl triméthyl ammonium bromide) (Del Sal et al.,
1988). On peut aussi purifier une solution d’ADN plasmidique par chromatographie sur résine
échangeuse d’ions. C’est probablement la technique la plus efficace. Le plus souvent on utilise des
colonnes de chromatographie disponible dans le commerce. Cette technique est donc plus coûteuse et
doit être réservée à des emplois particuliers.
2-Réaction de polymérisation en chaîne : PCR.
La réaction de polymérisation en chaîne a été inventée par Kary Mullis au milieu des années 80
et a révolutionné les pratiques de la génétique moléculaire en permettant la production in vitro d’une
grande quantité d’un ADN spécifique sans avoir recours aux techniques de clonage. La versatilité de
3
cette technique fait qu’elle est utilisée dans tous les domaines de la biologie et il serait difficile de
lister toutes ses applications.
2-1-Principe.
Le matériel de départ est de l’ADN double brin qui contient la séquence à amplifier. Il n’est pas
nécessaire de purifier la séquence à isoler, elle sera déterminée par le couple d’amorces utilisé dans la
réaction. C’est l’hybridation de ces amorces sur l’ADN qui va ensuite amener la DNA polymérase à
synthétiser une région spécifique d’ADN. Il est donc indispensable de connaître au moins en partie la
séquence de l’ADN à amplifier afin de déterminer la séquence des amorces. En plus de l’ADN et du
couple d’amorces le mélange réactionnel doit contenir une DNA polymérase et les quatre
desoxynucléotides triphosphates.
Pour commancer, le mélange réactionnel est chauffer pendant 5 minutes à 94°C. Cette
température permet la dénaturation les molécules d’ADN. Les simples brins obtenus serviront de
matrice pour la DNA polymérase et l’hybridation des amorces.
La température est ensuite abaissée pour permettre l’appariement des amorces. Le choix de la
température d’hybridation est un point très important pour la spécificité de la réaction de PCR. Cette
température dépend de la séquence des amorces et de la concentration en sels du milieu réactionnel.
Des programmes informatiques simples permettent de calculer la température de fusion (Tm) des
amorces et la température d’hybridation peut être choisie quelques degrés au-dessous de cette Tm. La
température utilisée pour cette deuxième étape est généralement comprise entre 55° et 68°C.
Pour l’étape suivante, la température est augmentée à 72°C, température optimale pour la Taq
polymérase. C’est la découverte d’une DNA polymérase thermostable qui a permis le développement
spectaculaire de la technique de PCR. La DNA polymérase de Thermus aquaticus, bactérie vivant
dans des sources chaudes, n’est pas dénaturée même à 94°C. L’enzyme ajoutée en début de réaction va
rester active au cours des différents cycles malgré les variations de température. De plus, il est
intéressant d’utiliser une température élevée (72°C, température supérieure à la température
d’hybridation des amorces) pour l’étape de polymérisation, cela empêche un appariement moins
spécifique des amorces. Le temps nécessaire à la polymérisation est dépendent de la longueur de
l’ADN cible. Généralement on prévoit 1 min par kb d’ADN à synthétiser. A la fin de la
polymérisation, la température est à nouveau augmentée, mais cette fois-ci uniquement pendant 30 s à
1 min afin de permettre la dénaturation des courts fragments d’ADN synthétisés. Ces simples brins
servent de matrice pour un nouveau cycle d’amplification. La figure 1 illustre ces différentes étapes.
Ainsi la PCR permet une amplification exponentielle d’ADN et conduit à un maximum théorique de 2n
molécules d’ADN double brin à la fin de n cycles.
4
2-2-Mise en place d’une réaction de PCR :
Compte tenu de la puissance de la PCR il est indispensable de travailler dans un endroit qui ne
soit pas contaminé par de l’ADN.
L’ADN, qualité et quantité.
La qualité et la quantité de l’ADN à amplifier sont deux facteurs qui affectent la PCR plus
particulièrement, sa sensibilité et l’efficacité de l’amplification. Comme l’amplification nécessite des
réactions enzymatiques répétées, elle est beaucoup plus sensible aux impuretés telles que des sels, des
solvants (phénol, chloroforme), de l’éthanol et d’autres produits chimiques, qu’une réaction
enzymatique qui aurait lieu en une seule étape.
L’efficacité d’hybridation des amorces sur la matrice est un facteur important. Le rapport
primer/matrice influence fortement la spécificité et l’efficacité de la PCR et il doit être optimisé
empiriquement. Si trop peu de matrice est utilisé, les amorces trouveront difficilement leurs séquences
complémentaires. En revanche, l’utilisation d’une concentration trop élevée d’ADN cible peut
conduire à des hybridations aspécifiques des amorces. On peut démarrer une réaction de PCR avec
500 ng d’ADN génomique, 1 à 10 ng d’ADN bactérien et 0,1 à 500 ng d’ADN plasmidique.
Les amorces.
Pour réussir une PCR il faut une paire irréprochable de amorces : La longueur des amorces est
généralement comprise entre 18 et 30 nucléoides, le contenu en GC se situe entre 40 et 60%, les Tm
des deux amorces sont proches, les séquences complémentaires entre les amorces sont évitées et ils ne
forment pas de structure secondaire interne. Chaque amorce est utilisé à une concentration
généralement comprise entre 0,1 et 0,6 µM. Le plus souvent une concentration de 0,2 µM est adaptée.
Enfin, les amorces peuvent être conservés à –20°C dans du Tris 5mM pH 7,5..
La DNA polymérase thermostable.
Depuis la Taq polymérase d’autres DNApolymérases thermostables ont été purifiées et sont
maintenant commercialisées. Ces enzymes ont des propriétés différentes, elles sont capables de copier
des fragments d’ADN plus ou moins longs avec des fiabilités plus ou moins grandes.
