ANTIBODI MONOKLONAL
DAN ANTIBODI POLIKLONAL
MATERI YANG DIBAHAS :
1) Antibodi Poliklonal
2) Cara Pembuatan Antibodi Poliklonal
3) Antibodi Monoklonal
4) Maksud / Tujuan Antibodi Monoklonal
5) Cara Pembuatan Antibodi Monoklonal
6) Aplikasi Terapi dengan Antibodi
Monoklonal
I. ANTIBODI POLIKLONAL
Yaitu di dalam suatu populasi
antibodi terdapat lebih dari 1
macam antibodi, atau terdapat
campuran antibodi yang dapat
mengenal epitop yang berbeda
pada antigen yang sama.
II. CARA PEMBUATAN ANTIBODI
POLIKLONAL
Cara memproduksi antibodi polyklonal /
Proses terjadinya antibodi poliklonal :
1) Antibodi ini diproduksi dengan cara
memberikan imunisasi pada hewan dengan
antigen yang tepat (antigen yang tidak
patogenik).
2) Imunisasi atau vaksinasi adalah :
suatu prosedur untuk meningkatkan
derajat imunitas seseorang terhadap
patogen tertentu atau toksin.
Syarat Imunisasi yang IDEAL adalah :
harus dapat mengaktifkan sistem
pengenalan imun dan sistem efektor
yang diperlukan, yaitu dengan cara
pemberian antigen yang tidak patogenik
3) Serum dari hewan terimunisasi dikumpulkan
4) Kemudian antibodi dalam serum dapat
dimurnikan lebih lanjut.
5) Karena satu antigen dapat menginduksi
produksi banyak antibodi maka hasilnya
berupa campuran antibodi, sehingga antibodi
yang terbentuk disebut ‘ANTIBODI
POLYCLONAL’.
III. ANTIBODI MONOKLONAL
Definisi Antibodi monoklonal (Mab) :
Antibodi monoklonal berasal dari 2 kata :
1) Mono: Satu
2) Klone: strain sel yang diturunkan dari 1 sel.
Antibodi monospesifik yang dapat mengikat
satu epitop saja.
Antibodi homogen yang dengan spesifitas
yang sama diproduksi dari klon tunggal dari
sel yang menghasilkan antibodi.
KLON adalah segolongan sel yang berasal
dari satu sel karena secara genetiknya
identik.
Antibodi monoklonal ini dapat dihasilkan
dengan teknik hibridoma, sehingga dapat
disebutkan bahwa antibodi monoklonal
berasal dari SEL HIBRIDOMA
Sel hibridoma merupakan fusi sel dan sel
IV. MAKSUD / TUJUAN ANTIBODI
MONOKLONAL
Antibodi monoklonal dapat
digunakan untuk tujuan berikut :
1) Pemurnian reagen untuk tes atau penelitian
2) Sebagai penanda pada deteksi Antibodi
assays
3) Untuk eksperimental terapi
V. CARA PEMBUATAN ANTIBODI
MONOKLONAL
PEMBUATAN ANTIBODI MONOKLONAL,
dapat dilakukan dengan cara :
a) In Vitro : antibodi monoklonal diproduksi
dengan cara hibridisasi sel myeloma dan sel
limfa kemudian dibiakkan pada mikroplate
96 well dan diinkubasikan pada inkubator
37⁰C yang mengandung CO2 5%.
b) In Vivo : setelah sel dihibridisasi
diinokulasikan pada ruang peritoneal pada
mencit, kemudian cairan acites diisolasi dan
Agar memproduksi antibodi monoklonal bebas
dari kontaminasi dan terhindar dari hal-hal
yang tidak diinginkan maka diperlukan
prosedur tahapan yang komperhensif.
Pembuatan sel hibridoma (hibridisasi)
terdiri dari beberapa tahap utama yaitu :
1) Thawing sel
2) Pembekuan sel
3) Kloning
4) Imunisasi
5) Fusi
Imunisasi dapat dilakukan dengan imunisasi
konvensional, imunisasi sekali suntik secara
intralimpa, maupun imunisasi in vitro.
Fusi sel ini menghasilkan sel hibrid yang
mampu menghasilkan antibodi seperti pada
sel LIMPA dan dapat terus menerus dibiakan
seperti sel myeloma.
Frekuensi terjadinya fusi sel ini relatif
rendah sehingga sel induk yang tidak
mengalami fusi dihilangkan agar sel hasil fusi
dapat tumbuh.
Pada tahap Fusi penambahan medium / media
HAT (Hypoxanthin Aminopterin Thymidin)
ditujukan untuk :
1) Agar sel yang fusi dapat memproduksi banyak
imunoglobulin
2) Sel yang hidup tidak ada bahan toksik,
3) Seleksi sel yang berfusi akan hidup terus
menjadi sel hibridoma yang akan membentuk
ANTIBODI MONOKLONAL
Untuk sel yang hidup dilakukan uji imunologi
untuk menskrining sel hibrid yang dapat
menghasilkan imunoglobulin dilakukan klon dan
dipindahkan ke tempat lain untuk dikultur pada
MEDIA pertumbuhan.
