Unidade: Pesquisa de Salmonella spp em alimentos
Objetivos de ensino:
1. Conhecimentos
Metodologia para o isolamento e identificação de Salmonella spp em alimentos.
2. Habilidades
Utilizar caldos de enriquecimento seletivo
Identificar e isolar colônias suspeitas de Salmonella spp em alimentos
Utilizar o kit API 20 para a identificação bioquímica de bactérias
Realizar e interpretar reações sorológicas de aglutinação
3. Atitudes
Rigor científico
Segurança Operacional
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Folha para apontamentos de aula.
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Pesquisa de Salmonella spp em alimentos
1. INTRODUÇÃO
1.1. Características do microrganismo
A Salmonella pertence à família Enterobacteriaceae; é Gram-negativa; produz gás e
ácido a partir da dextrose e normalmente não fermenta a lactose.
Existem mais de 2000 tipos sorológicos classificados de acordo com os seus
antígenos, que possuem vários graus de virulência nos animais de sangue quente.
1.2. Habitat natural
A Salmonella está muito disseminada na natureza, ocorrendo freqüentemente no
trato intestinal e nas fezes de seres humanos e de animais. Estas bactérias também
podem ser encontradas em empresas que processam ou manipulam gêneros
alimentícios; nas carnes cruas, como a carne de gado porco e aves; nos ovos e
seus produtos derivados. Outras origens são animais domésticos, roedores (ratos e
camundongos) e insetos.
1.3. Características da doença
A salmonelose é um termo usado para descrever a doença que resulta da ingestão
da bactéria Salmonella e a infecção resultante. Para que uma pessoa seja infectada
é necessário que consuma alimentos que estejam contaminados com Salmonella.
Este microrganismo entra no trato digestivo, multiplica-se no intestino delgado e
grosso causando uma inflamação que resulta em gastroenterite.
Com respeito aos sintomas clínicos, modo de difusão e patogenia, as salmoneloses
podem ser convenientemente divididas em dois grupos principais:
a) as febres tifóides e paratifóide, produzidas pelas S. typhi e S. paratyphi A, B e C;
b) as infecções entéricas produzidas pelas outras salmonelas. Esta divisão é
utilizada pela Organização Mundial de Saúde em seus sistemas de estatística
sanitária.
A febre tifóide é a mais grave delas, caracterizada por septicemia, febre alta
contínua, cefaléia e diarréia. O período de incubação varia de 7 a 28 dias, com uma
média de 14 dias. A recuperação do indivíduo infectado é lenta, variando de uma a
oito semanas.
A febre paratifóide é caracterizada por infecção da corrente sangüínea, dores de
cabeça, febre contínua, náuseas, vômitos, dores abdominais e diarréia. É menos
grave que a febre tifóide, apresentando um período de duração de 1 a 3 semanas.
As salmoneloses causadas por Salmonella spp., desenvolvem um quadro de
infecção gastrointestinal, tendo como sintomas mais comuns dores abdominais,
diarréias, náuseas, vômitos, calafrios e febre, podendo também ocorrer,
ocasionalmente desidratação, dor de cabeça e fadiga. O período de incubação é 5 a
72 horas, normalmente de 12 a 36 horas após a ingestão do alimento e a duração
da doença é de 2 a 6 dias.
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A gravidade e a permanência dos sintomas depende do tipo de Salmonella, da
quantidade de alimento ingerido e da susceptibilidade da pessoa envolvida. Casos
de morte são raros, a não ser em pessoas com o sistema imunológico enfraquecido
como recém-nascidos, crianças pequenas, pessoas idosas, pacientes de risco
(câncer, AIDS, queimados) e pessoas debilitadas por doenças. As infecções
causadas por alimentos apresentam um crescimento mundial, sendo a Salmonella a
causa mais freqüente de intoxicações alimentares, representando então um papel
importante no diagnóstico microbiológico.
1.4. Alimentos envolvidos
Carnes, aves, ovos e seus derivados. Outros alimentos que já foram incriminados
são: coco, fermento, proteínas derivadas de caroço de algodão, peixe defumado,
leite em pó, chocolate.