Les ions Mg++.
Les ions Mg++ forment des complexes solubles avec les dNTP et l’ADN matrice. Ces complexes
sont le véritable substrat reconnu par la DNA polymérase. Les ions Mg++ sont donc indispensables à la
réaction de PCR. En excès, ils peuvent favoriser l’hybridation aspécifique des primers, à trop faible
concentration ils vont réduire l’efficacité de l’amplification. Leur concentration dépend de la
concentration dans le milieu de composées comme les dNTP, le phosphate inorganique et l’EDTA
(qui provient du tampon). Ces composés fixent les ions Mg++ grâce à leurs charges négatives. La
concentration optimale en ions Mg++ doit être déterminée empiriquement et varie généralement entre 1
et 5 mM. La concentration en Mg++ la plus communément utilisée est 1,5 mM avec une concentration
de chaque dNTP de 200 µM.
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Figure 1 : PCR
a) Le matériel de départ est de l’ADN
double brin. b) Les brins sont séparés par
chauffage à 94 °C puis la température est
abaissée au-dessous de la Tm des amorces
afin de permettre leur appariement de part
et d’autre de la séquence d’ADN à
amplifier. c) La Taq polymérase
synthétise les nouveaux brins d’ADN
complémentaires des brins matrices. Rien
ne limite leur extension. Ils peuvent donc
être de longueur variable et ils vont
s’étendre au-delà de la position
d’hybridation du primer sur le brin
complémentaire. d) Le milieu réactionnel
est chauffé à nouveau pour séparer les
brins d’ADN. Pour simplifier le schéma
seuls les brins néo-synthétisés sont
représentés. e) La Taq polymérase
synthétise de nouveaux brins d’ADN
mais cette fois leur extension est limitée.
Ces deux nouveaux brins s’étendent entre
la région déterminée par l’hybridation
desamorces. f) Le processus est répété, les
amorces s’apparient et g) deux nouveaux
fragments d’ADN sont synthétisés. Ainsi
à chaque cycle le nombre de molécules
d’ADN est multiplié par deux.
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3-Le vecteur d’expression bactérien pTAT-HA.
Le vecteur d’expression pTAT-HA (Schwarze et al., 1999) présenté (figure 2) a été
construit à partir d’un vecteur de la famille pET dont il existe de nombreuses versions
commercialisées par Novagen. Il présente les caractéristiques suivantes :
L’origine de réplication du plasmide pBR322 qui permet d’obtenir entre 15 à 20 copies
de l’ADN plasmidique par cellule bactérienne, ce qui est peu. Les origines de réplication des vecteurs
pUC, pBluescript ou pGEM par exemple (origines ColE1 ou pMB1 mutées) permettent d’obtenir un
bien plus grand nombre de copies par cellules entre 500 et 700 ce qui facilite la préparation d’ADN
plasmidique mais peut conduire à une trop forte production de protéine exogène. Cela peut conduire à
des problèmes d’insolubilité et/ou de toxicité.
Le gène de la -lactamase qui code la résistance à l’ampicilline. Ainsi les bactéries qui
possèdent ce type de plasmide peuvent pousser dans un milieu contenant de l’ampicilline.
Le gène cible, codant dans notre cas la -galactosidase, est sous le contrôle du
promoteur de la RNA polymérase du bactériophage T7 (Dubendorff and Studier, 1991) ainsi que des
séquences nécessaires à sa traduction. Ces signaux ne sont pas fonctionnels chez E. coli. L’expression
de la protéine cible est possible uniquement lorsque l’on apporte une source de RNA polymérase T7.
Cette source provient d’une souche particulière de E. coli, BL21(DE3)pLys qui a l’avantage d’être
déficiente pour deux protéases Ion et ompT. DE3 indique que la bactérie porte sur son chromosome
une copie du gène codant la RNA polymérase du bactériophage T7 sous le contrôle du promoteur
lacUV5. Ce promoteur contient la séquence opérateur de l’opéron lactose. La production de la
polymérase T7 est donc inductible en présence d’IPTG. En revanche, il diffère de promoteur lac
sauvage. Sa séquence en position -12, -7 est TATAAT ce qui correspond à la séquence consensus. Ces
modifications permettent à la transcription d’être considérablement augmentée et cette forte
transcription devient indépendante de l’activateur CAP (Meiklejohn and Gralla, 1989; Silverstone et
al., 1970).
Le site multiple de clonage (MCS) qui renferme 7 séquences pour des sites uniques de
restriction.
Une succession de 6 codons histidine génère le Tag 6xHis qui permet la fixation sur
résine de Ni-NTA-agarose. Ce Tag peut être placé à l’extrémité C- ou N-terminale de la protéine
d’intérêt. Il est peu immunogénique et à pH 8,0 ses acides aminés non chargés n’affectent
généralement pas la sécrétion, la compartimentation ou le repliement de la protéine de fusion. Le plus
souvent, le Tag 6xHis n’interfère pas avec la structure ou la fonction de la protéine purifiée comme
cela a pu être démontré pour une grande variété de protéines incluant des enzymes et des facteurs de
transcription.
Le Tag HA est une séquence de 9 acides aminés (figure 2) correspondant à un épitope
de l’hémaglutinine. Cette séquence qui sera en fusion avec la protéine exogène lui ajoute cet épitope
7
pour lequel on possède un anticorps spécifique commercialisé. Cette étiquette permet par exemple de
repérer par Western blot l’expression de la protéine recombinante.