Kemudian dilakukan uji imunologi lagi ; jika sel
hibrid tidak dapat memproduksi imunoglobulin
(hasil negatif) maka sel hibrid dibuang,
sedangkan yang hasilnya positif dikulturkan
kembali.
Serum untuk bahan penumbuh / yang
dapat membrikan makan pada sel
hibrid :
a) 55% charge foetal calf serum
b) 59% charge newborn calf serum
c) 73% charge bovine serum
MAKROFAG (MACROFAG FEEDER CELLS)
MAKROFAG DIPERLUKAN UNTUK :
memfagosit sel mati pada saat fusi sel lymfosit
dan sel myeloma.
Sel Makrofag ini dikultur pada mikroplate 96
lubang (well) atau mikroplate 24 lubang
yang ditumbuhkan 4 minggu sebelum
dicampur dengan sel hasil fusi, sehingga siap
untuk memfagosit sel-sel mati yang tidak fusi.
Mencit yang digunakan untuk
mengkoleksi makrofag sebagai feeder
cells adalah strain Balb/c atau NMRI.
MAKROFAG yang cocok untuk
Macrofag Feeder Cells adalah :
makrofag hasil kultur monosit berasal dari
darah perifer manusia yang distimulasi
dengan Antibodi serum.
Frekuensi fusi sel agar dapat diperbanyak
dengan menggunakan :
1) POLIETILEN GLIKOL (PEG)
2) DMSO
3) Medan listrik.
PEG berfungsi : untuk membuka
membran sel sehingga mempermudah
proses fusi.
Syarat PEG :
a) Berat molekul 1000-6000
b) Penyimpanan tidak boleh lebih 2 bulan.
Media HAT (Hypoxanthin Aminopterin
Thymidin) untuk seleksi sel hibridoma
bersifat :
a) Sangat sensitif terhadap sinar
b) Kurang stabil pada suhu -20⁰C
c) Penyimpanan tidak boleh lebih dari 6 bulan
d) Media HAT untuk seleksi melalui HAZ
(Hypoxanthin-Azasern-Selektion)
Sel hibrid hasil fusi setelah dikultur, diukur
titer antibodinya dengan cara ELIZA.
Sel myeloma dan sel linie tumor sebagai
bahan dasar dalam pembuatan antibodi
monoklonal ada 4 persyaratan yang harus
dipenuhi :
1) Sel tidak dapat mensintesa sendiri antibodi
komplet / imunoglobulin rantai L-chain dan
H-chain.
2) Sel tidak boleh mempunyai enzim defek
3) Sel harus mempunyai sifat fusi yang baik
4) Sel harus membawa sifat molekul dalam
hibridoma untuk menginduksi sintesis
antibodi monoklonal yang tinggi.
Sel myeloma dan sel linie tumor bersifat
tidak bisa mensintesa/memproduksi sendiri
antibodi secara utuh rantainya, tetapi
setelah hibridisasi dapat memproduksi
antibodi monoklonal yang intak dengan
kromosom sel B.
Sel myeloma ada yang mengalami mutant
(misal : P3x63Ag8,653, SP2/O-Ag14 dan
P3-NS1/1-Ag4-1) dan yang bebas rantai
kappa secara intraseluler(misal : P3-
NS1/1-Ag4-1) sering tidak dapat berfusi
dengan baik.
DEFEK ENZIM UNTUK SELEKSI
Agar sel myeloma yang berfusi membentuk sel
hibridoma cepat mati dan tereliminer, sehingga
sel hibridoma tetap hidup, maka ditambahkan
medium THYMIDIN KINASE (TK) atau
Hypoxanthine Guanidin Phosphorybosyl
Transferase (HGPRT) yang berfungsi sebagai
DEFEK ENZIM.
Sifat fusi yang baik adalah :
a) menghasilkan sel hibridoma yang banyak
jumlahnya
b) menghasilkan sel hibridoma yang berkualitas
baik(mempunyai daya sintesa / memproduksi
antibodi monoklonal yang tinggi)
b) Tidak ditemukan sel hibridoma yang mutant /
mutagenesis pada subklone-nya.
Teknik TEKNOLOGI GEN yang
memproduksi ANTIBODI MONOKLONAL
Prinsip seleksi sangat diperlukan untuk
membuat sel terhindar dari defek mutasi / tidak
bermutasi, terutama dengan cara
metabolisme pada inti sel.
Metabolisme sintesis asam inti ini melalui 2
jalan :
1) Jalan utama
2) Jalan cadangan
disebut : SOLVAGE PATHWAYS
Metabolisme sintesis asam inti melalui
Jalan utama : yaitu dengan cara melakukan
a) Seleksi untuk membunuh sel-sel yang lain
melalui Purin dan Pyrimidin dengan
menambahkan Aminopterin.
b) Seleksi untuk menumbuhkan sel hibridoma
melalui media HAT.
Jika sel mengalami defek mutant dan sel hibrid
banyak yang mati pada metabolisme sintesis
meski ada penambahan HAT, ini terjadi karena
ada pengeblokan ke2 jalan metabolisme tsb.