1.5. Medidas de controle
Resfriar rapidamente alimentos em volumes reduzidos, cozimento intenso, uso de
ovos e leite pasteurizado, evitar contaminação cruzada de áreas limpas e sujas ou
de alimentos crus e cozidos, lavar e higienizar as mãos e sanear equipamentos.
Manter boas práticas de saneamento rural, higiene pessoal e manipulação. Proteger
alimentos de excretas animais, humanos, de pássaros, insetos e de roedores.
2. MATERIAL
Banho-maria a 43 0,5 °C;
Pipetas bacteriológicas de 1,0 mL com graduação decimal;
Pipetas bacteriológicas de 10,0 mL
Estufa bacteriológica a 36 1 °C e a 43 0,5 °C;
Alça de platina ou níquel-cromo nº 25, montada em cabo de Kolle;
Anti-soros polivalentes “O” e “H” para Salmonelas;
Solução salina a 0,85% estéril;
Lâmina de microscópio.
3.MEIOS DE CULTURA
3.1. Meio de Pré-enriquecimento
Caldo lactosado
Composição (g/L)
peptona 5,0
extrato de carne 3,0
lactose 5,0
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3.2. Meio de Enriquecimento
3.2.1. Caldo selenito-cistina
Composição (g/L)
triptona 5,0
cistina 0,01
lactose 4,0
monofosfato de sódio 10,0
selenito de sódio 4,0
Modo de ação
O selenito inibe o crescimento de coliformes e enterococos nas primeiras 6 a 12
horas de incubação. Entretanto bactérias dos gêneros, Proteus, Pseudomonas e
Salmonella são pouco inibidas.
3.2.2. Caldo tetrationato
Composição (g/L)
triptona 2,5
peptona de carne 2,5
sais biliares 1,0
carbonato de cálcio 10,0
tiossulfato de sódio 19,0
Para cada 100 mL de meio adicionar 2,0 mL da solução de iodo
Iodo 6,0 g
Iodeto de potássio 5,0 g
Água destilada 20 mL
Modo de ação:
Este meio é altamente seletivo. O tetrationato e tiossulfato eliminam o crescimento
de coliformes e outros microrganismos normalmente presentes. As bactérias que
apresentam a capacidade de reduzir o tetrationato, tais como, Salmonella e
Proteus, crescem relativamente bem neste meio. Os produtos ácidos formados pela
decomposição do tetrationato são neutralizados pelo carbonato de cálcio presente
no meio.
Os sais biliares inibem os microrganismos que não estão acostumados ao ambiente
intestinal.
3.2.3. Caldo de enriquecimento RAPPAPORT
Composição (g/L)
triptona 5,0
cloreto de sódio 8,0
fosfato de potássio dibásico 0,8
cloreto de magnésio hexahidratado 40,0
verde de malaquita 0,12
pH final: 6,0 0,1
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Modo de ação:
Microrganismos normalmente encontrados no intestino são inibidos pelo verde
malaquita e pelo cloreto de magnésio. Entretanto a maioria das espécies de
Salmonella não são afetadas.
3.3. ÁGAR Seletivo
3.3.1. Ágar Seletivo Rambach
Composição (g/L)
peptona 8,0
propileno glicol 10,5
desoxicolato de sódio 1,0
cloreto de sódio 5,0
mistura cromogênica 1,5
ágar 15,0
pH final 7,3 0,2
Característica do crescimento:
As colônias de Salmonella spp., crescem vermelhas, enquanto que S. typhi e
S. paratyphi, Proteus spp. e Shigella spp., apresentam-se incolores. Os coliformes
desenvolvem colônias azul-esverdeadas (E. coli, Citrobacter) ou violeta azuladas
(Klebsiella).