La séquence TAT correspond à un peptide de 11 acides aminés dérivé de la protéine
TAT du virus HIV. Ce peptide a été décrit comme un domaine de transduction, « protein transduction
domain » ou PTD (Wadia and Dowdy, 2002). Les PTDs sont de petits domaines identifiés dans
diverses protéines, ils ont la propriété particulière de traverser efficacement les membranes
biologiques. Ce phénomène, dont le mécanisme est encore très discuté est appelé transduction
peptidique. Des protéines ou d’autres composés liés à un PTD vont eux aussi traverser une membrane
biologique. Ces PTDs ont donc un potentiel extraordinaire pour délivrer à l’intérieur d’une cellule des
composés ou des protéines biologiquement actifs.
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Figure 2 : Carte du plasmide pTAT-HA
Le promoteur T7 et le domaine TAT sont surligné, le Tag poly histidine est encadré.
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4- IMAC : Immobilized-metal Affinity Chromatography.
La technique d’IMAC a été utilisée pour la première fois en 1975 pour la purification des
protéines (Porath et al 1975). C’est une technique de séparation adaptée à la purification de protéines
qui possèdent des histidines exposées à leur surface ou bien des protéines recombinantes auxquelles on
a ajouté un groupe d’histidines.
IMAC est une chromatographie d’affinité qui peut permettre de purifier une protéine en une
seule étape. Cette technique est cependant moins spécifique que d’autres types de chromatographie
d’affinité (enzymes/cofacteurs–inhibiteurs, récepteurs/ligands, antigène/anticorps), le ligand est
cependant plus stable et peut facilement être greffé à l’extrémité C- ou N-terminale d’une protéine. Ce
type de chromatographie est très largement utilisé aujourd’hui pour la préparation de protéine à plus
ou moins grande échelle mais aussi pour étudier l’accessibilité de certains acides aminés.
4-1-Principe.
En IMAC l’adsortion des protéines est basée sur la coordination entre un métal immobilisé et un
groupe donneur d’électrons de la surface de la protéine. Les métaux les plus couramment utilisés sont
des métaux de transition comme Cu2+, Ni2+,Zn2+et Fe3+qui sont des accepteurs de paires d’électrons.
Les atomes donneurs d’électrons sont N, S et O présents dans les composés chélateurs qui sont
couplés au support de chromatographie par exemple de l’agarose. Ces composés sont capables de
coordonnés des ions métalliques et de former ainsi des métaux chélatés. Les sites de coordination qui
restent libres sont habituellement occupés par des molécules d’eau mais peuvent être échangés par des
groupes donneurs d’électrons de la protéine. En plus de l’amine N-terminale certains acides aminés
comme Tyr, Cys, His, Arg, Lys et Met peuvent participer à la liaison grâce aux atomes donneurs
d’électrons de leur chaîne latérale. Cependant, les cystéines par exemple sont rarement disponibles
dans un état réduit approprié et la rétention des protéines est surtout basée sur la disponibilité de
résidus histidyl. Les chaînes aromatiques de Trp, Phe et Tyr peuvent participer à la rétention des
protéines si elles se trouvent dans le voisinage de résidus histidyls. Pour les protéines recombinantes, il
y a de nombreuses possibilités pour construire un Tag efficace. En pratique les solutions les plus
simples sont retenues et des Tag constitués de 6 ou 10 histidines greffés en N- ou C- terminal de la
protéines sont le plus souvent utilisés.
Les composés chélateurs de métaux disponibles sont nombreux. Les plus utilisés sont
probablement l’acide iminodiacétique (IDA) et l’acide nitrilotriacétique (NTA), développé par
Hoffmann-La Roche et commercialisé par QIAGEN (figure 3). IDA possède trois sites de chélation
des métaux tandis que le NTA en possède 4 (figure 4). Ainsi NTA a une meilleure affinité pour les
métaux que IDA mais une capacité de liaison pour les protéines plus faible compte tenue de la perte
d’un site de coordination. Cette meilleur affinité pour les métaux prévient une fuite d’ions lors de la
purification de protéines à fort pouvoir chélateur ainsi que lors des étapes de lavage les plus
stringentes. Cela évite la contamination par l’ion métallique de la protéine purifiée.
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Les supports solides sur lesquels sont greffés les composés chélateurs sont variés. Ils peuvent
être de l’agarose ou d’autres polysaccharides. Des supports nouveaux ont été développés constitués de
billes inorganiques combinées à des polysaccharides qui peuvent supporter les hautes pression des
systèmes HPLC.
Figure 3 : Comparaison des interactions entre
des ions nickel et les acides nitrilotriacétique
(NTA) et iminodiacétique (IDA).
Figure 4: Interactions
entre résidus voisins du
Tag 6xHis et la matrice
Ni-NTA.
4-2-Purification d’une protéine recombinante possédant un Tag 6xHis sur Ni-NTA agarose.
Conditions natives ou dénaturantes ?
Une protéine recombinante fusionnée à un Tag polyhistidine peut être purifiée par IMAC à
partir de bactéries soit en conditions natives soit en conditions dénaturantes. Lorsque la protéine
recombinante est soluble et son Tag 6xHis accessible, il est possible de la purifier sans utiliser
d’agents dénaturants ou de détergents. En revanche lorsque la protéine produite par les bactéries est
stockée sous forme insoluble dans des corps d’inclusion, elle devra être purifiée en conditions
dénaturantes. Cette insolubilité est liée à la nature même de la protéine recombinante (présence de
domaines hydrophobes) ou à une trop forte expression. La plupart des protéines accumulées dans les
corps d’inclusion peuvent être solubilisées en présence de détergents, d’urée 8M ou de chlorure de
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guanidine 6M. En conditions dénaturantes les histidines du Tag seront parfaitement exposées
favorisant ainsi la liaison à la matrice. L’efficacité de purification sera ainsi maximale. Cependant, si
l’on souhaite récupérer l’activité biologique de la protéine après ce type de purification il faudra
prévoir l’élimination des agents dénaturants par des étapes de dialyse par exemple et un protocole
permettant la renaturation de la protéine.
Accrochage.