Ada 2 jalan metabolisme cadangan
yang digunakan sebagai dasar prinsip
seleksi dan bahan kimia yaitu :
1) Hypoxanthin atau Guanine dibantu enzym
Hypoxanthine-Guanin-Phosphorybosyl-
Transferase (HGPRT)
2) Thymidin dibantu enzym Thymidin Kinase
(TK)
Adanya gen defek mutasi yang terjadi
secara sporadis dapat dicari dengan cara :
1)penambahan 6-thioguanin(TG) atau
2)penambahan 8-azaguanin melalui HGPRT
3)penambahan Brom desuxyuridin (BrdU)
melalui Thyamin kinase
ditambahkan ke dalam sel
sel keracunan sel mati
Prinsip seleksi pada HGPRT-defek yang
analog dengan Defek mutasi di dalam gen
APRT (Adenin Phosporibosyl Transferase)
QUABAIN (STROPHANTIN) digunakan
sebagai maker seleksi dalam heterofusi sel
manusia dan sel mamalia, sehingga setelah fusi
sel manusia akan mati sendiri.
Pada sel myeloma manusia untuk heterofusi,
dan hibridoma sering menggunakan bantuan
transformasi EBV (Epstainbare Virus).
Untuk mendapatkan hasil hibridoma yang baik
dalam seleksi sel myeloma dapat
menggunakan penambahan media HA
(HYPOXANTINE AZASARIN)
ANTIBODI BISPESIFIK & CHIMAER
ANTIBODI BISPESIFIK :
Antibodi yang dikonstruksi secara buatan dari 2
antigen berbeda yang dikaitkan.
ANTIBODI CHIMAER :
Antibodi yang dikonstruksi dari rantai atau
domain yang berasal dari spesies yang berbeda
dilakukan kombinasi.
Hal ini merupakan suatu modifikasi dan
pengembangan metode bioteknologi hibridoma
melalui biokimiawi dari semua rantai antibodi
PRODUKSI ANTIBODI MONOKLONAL
PADA MENCIT
Dikembangkan th 1962 oleh Potter dan Boyce :
imunoglobulin diproduksi berupa cairan ascites
dalam perut mencit, yang dikoleksikan dengan
cara melakukan punksi.
Kandungan antibodi rata-rata 1-20mg/ml atau
sekitar 100-1000 kali antibodi monoklonal yang
diproduksi dari kultur sel.
Beberapa kerugian yang mungkin terjadi
dalam memproduksi antibodi dari hewan
mencit :
1) Ascites kebanyakan bisa didapatkan
setelah hewan mati
2) Antibodi monoklonal yang diproduksi
sekitar 5-20 % mengandung antibodi
3) Pada saat menginjeksikan sel hibridoma
ke dalam rongga peritoneum dapat
terkontaminasi agen infeksius.
Beberapa kerugian dalam memproduksi
human-antibodi monoklonal :
1) Berlangsung lama dan harus aktif untuk
adaptasikan sel dalam perut mencit dan
selanjutnya dilakukan kokultivasi secara in vitro
selama 3 bulan
2) Sulit mendapat hewan SPF dan harga mahal
3) Alat untuk penyinaran sulit didapatkan
4) Pembentukan tumor 4-5 buah tiap hewan coba
5) Hasil antibodi 2-5 ml / mencit dengan
konsentrasi maksimal mg IgG/ml
Beberapa Tahapan kerja dalam
memproduksi antibodi monoclonal :
1) Produksi dan seleksi hibridoma yang
diharapkan
2) Amplifikasi MAb dari sel hibridoma terpilih
a) Produksi ascites
b) Fermentasi melalui kultur sel
3) Purifikasi MAbs
a) Filtrasi
b) Ultra sentrifugasi
c) Kromatografi afinitas
4) Proses penambahan: disebut konjugasi
5) Formulasi dan sterilisasi
TEKNIK PELABELAN ANTIBODI
VI. APLIKASI TERAPI DARI
ANTIBODI MONOKLONAL
1) Induksi imunisasi pasif
2) Diagnostik imaging
3) Diagnostik molekular
4) Monitoring terapi obat (untuk live-saving
drug)
5) Sistem penghantaran obat (DDS)
6) Isolasi dan atau purifikasi obat baru
7) Terapi kanker
Antibodi monoklonal untuk tujuan terapetik:
a) Murine antibodi monoklonal pertama
dikembangkan sebagai alat diagnostic di tahun
1970an (Milstein van Brown).
b)Efikasi terapetik yang terbatas untuk
pengembangan HAMA (Human Anti-Mouse
Antibodies) ~ 14 hari, 50-80 % pasien
c) Chimeric dan humanised antibodi monoklonal
mencegah perkembangan HAMA.
Jenis Toksin yang biasa dikonjugasikan
dengan antibodi monoklonal persiapan
untuk penggunaan klinik sebagai agen
antikanker :
1) Picin
2) Pokeweed
3) Gelonin
4) Pseudomonas endotoksin
5) Diptheria toksin
6) Abrin
7) Protein antiviral