Modo de ação:
Os substratos nutritivos contidos no Ágar Rambach possibilitam a rápida
multiplicação de enterobactérias. O desoxicolato de sódio inibe a microbiota
Gram-positiva acompanhante. O Ágar Rambach possibilita a diferenciação segura
de espécies de Salmonella por meio de um processo inovador, que se baseia na
adição de propileno glicol ao meio de cultura. A Salmonella forma ácido a partir do
propileno glicol, que em combinação com um indicador de pH, resulta em uma
coloração vermelha característica de suas colônias. Para diferenciar os coliformes
da Salmonella, o meio contém um composto cromógeno que indica a presença de
fragmentos de -galactosidase, que é característica dos coliformes. Estes
microrganismos desenvolvem-se como colônias azul-esverdeadas ou violeta-
azuladas. Outras enterobactérias ou bactérias Gram-negativas como, por exemplo,
Proteus, Pseudomonas, Shigella, S, typhi e S. paratyphi A se desenvolvem como
colônias incolores.
Microrganismos Coloração colônias Propileno-glicol -Galactosidase
Salmonella spp vermelha + -
Salmonella typhi incolor - -
Salmonella paratyphi A incolor - -
E. coli azul-esverdeada - +
Klebsiella spp violeta azulada - +
Citrobacter spp azul-esverdeada - +
Proteus spp incolor - -
Shigella spp incolor - -
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3.3.2. Ágar Seletivo Bismuto Sulfito
Composição (g/L)
extrato de carne 5,0
peptona 10,0
glicose 5,0
fosfato de sódio dibásico 4,0
sulfato de ferro II 0,3
verde brilhante 0,025
indicador bismuto sulfito 8,0
ágar 15,0
pH final: 7,6 0,2
Característica do crescimento:
As colônias de Salmonella, com exceção de S. paratyphi A e S. pullorum,
apresentam-se neste meio com o centro negro, bordas claras, rodeadas por um
precipitado preto com brilho metálico.
Bactérias do grupo coliformes, Serratia, Proteus e outros, apresentam-se em menor
tamanho, com coloração variando do verde ao marrom, e algumas vezes com
aspecto mucóide.
Modo de ação:
O verde brilhante e o bismuto inibem fortemente a microbiota acompanhante.
Colônias de Salmonella produtoras de H2S apresentam-se negras devido a
formação de sulfeto de ferro. A redução de íons bismuto a bismuto metálico produz
um brilho metálico ao redor das colônias.
4. METODOLOGIA
4.1. Pré-enriquecimento
Pesar assepticamente 25 g de amostra;
Transferir assepticamente para um Erlenmeyer contendo 225 mL de caldo
lactosado;
Incubar 361 °C por 18 a 24 horas.
4.2. Enriquecimento Seletivo
Transferir assepticamente alíquotas de 1,0 mL, provenientes do caldo de
pré-enriquecimento, para tubos contendo 10 mL de caldo tetrationato (ao qual se
adicionou 0,1 mL da solução de ver brilhante e 0,2 mL da solução de lugol) e em
outro contendo 10 mL de caldo Selenito;
Incubar os tubos de caldo Selenito em estufa a 36 1 °C e os de tetrationato em a
43 0,5 °C por 24 horas.
4.3. Plaqueamento Seletivo
A partir do enriquecimento seletivo, semear através de estrias os meios sólidos
seletivos: ágar Rambach e Bismuto Sulfito;
Incubar as placas a 36 1 °C por 24 horas;
Examinar as placas e verificar o desenvolvimento de colônias típicas.
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4.4. Identificação Bioquímica
Será feita a identificação bioquímica com auxílio do Kit API 20.
4.5. Teste Sorológico
A partir dos tubos de identificação presuntiva, que apresentarem respostas típicas
para Salmonelas, proceder aos testes sorológicos de aglutinação em lâmina,
usando os anti-soros “O” e “H” polivalentes;
Demarcar 2 quadrados em uma lâmina com o auxílio de um lápis dermográfico e
transferir para os mesmos 2 gotas de solução salina 0,85%. A seguir emulsionar
em ambas, o crescimento removido dos tubos de ágar Citrato de Simmons ou EPM;
Adicionar 1 gota do anti-soro polivalente a um dos quadrados; agitar suavemente
por 1 minuto e observar a existência de aglutinação;
O resultado será considerado positivo quando houver aglutinação na presença do
anti-soro e não houver aglutinação na emulsão com salina.
5. EXPRESSÃO DO RESULTADO
Salmonella spp em 25 g.................presença (ou ausência)
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