Des protéines contenant un Tag 6xHis peuvent se lier aux groupements Ni-NTA avec une
affinité plus forte que celle qui existe entre un anticorps et son antigène ou bien une enzyme et son
substrat. La liaison ne dépend pas de la structure tridimensionnelle de la protéine c’est pourquoi il est
possible de travailler en conditions dénaturantes. Si le Tag n’est pas entièrement accessible il peut tout
de même lier le nickel. Au minimum deux His sont nécessaires à la liaison, l’affinité de la liaison
protéine recombinante pour Ni-NTA est alors plus faible.
L’étape de liaison peut se faire en « batch » ou sur colonne. Pour limiter l’accrochage sur la
colonne de protéines qui ont une faible affinité pour Ni-NTA il est souvent recommandé d’effectuer
cette étape en présence de 10-20 mM imidazole. Le noyau imidazole fait partie de la structure de
l’histidine (figure 5) . Il se lie aux ions nickel retenus par le NTA. A faible concentration en imidazole,
l’accrochage des protéines ayant une faible affinité pour le nickel est empêché tandis que celui des
protéines ayant une forte affinité pour le métal n’est pas affecté.
Figure 5: Structure
chimique de l’imidazole
et de l’histidine.
Lavage.
Des lavages sont effectués le plus souvent en présence d’une faible concentration d’imidazole
(voir ci-dessus). La stringence des lavages peut être augmentée en réduisant le pH jusqu’à une valeur
de 6,3 ou en augmentant la concentration en imidazole jusqu’à 50 mM. Ces conditions de pH et de
concentration en imidazole devront être déterminées empiriquement pour chaque protéine
12
Elution.
Les histidines du Tag 6xHis ont un pKa d’approximativement 6,0 et vont être protonées si le pH
est diminué pH (4,5-5,3). Dans ces conditions le Tag 6xHis ne peut plus lier les ions nickel et la
protéine recombinante est éluée.
De la même manière, si la concentration en imidozale est augmentée (400-500mM ou plus), le
Tag 6xHis sera dissocié parce qu’il ne peut plus entrer en compétition pour les sites de liaison de la
résine.
Des réactifs comme l’EDTA ou l’EGTA chélatent les ions nickel et suppriment donc leur
interaction avec le support insoluble, le NTA-agarose. Cela provoque l’élution de la protéine
recombinante complexée au métal.
Ces trois méthodes d’élution sont efficaces. Cependant, et plus spécialement lorsque la
purification est menées en conditions natives, il est préférable d’éluer en augmentant la concentration
en imidazole. En effet une diminution du pH peut endommager une protéine et la présence d’ions
métalliques est souvent indésirable. Des fortes concentrations d’imidazole peuvent également détruire
partiellement ou complètement l’activité d’une protéine.
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Manipulations
1-Elimination de la partie TAT du plasmide TAT--galactosidase.
Objectif :
Le plasmide pTAT--Gal (fourni) sera digéré par Bam HI ce qui permettra d’éliminer le
domaine de transduction peptidique TAT (figure 2) sans modifier le cadre de lecture. Après ligation,
ce nouveau plasmide "Bam" sera introduit dans des bactéries compétentes. Finalement la
construction sera vérifiée par PCR.
LUNDI
1-1-Elimination de la partie codant TAT du plasmide pTAT--Gal -> plasmide "Bam"
Digestion du plasmide pTAT-Gal par BamHI.
Digestion (D) Témoin (T)
H2O qsp 20µl qsp 20µl
Plasmide 0.2 µg/µl 1 µg 1 µg
Tampon 10x 2 l 2 l
BamHI (10 u/l) 0,5 l 0 µl
Incuber 1h30 à 37 °C.
Pendant l’incubation, préparer un gel d’agarose à 0,8 % : peser 0,72 g d'agarose, y
ajouter 90 ml de tampon 1xTBE, dissoudre au micro-onde, refroidir légèrement, ajouter 7 l de BET à
10 mg/ml, et couler.
A 9 l des mélanges de digestion D ou T, ajouter 1 µl de tampon de charge 10x pour
ADN déposer sur gel 0,8% agarose-TBE-BET. Déposer parallèlement 5 µl du marqueur de taille pour
grand fragments (DNA ladder 200 à 10 000 bp p 25). Si la linéarisation apparaît totale aux UV,
chauffer le mélange de digestion à 65°C pendant 2 min .
Ligation de re-circularisation des plasmides digérés (D) ou non (T).
H2O qsp 10 l
Incubation des plasmides D ou T 2 l
Tampon ligase 10x 1 l
ATP 10 mM 1 l
DNA ligase (5u/l) 0,5 l
Incuber au moins 1h30 à 4°C, une température basse défavorise les concatémérisations
au profit des circularisations
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1-2-Préparation de bactéries compétentes et transformation.
Préparation des boîtes pour bactéries.
Stabiliser au bain-marie à 55 °C des bouteilles autoclavées de LB-Agar fondu.
Ajouter l'ampicilline à 50 g/ml final (stock 50 mg/ml) et mélanger en tournant la
bouteille sans faire mousser.
Couler 4 boîtes rondes de 10 cm sans faire de bulles. Laisser solidifier.
Faire sécher les boîtes entrouvertes autour d'un bec benzen.
Sur 2 des boîtes (à marquer "X-gal/IPTG"), étaler en surface 150 l d'un mélange (80 l
LB, 50l IPTG 100 mM, 20 l Xgal à 40 mg/ml). Laisser sécher.
Préparation de bactéries compétentes.
ATTENTION : Les bactéries doivent être constamment maintenues à 4 °C. Le moindre
réchauffement annule leur compétence
Inoculer 25 ml de LB avec 2,5 ml de culture bactérienne de nuit (BL-21, fournies).
Incuber en agitateur orbital à 37°C pendant 1-2 heures.
