AVALIA��O DA PRESEN�A DE MELANINA EM ISOLADOS DE SPOROTHRIX

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					    AVALIAÇÃO DA MELANINA EM ISOLADOS SELVAGENS DE Sporothrix
  schenckii DURANTE INOCULAÇÃO EXPERIMENTAL EM MODELO MURINO

 MATTEI, Antonella Souza1; MADRID, Isabel Martins2; CLEFF, Marlete Brum3;
 SANTIM, Rosema4; ANTUNES, Tatiana2; MEINERZ, Ana Raquel3; MEIRELES,
            Mário Carlos Araújo4; NOBRE, Márcia de Oliveira5.

 1 – Bolsista de Iniciação Científica, CNPq - Laboratório de Doenças Infecciosas – Setor Micologia –
 Faculdade de Veterinária - Universidade Federal de Pelotas (UFPel) antonella.mattei@hotmail.com
        2 – Programa de Pós-Graduação em Veterinária – Faculdade de Veterinária – UFPel
                 3 – Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinária – UFRGS
    4 – Laboratório de Doenças Infecciosas – Setor Micologia – Faculdade de Veterinária- UFPel
                              5 – Hospital de Clínicas Veterinária, UFPel

                                         INTRODUÇÃO

       A esporotricose é uma micose subcutânea, de evolução subaguda ou crônica,
que tem como agente etiológico o fungo dimórfico Sporothrix schenckii, que acomete
o homem e uma grande variedade de animais. Na natureza o fungo é encontrado
sob a forma micelial no solo e plantas, passando a forma leveduriforme quando em
parasitismo (Findlay & Vismer, 1986; Nobre et al., 2003).
       Uma grande variedade de fungos apresenta fatores que os auxiliam na sua
sobrevivência, tanto no ambiente quanto no hospedeiro, que são os fatores de
patogenicidade. Pouco é conhecido sobre os fatores que contribuem para a
virulência do S. schenckii, no entanto, alguns são estudados por diversos
pesquisadores como a termotolerância, dimorfismo, enzimas extracelulares e a
melanina (Nobre et al., 2005).
       As melaninas são pigmentos marrons escuros ou pretos, produzidas por
microrganismos, plantas e animais, compostos de vários tipos de monômeros
fenólicos ou indólicos, geralmente combinadas com proteínas ou com carboidratos.
Estes pigmentos não são essenciais para o crescimento e desenvolvimento fúngico,
mas aumentam a chance de sobrevivência e competitividade no meio ambiente
(Jacobson, 2000; Nobre et al., 2004).
       A mais bem caracterizada melanina fúngica é a melanina DHN (1,8
dihidroxinaftaleno), também conhecida como melanina pentacetídeo, que ocorre em
muitos ascomicetos e deuteromicetos. O mecanismo pelo qual os pigmentos
aumentam a virulência nos fungos não é conhecido, mas estudos desenvolvidos,
demonstram que a melanina é um importante fator de virulência, conferindo
tolerância contra estresses ambientais como irradiação ultravioleta e dissecação, e
proteção contra a ação do sistema de defesa do hospedeiro (Doering et al., 1999;
Jacobson, 2000; Tsai et al., 1998).
      A presença dos grânulos de melanina DHN na parede dos conídios de S.
schenckii foi documentada por Romero-Martinez et al. (2000), os quais observaram
que células melanizadas foram mais resistentes a ação de fagócitos do que as
células que não apresentavam melanina. Morris-Jones et al. (2003) demonstraram,
através de microscopia eletrônica de transmissão, a presença de uma fina camada
de melanina na célula leveduriforme do S. schenckii, embora as colônias tivessem
mantido coloração creme.
       Esse trabalho tem por objetivo avaliar o comportamento da melanina em
isolados pigmentados de Sporothrix schenckii durante inoculação experimental em
modelo murino.
                             MATERIAL E MÉTODOS