Lorsque la DO600nm atteint 0,6 à 1, refroidir la culture dans la glace.
Transvaser la culture dans un tube à centrifuger de 40 ml (un tube par binôme).
Centrifuger à froid 8 krpm/10min/4°C. Eliminer le surnageant.
Reprendre les culots dans 2 ml de CaCl2 0,1 M froid.
Recentrifuger. Reprendre le culot dans 2 ml de CaCl2 0,1 M froid.
Laisser dans la glace pendant 40 min. Centrifuger 6 krpm/10min/4°C. Eliminer le
surnageant.
Resuspendre dans 0,4 ml de CaCl2 0,1 M froid et les garder dans la glace. Utilisable
pour une transformation dans les 4 heures.
Si la transformation est reportée, ajouter 20% final glycérol, et stocker à –70°C en
aliquotes de 100 l, à décongeler dans la glace pour les transformations.
Transformation bactérienne.
Ajouter tous les mélanges de ligation D et T séparément dans 50 l de bactéries
compétentes sur la glace.
Laisser 30 minutes dans la glace.
Mettre à 42°C pendant 1,5 minutes, puis replacer dans la glace 5 minutes.
Ajouter 200 µl de Luria Broth et incuber à 37°C/30 minutes.
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Etaler chaque transformation sur boîte agar-ampicilline. 2 boîtes par transformation :
100 µl sur boîte avec X-gal/IPTG et 100 µl sur boîte sans X-gal/IPTG => 4 boîtes en tout par binôme.
Bien identifier les boîtes au feutre.
Incuber les boîtes placées à l'envers à 37°C toute la nuit. Les boîtes seront ensuite
conservées à 4°C
MARDI
Traitement des boîtes de transformation.
Examiner les boîtes de transformation : noter le nombre et la couleur des colonies sur
chaque boîte. Calculer l’efficacité de transformation, c’est à dire le nombre de colonies résistantes à
l’ampicilline obtenues par µg d’ADN. Les efficacités de transformation obtenues sont très variables en
fonction de la souche bactérienne et de la méthode de préparation utilisées. Ces efficacités peuvent
varier de 104 à 107 colonies résistantes par µg d’ADN.
Choisir 3 grosses colonies de TAT- -gal et de Bam. Prélever ces colonies au cure-
dent ou au cône jaune et les disperser dans un tube contenant 1 ml de LB. Incuber à 37°C pendant 3 ou
4 heures. Ces mini cultures seront utilisées pour la vérification par PCR (5 µl à prélever stérilement).
Ajouter 4 ml de LB ampicilline à chaque culture. Une culture positive sera utilisée pour l’extraction
d’ADN plasmidique (p 17).
1-3-Criblage des colonies par PCR.
Dans les 6 tubes PCR contenant 5 l de culture bactérienne et dans un tube contenant 5
l d'eau (témoin de "contamination PCR"). Rajouter 45 l de prémix suivant:
Exemple de prémix pour 10 tubes:
H2O qsp 450 l
Buffer Taq 10x 50 l
dNTP, 25 mM chacun 2 l
Oligo TAT-Up (1g/ll) 2 l
Oligo TAT-Do (1g/ll) 2 l
Taq pol. (5u/l) 2 l
ATTENTION : l’enzyme doit être ajoutée à peu près simultanément pour l’ensemble des
binômes afin de démarrer rapidement la PCR après l’ajout de l’enzyme.
Oligonucléotides: TAT-UP: 5'-ACGACTCACTATAGGGAGACC-3'
TAT-DO: 5'-TGGGACGTCATATGGATAGCC-3'
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Vous pouvez rechercher la position d’hybridation de ces amorces sur la figure 2 et calculer la taille des
fragments qui seront amplifiés.
Fermer les tubes et les placer dans l'appareil PCR programmé de la manière suivante :
94°C 5 min
28 cycles de 3 températures (94°C 30s; 60°C 30s; 72°C 40s)
72°C 3 min
4°C
MERCREDI
Déposer 15 l de chaque PCR avec 2 l de tampon de charge (10x) pour ADN, sur gel
3% agarose-TBE-BET, avec en parallèle 4 l d'un marqueur de taille adéquat (voir annexe 1).
1-4-Mini préparation d’ADN plasmidique"Boiling Method".
Il faut maintenant reconstituer des stocks de plasmide pour les futurs TP:
Choisir d’après vos résultats de PCR une culture TAT- -gal.
Prélever 1,5 ml de cette culture et centrifuger 5 min à 12000 rpm. Eliminer le
surnageant et renouveler l’étape précédente dans le même tube.
Reprendre le culot, correspondant à 3 ml de culture, dans 300 l de STET (sucrose 8%,
Triton x-100 0,1%, EDTA 50 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8.
Bien vortexer pour éliminer tous les grumeaux.
Ajouter 8 l de lysozyme à 100 mg/ml, vortexer, puis incuber 1 min au bain-marie
bouillant.
Centrifuger immédiatement en sortant du bain-marie à 14000 rpm pendant 20 min.
Retirer le culots visqueux avec un cure-dents en bois, l'essuyer sur un papier.
Ajouter 7 l de NaCl 5M
Ajouter 200 l d'isopropanol et vortexer
Mettre au moins 15 min à –20°C.
Laisser fondre si le mélange est pris en masse, puis centrifuger 10 min/14000 rpm/4°C.
Bien éliminer le surnageant, en finissant au cône jaune pour enlever la dernière goutte.
Bien laisser sécher le culot à l'air.
Dissoudre dans 100 l de TE: 10-1 contenant 50 g/ml de RnaseA. Chauffer 10 min à
65°C.
Si le temps le permet digérer pendant 1h30 à 37 °C 8,5 µl de la préparation en présence
de 1 µl de tampon Bam HI 10X et de 0,5 µl d’enzyme.
17
Contrôler la qualité et la quantité du plasmide en déposant 9 l de la solution d’ADN
plasmidique + 1 µl de tampon de charge 10X sur gel 1% agarose-TBE-BET. Parallèlement faire
migrer la digestion BamHI et les marqueurs de taille adéquats (c.f. annexe 1).
Réunir les minipreps des binômes ayant de bons résultats. Doser la concentration de
l'ADN de ce mélange au spectrophotomètre à 260 nm. Etiqueter le tube avec la date et la
concentration. Le congeler pour le TP de l'année prochaine.
2-Purification des protéines recombinantes TAT- -Gal et -Gal.
Objectif :
Deux souches de bactéries recombinantes BL21-TAT- -Gal et -Gal vont être cultivées en
présence d’IPTG afin d’induire la production des deux protéines. Les deux protéines seront ensuite
purifiées par IMAC en conditions natives grâce à leur Tag 6xHis. Les différentes étapes de la
purification seront analysées par SDS PAGE. L’utilisation de conditions natives de purification
préserve l’activité -galactosidase et permet l’incubation directe des protéines purifiées en présence
de cellules eucaryotes pour la transduction peptidique sans étape supplémentaire de dialyse et de
renaturation.
LUNDI
2-1- Culture et induction par l’IPTG des bactéries BL21-TAT et BL21-TAT- -gal.
Culture et induction
Mener TAT- -gal et -gal séparément dans des tubes différents.
Ensemencer 150 ml de LB (+ 150 µl d’ampicilline à 50 mg/ml) avec 15 ml des
précultures des colonies TAT--gal ou -gal pendant environ 2 heures (DO600nm = 0.7), ajouter
400 µl d'IPTG ( 100 mM) et continuer l'incubation 3 heures.
Culotter les bactéries 10 min à 5000 rpm.
Reprendre chaque culot dans 2 ml PBS froid contenant 20 mM imidazole. Transvaser
chaque culot dans 2 tubes de 2 ml.
Centrifuger 10 min à 5000 rpm. Eliminer les surnageants congeler les 4 culots secs
jusqu’au lendemain.
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Equilibration des billes Ni-NTA. Pour la purification protéique du lendemain.
Ni-NTA agarose est composé de Ni-NTA couplé à du Sepharose CL-6B. La concentration de NTA
permet la fixation de 5 à 10 mg de protéines en fusion avec le Tag 6xHis-par millilitre de résine.
Prélever le volume nécessaire de billes (dans l'alcool), 500µl par binôme.
Centrifuger 15" à 12 000 rpm, éliminer le surnageant.
Ajouter 1 volume de PBS contenant 20 mM imidazole.
Centrifuger 15" à 12 000 rpm, éliminer le surnageant.
Ajouter 1 volume de PBS contenant 20 mM imidazole. Les billes sont prêtes.
MARDI
2-2-Purification des protéines recombinantes TAT- -gal et -gal.
Décongeler les 4 culots bactériens et ajouter 1 ml par tube de PBS imidazole 20 mM et
des inhibiteurs de protéases (PI 25X 2,5l/ml ) et 1 mg/ml de lysozyme incuber sur la glace pendant
10 min.
Soniquer 3 fois 15 sec en incubant 30 s sur la glace après chacune des sonications.
Eliminer les débris cellulaires et protéines insolubles par centrifugation 15 min à 14000
rpm.
Reprendre 1 culot TAT--gal et 1 culot -gal (="insoluble" I) dans 500 µl de tampon de
dépôt de Laemmli 3x. Chauffer 3 min à 95 °C puis centrifuger 5 min à 12 000rpm. 10 l de chaque
fraction insoluble (ici le surnageant) seront analysés par SDS PAGE.
Regrouper les deux surnageants équivalents (TAT--gal et -gal ) dans 2 nouveaux
tubes à hémolyse de 5 ml avec bouchon.
Prélever 10 l de chaque surnageant (="soluble" S) à conserver sur de la glace pour le
dosage des protéines et l'analyse par SDS-PAGE.
Ajouter par tube la moitié des billes Ni-NTA préalablement équilibrées.
Agiter pendant 1 H à 4°C.
Centrifuger 15 secondes.
Garder le surnageant (= "flow through" F) pour dosage des protéines et SDS PAGE.
Attention à ne pas entraîner de billes de NI-NTA en prélevant le surnageant.
Reprendre les culots dans 500 µl de PBS froid contenant 20 mM imidazole + PI puis
transvaser dans un tube microfuge de 1,5 ml.
Centrifuger 15 secondes 12000 rpm.
Prélever le surnageant, pour dosage et SDS PAGE (= "lavage" W20).
19
Recommencer la même opération PBS + 20 mM imidazole + PI et centrifugation.
Reprendre les culots dans 100 µl de PBS froid contenant 100 mM imidazole, + PI. Bien
remettre les billes en suspension. Incuber au moins 10 min sur la glace en agitant très fréquement.
Centrifuger 15 secondes 12000 rpm
Prélever le surnageant, pour dosage et SDS PAGE (= "Elution" E100).
Reprendre les culots dans 100 µl de PBS froid contenant 250 mM imidazole, + PI. Bien
remettre les billes en suspension. Incuber au moins 10 min sur la glace en agitant très fréquement
Centrifuger 15 secondes 12000 rpm
Prélever du surnageant, pour dosage et SDS PAGE (= "Elution" E250).
Reprendre les culots dans 100 µl de PBS froid contenant 1M imidazole, + PI. Bien
remettre les billes en suspension. Incuber au moins 10 min sur la glace en agitant très fréquement
Centrifuger 15 secondes 12000 rpm
Prélever le surnageant, pour dosage et SDS PAGE (= "élution" E1000).