       Foram utilizados 60 ratos albinos (Rattus norvergicus) de linhagem Wistar
(cepa UFPel), machos, com sete semanas de idade, divididos em dois grupos de 30
animais cada, controle (CONT) e o inoculado com S. schenckii pigmentado (MEL+).
Os animais foram acompanhados durante nove semanas, recebendo ração
comercial e água ad libitum.
       Para a preparação do inóculo utilizou-se isolado de Sporothrix schenckii,
pigmentado e termotolerante, proveniente de caso clínico de esporotricose felina. O
isolado foi cultivado em placas contendo ágar Sabouraud com cloranfenicol e
cicloheximida, incubadas à temperatura de 25ºC, por sete dias. Após, as colônias
foram removidas com auxílio de estilete, centrifugadas e lavadas duas vezes com
PBS (solução salina tamponada), homogeneizadas e padronizadas na escala de
MacFarland (tubo 4).
       A inoculação foi realizada por via subcutânea no coxim plantar esquerdo e
direito dos membros posteriores de todos animais, sendo que o grupo MEL+
recebeu 0,2 mL do inóculo contendo 2x103 células de S. schenckii/mL e o grupo
CONT 0,2 mL de PBS. Houve acompanhamento semanalmente durante nove
semanas do experimento para a confirmação da inoculação e observação do
desenvolvimento das lesões.
       Foram realizadas biopsias nas duas primeiras semanas do experimento, a
cada três dias, devido esta fase ser de transição da forma filamentosa para
leveduriforme, posteriormente, foram realizadas a cada quinze dias, totalizando oito
biópsias. Para a obtenção das amostras os animais foram anestesiados com xilazina
(0,6mg/100gr) e ketamina (4,4mg/100gr) e realizada a biópsia do tecido do coxim
plantar direito, com o auxílio de punch de 6mm de diâmetro, as quais foram enviadas
para realização de estudo micológico e ultraestrutural.
       No exame micológico, as amostras foram cultivadas em duplicata, em placas
de Petri contendo ágar Sabouraud dextrose acrescido de cloranfenicol, incubadas a
25ºC e 37ºC por até 10 dias, para o retroisolamento do agente e confirmação do
dimorfismo. O estudo ultraestrutural das células fúngicas foi realizado através da
microscopia eletrônica de transmissão (MET), as amostras foram fragmentadas,
fixadas em solução de glutaraldeído 2% em tampão cacodilato de sódio,
desidratadas em uma série de concentração crescente de etanóis e incluídas em
Epon. Posteriormente, os cortes semifinos foram corados com azul de metileno e em
áreas selecionadas dos blocos foram feitos cortes ultrafinos contrastados por
acetato de uranila e citrato de chumbo e observados em microscópio eletrônico de
transmissão.

                          RESULTADOS E DISCUSSÃO

     Os animais do grupo MEL+ desenvolveram lesões inicialmente nodulares nos
locais de inoculação que na terceira semana evoluíram para úlceras em 63,3% dos
animais, passando a crostas. A partir da sétima semana observou-se em 10% dos
animais, processo de cicatrização do ponto de inoculação. Também foram
observadas lesões em outras regiões corpóreas a partir da 3ª semana e recidiva das
lesões nas semanas oito e nove. No grupo CONT verificou-se, na primeira semana,
edema do local de inoculação, o qual desapareceu nas semanas seguintes do
experimento. Isto é explicado, pois a melanina DHN dos conídios é considerada um
fator de patogenicidade, protegendo-o contra a ação de fagócitos dificultando a
resposta imunológica, determinando assim a gravidade das lesões (Romero-
Martinez et al., 2000). A melanina foi importante na patogenicidade de isolados de
S. schenckii, demonstrado por estudo iniciado em 2001, utilizando dois isolados de
S. schenckii pigmentado (MEL+ A e MEL+ B) e albino (MEL- A e MEL- B), sendo
observado que o inóculo contendo conídios pigmentados desenvolveu esporotricose
de maior gravidade em modelo experimental quando comparada à induzida por
conídio mutante albino (Nobre et al., 2005).
      O retroisolamento do agente foi obtido em todas as amostras do grupo MEL + e
em nenhuma do grupo CONT, sendo o dimorfismo confirmado pelo crescimento do
fungo a 25º e 37ºC. O exame macromorfológico da fase filamentosa demonstrou
colônias de coloração marrom a marrom escura que microscopicamente eram
caracterizadas por hifas finas, hialinas, septadas e ramificadas com conídios ao
longo das hifas ou no ápice do conidióforo, semelhante a uma margarida. Nas
culturas incubadas a 37ºC, observaram-se colônias cremosas de coloração creme
que na microscopia eram caracterizadas por pequenas células esféricas, ovais ou
alongadas, que se assemelhavam a “charutos”.
      Nas amostras dos dias três e sete após a inoculação, o estudo ultraestrutural
demonstrou a presença de células em fase de transição, com a camada de melanina
desprendendo-se da parede da célula fúngica, inexistindo na amostra do dia dez. A
partir da terceira até a nona semana observou-se a presença de grânulos de
melanina ao redor da célula leveduriforme, os quais variaram de intensidade. Estes
resultados demonstram a presença de melanina na fase leveduriforme,
comprovando assim, que o agente possui capacidade de sintetizar melanina durante
a fase parasitária. Outros estudos comprovaram a presença de melanina na forma
micelial in vitro (Nobre et al., 2003; Morris-Jones et al., 2003), enquanto que na
forma leveduriforme in vivo, detectaram componentes que poderiam ser melanina
através de anticorpos monoclonais, em tecidos de animais experimentais inoculados
com S. schenckii (Morris-Jones et al., 2003).

                                  CONCLUSÃO

     O trabalho demonstrou que o S. schenckii possui a capacidade de sintetizar
melanina tanto na forma micelial como na leveduriforme.


                       REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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