2-3- Analyse par SDS PAGE de la purification.
Dosage par Bradford et préparation des échantillons pour SDS-PAGE.
Prédosage
Réaliser un prédosage de chaque fraction (S, F, W20, E100, E250, E1000) : Préparer le
premier et le dernier tube de gamme (0 et 20 µg de sérum-albumine bovine à partir d'une solution à
200 g /ml) dans un volume final de 100 l d'H2O. Pour chaque fraction à prédoser prélever 2 µl et
compléter à 100 µl avec de l’eau.
Ajouter 2 ml par cuve de réactif de Bradford (Bleu de Coomassie G-250 0,01%, Ethanol
5%, H3PO4 10 %).
Incuber environ 5 min à température ambiante. La coloration est stable pendant environ
1 heure. Puis lire l'absorbance à 595 nm.
En fonction de ces premières valeurs prévoir les volumes de prise d’essai qui seront
utilisés pour le dosage. Les échantillons qui le nécessitent, seront dilués dans l’eau.
Dosage
Préparer une série de tubes contenant des quantités croissantes (0, 4, 8, 12, 16, 20 g) de
sérum-albumine bovine (à partir d'une solution à 200 g /ml) dans un volume final de 100 l d'H2O.
Pour les échantillons le volume final est également de 100 l.
Ajouter 2 ml par cuve de réactif de Bradford (Bleu de Coomassie G-250 0,01%, Ethanol
5%, H3PO4 10 %).
Incuber environ 5 min à température ambiante. La coloration est stable pendant environ
1 heure. Puis lire l'absorbance à 595 nm.
20
Calculer la concentration protéique de chaque extrait. Cela vous permet de caculer les
volumes à prélever pour la préparartion des échantillons pour le SDS PAGE (10 µg) et pour la
transduction peptidique (40 µg pour E100, E250 et E1000).
ATTENTION : Les fractions E seront conservées à 4°C jusqu’au lendemain.
Electrophorèse des prélèvements protéiques.
Préparation des échantillons
Ajouter à un volume de chaque extrait (S, F , W20, E100, E250, E1000 pour TAT- -
gal et -gal) contenant 10 g de protéines 1/3 de volume de tampon de Laemmli 3X (55% de
glycérol, 6 % de SDS, 14 % de ß-mercaptoéthanol et 0,028 % de bleu de bromophénol dans du Tris-
HCl 0,5M pH 6,6).
Chauffer 3 min à 90°C. les échantillons sont près pour le dépôt sur gel. Les conserver à
–20 °C jusqu’au moment du dépôt.
Préparer le gel de séparation 6% polyacrylamide
Ne pas pipeter les solutions d'acrylamide à la bouche. Ne pas toucher sans gants avant qu'il ne soit
polymérisé.
Gel de séparation 6% polyacrylamide 22,5 ml (pour 2 gels)
H2O 13 ml
Acrylamide/bis 40 % 3,3 ml => 6% final
Tris-HCI 1,5 M, pH 8,8 5,7 ml
SDS à 10 % 225 µl
Persulfate d'ammonium (PSA) 10% 225 µl
TEMED 22,5 l
Mélangez doucement et déposez la solution jusqu'au niveau du repère. Recouvrir
doucement (sans perturbation) la surface de chaque gel avec de l'eau distillée et laissez polymériser.
Après polymérisation, éliminez l'eau à la surface du gel et installez un peigne de 15
puits pour chaque gel.
Gels de concentration 10,5 ml (pour 2 gels)
H2O 6,6 ml
Acrylamide/bis 40 % 1,1 ml => 4 % final
Tris-HCI 0,5 M, pH 6,8 2,6 ml
SDS à 10 % 105 µl
Bleu de bromophènol à 0,1% 7,5 µl
PSA 10% 105 µl
TEMED 10,5 µl
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Homogénéisez et déposez le mélange jusqu'au haut de chacune des plaques d'alumine.
Laissez polymériser.
Stocker à 4°C les gels montés et entourés de Selofrais si nécessaire.
MERCREDI
Démontez l'appareil ayant servi à couler les gels et récupérez un montage pour un gel.
Enlevez le peigne. Installez les gels d'acrylamide dans la cuve à électrophorèse (2 gels par cuve). Les
fixer avec les pinces et remplir la cuve de tampon de migration (= tampon Tris/Glycine) jusqu'en haut
des plaques. Les puits doivent baigner dans le tampon.
Eliminer les bulles d'air qui pourraient se trouver en bas du gel et dans les puits.
Dépôts : Déposez la totalité des 15 échantillons préparés la veille. Déposer 5 l d'un
mélange de protéines marqueurs de taille. Bien noter le plan des dépôts
Marqueurs moléculaires (Sigma markers M3788)
Myosine 205 000 Da
ß-Galactosidase E coli 116 000 Da
Phosphorylase b 97 000 Da
Fructose-6-phosphate kinase 84 000 Da
Albumine 60 000 Da
Glutamic dehydrogénase 55 000 Da
Ovalbumine 45 000 Da
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 36 000 Da
Effectuez la migration à 25mA jusqu'à ce que le colorant bleu atteigne le bas du gel.
Coloration du gel : Après migration, démoulez votre gel en faisant attention de garder
des repères pour permettre son orientation. Mettez le gel dans une cuvette et couvrez-le de solution de
coloration (= Bleu de Coomassie R250 dissout dans 40% d'éthanol et 7,5 % d'acide acétique) incuber 2
fois 1 minute au micro-onde puissance maximale.
Décoloration du gel : Récupérez la solution de coloration (réutilisable) puis rincez le gel
avec de l'eau. Ajouter la solution de décoloration (= éthanol 20 % - Acide acétique 7,5 %) puis
d’incuber 1 min au micro-onde pour accélérer le processus. Laisser à température ambiante jusqu’au
lendemain pour que la décoloration soit parfaite.
Séchage du gel : Après apparition de bandes nettes sur un fond incolore, rincez le gel à
l’eau et installer le entre deux feuilles de cellophane sans emprisonner de bulles. Fixer-le tout à l’aide
du cadre et des pinces fournis. Sécher deux heures.
22
Comparer les résultats du dosage protéique avec celui du SDS PAGE. Sélectionner les 3
meilleures solutions des protéines TAT--gal et -gal pour la transduction peptidique, les conserver à
4°C.
3-Transduction peptidique.
Objectif :
Les protéines TAT--gal et -gal précédemment purifiées vont être ajoutées à deux types
cellulaires en culture, des cellules COS-7 et des cellules CHO. L’activité -galactosidase sera ensuite
détectée in situ. Cela devrait nous permettre de conclure que l’enzyme bactérienne a pu pénétrer dans
les cellules eucaryotes en culture uniquement lorsqu’elle est en fusion avec le domaine TAT.
MARDI
3-1-Repiquage des cellules eucaryotes.
Eliminer le milieu de culture.
Rincer par 5 ml de PBS stérile équilibré à 37°C, éliminer ce PBS.
Ajouter 1 ml de Trypsine/EDTA dans du PBS.
Incuber 2 min à 37 °C. Secouer le flask, les cellules doivent se décoller.
Ajouter 9 ml de milieu de culture complet (Dulbecco Modified Eagle Medium
contenant 10% de sérum de fœtus de veau, des antibiotiques et antimycotiques).
Compter les cellules sur un aliquot en cellule de Mallassez.
Faire la dilution requise puis ensemencer les cellules COS-7 (150 000 cellules/ 2 ml) ou
CHO (100 000 cellules / 2 ml) dans des boîtes 6 puits.
Incuber à 37 °C en présence de 5 % de CO2.
Utilisation de la cellule ou lame de Malassez: fixer une lamelle par capillarité sur les deux rails
latéraux de la lame. Introduire une goutte de suspension de cellules entre lame et lamelle. Regarder au
microscope dans la zone où la lame est gravée d'un quadrillage. Sur ce quadrillage, des faisceaux de 6
lignes verticales croisent des faisceaux de 5 lignes horizontales, définissant ainsi des rectangles
constitués de 20 petits carrés. Compter les cellules présentes dans ces rectangles de 20 carrés. Si la
moyenne est n, alors la concentration cellulaire est de nx105 par ml de suspension cellulaire déposée
sur la lame.
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MERCREDI
3-2-Transduction peptidique.
Rajouter dans les puits de culture un volume des fractions E100, E250 et E 1000 contenant 40
g de TAT--gal et -gal. Chaque binôme dispose de 6 puits de culture. Pour chaque fraction il faut
déposer la solution de TAT- -gal.
Incuber 1 heure à 37°C.
3-3-Détection de l’activité -Galactosidase in situ.
Rincer les cellules incubées avec les protéines recombinantes avec 2 ml de PBS.
Fixation des cellules 5 min par 1 ml de fixateur (Glutaraldéhyde, 1%, MgCl2 1 mM dans
du PBS).
Rinçage avec 2 ml de PBS.
Recouvrir les cellules avec la solution de coloration,750 µl (X-gal 1 mg/ml, MgCl2 2
mM, ferricyanure de potassium 5 mM, ferrocyanure de potassium 5 mM dans du PBS, la solution est
conservée à 37°C pour éviter toute formation de cristaux).
Incuber à 37°C de 1 à 18 heures.
Après apparition de la coloration bleue, éliminer la solution de coloration, rincer deux
fois au PBS, puis une fois avec de l'eau.
Préserver et observer dans du glycérol 50% dans l'eau.
4- Compte rendu.
Votre compte rendu de ces trois jours de TP sera constitué d’une courte introduction et des
résultats suivants :
1. Elimination de la partie TAT du plasmide TAT--gal
Vérification de la coupure par Bam HI (photo)
Calculs des efficacités de transformation (tableau)
Criblage des colonies par PCR (photo)
Mini préparation d’ADN plasmidique (photo)
2. Purification des protéines recombinantes -gal et TAT--gal.
Dosage de Bradford des fractions S, F, W20, E100, E250, E1000 (tableau)
Analyse par SDS PAGE de la purification des protéines -gal et TAT--gal
(gels colorés au bleu de coomassie)
3. Transduction peptidique.
Evaluez l’ activité -galactosidase dans chaque puits de culture (tableau)
Répartition de l’activité -galactosidase dans la cellule (photo).
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Ces résultats devront être présentés à l’aide de figures que l’on pourrait trouver dans un article
scientifique. Ce type de figure comprend une photo, un graphique ou un tableau, au dessous
(photo, graphique) ou au-dessus (tableau) duquel doit être inscrit un titre explicite. Ce titre est
suivi d’une légende qui reprend les points essentiels du «matériels et méthodes » et définit
toutes les annotations utilisées sur la figure. Chaque résultat sera également énoncé puis
brièvement analysé. Votre rapport se terminera par une courte conclusion.
Remarque importante : Le respet scrupuleux des indications données ci-dessus sera pris en
compte dans la note attribuée à votre rapport.
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Bibliographie
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Methods Enzymol 100, 243-55.
Birnboim, H. C. and Doly, J. (1979). A rapid alkaline extraction procedure for screening
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preparation suitable for sequencing. Nucleic Acids Res 16, 9878.
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Holmes, D. S. and Quigley, M. (1981). A rapid boiling method for the preparation of
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Wadia, J. S. and Dowdy, S. F. (2002). Protein transduction technology. Curr Opin
Biotechnol 13, 52-6.
26
ANNEXE 1
Marqueurs de Taille ADN
DNA Ladder Small Fragments DNA Ladder
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