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2 - Cultivo de tejidos vegetales

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2 - Cultivo de tejidos vegetales Powered By Docstoc
					                        Agrobiotecnología. Curso 2011
                            Cultivo de tejidos vegetales


Técnicas del cultivo de células y tejidos vegetales

Transparencias 5-7

La teoría de la totipotencialidad celular constituye el principio rector de las técnicas de
cultivo de tejidos vegetales. Enuncia la posibilidad de obtener una planta entera a
partir de cualquier célula viva, bajo condiciones controladas de cultivo. Resulta
requisito lograr la desdiferenciación previa de la célula inicial, induciendo la pérdida de
las características de especialización de dicha célula hasta un estadio de
desdiferenciación meristemática. Posteriormente se buscará la re-diferenciación de
esta célula de partida, de manera de lograr variadas respuestas morfogenéticas tales
como la obtención de callo, la regeneración de brotes o primordios de raíz, etc. Para
promover estas posibles respuestas es necesario adicionar a los medios sintéticos de
cultivo reguladores del crecimiento, fundamentalmente auxinas y citoquininas.

El fisiólogo austriaco Haberlandt (1902) fue el primer investigador en intentar cultivar in
vitro células vegetales en un medio sintético de cultivo. Utilizó un medio que contenía
macro y micronutrientes, asparagina, peptona y sacarosa. A pesar de que las células
sobrevivieron durante varios meses, estas no proliferaron. La falla de su protocolo se
debió probablemente a la pobre composición del medio de cultivo y al empleo de
células muy diferenciadas como material vegetal de partida. Fue Robbins (1922) quien
inició el cultivo aislado de meristemas. Desarrolló la técnica de cultivo de ápices de
raíz. White (1934) logró el cultivo indefinido de raíces in vitro. Con el descubrimiento
de las primeras hormonas vegetales resultó posible promover las desdiferenciación de
tejidos vegetales y obtener variadas respuestas morfogenéticas (Went, 1937).

El cultivo in vitro de células y tejidos vegetales implica el mantenimiento de partes
aisladas del cuerpo de una planta bajo condiciones controladas de asepsia, nutrientes,
luz y temperatura. El cultivo de tejidos es frecuentemente utilizado como sistema
modelo en el estudio de problemas fisiológicos, bioquímicos, genéticos y estructurales
relativos a las plantas. El uso comercial de estas técnicas, la micropropagación
vegetal, posibilita la propagación vegetativa a gran escala de especies de importancia
económica. Existen además muy variadas aplicaciones del cultivo de tejidos vegetales
que utilizan diferente material vegetal de partida y condiciones particulares de cultivo.


Micropropagación vegetal

Transparencias 9-10

La micropropagación consiste en la propagación de plantas en un ambiente artificial
controlado, empleando un medio de cultivo adecuado. El cultivo es así una
herramienta muy útil en los programas de mejoramiento, ya que tiene el potencial de
producir plantas de calidad uniforme a escala comercial, a partir de un genotipo
selecto y con una tasa de multiplicación ilimitada.

En las fotos puede observarse material vegetal de diferentes especies propagado in
vitro: en los frascos se observan plántulas y microtubérculos de papa; en la placa de
Petri crecen plántulas de violeta africana (Sainpaulia sp) mientras que en el tubo de
cultivo se enraíza un vástago de clavel (Dianthus sp).



Consideraciones técnicas de la propagación clonal masiva de plantas

Transparencias 11-23

El cultivo de tejidos vegetales no requiere de equipamiento complejo ni de gran
infraestructura. Las necesidades dependen de la escala de producción pretendida o de
la naturaleza del proyecto de investigación en curso. Se detalla en la transparencia 12
a 19 la organización básica de un laboratorio de micropropagación vegetal, así como
la composición general de los medios de cultivo más utilizados.

Para la propagación clonal masiva de plantas resulta de fundamental importancia la
preparación y presaneamiento de las plantas madres a partir de las cuales se tomarán
los explantos. La disección de los explantos y los subcultivos sucesivos se realizan
bajo condiciones de esterilidad en un gabinete de flujo laminar. Las plantas son
crecidas en una cámara de cultivo a aprox. 24 grados centígrados de temperatura y un
fotoperíodo de 16 horas luz/ 8 horas oscuridad. Los medios sintéticos y los recipientes
de cultivo (de vidrio resistente a altas temperaturas) son esterilizados por autoclave.
Las plantitas clonales crecen en recipientes estériles, sellados con un film de
polietileno transparente que permite el intercambio gaseoso.

Un medio nutritivo consiste básicamente en sales inorgánicas, una fuente de carbono,
algunas vitaminas, reguladores del crecimiento y suplementos orgánicos. De todas las
sustancias vitamínicas que comúnmente se incorporan a los medios, pareciera que la
tiamina es la única realmente imprescindible para el buen crecimiento de los cultivos.
De acuerdo con el nivel de organización y tamaño del material vegetal en cultivo la
composición del medio será más o menos compleja. En el caso del cultivo de
protoplastos o células aisladas se requerirá mayor cantidad de compuestos orgánicos.
Los hidratos de carbono constituyen una fuente de energía y las vitaminas actúan
como catalizadores de reacciones enzimáticas.

La consistencia de los medios de cultivo in vitro puede ser líquida o semisólida. En el
último de los casos se adiciona a la formulación salina y compuestos orgánicos un
agente gelificante inerte. El más usado es el agar-agar. Este es soluble en agua a
90ºC, permanece fundido hasta los 40ºC, temperatura por debajo de la cual solidifica
en la forma de un gel transparente, más o menos sólido dependiendo de la
concentración.

Los medios de cultivo semisólidos son envasados en recipientes de vidrio resistente al
calor y esterilizados por autoclave. Los medios líquidos se alicuotan en recipientes
graduados (Erlen meyers). Los cultivos de esta modalidad se mantienen en agitación
constante en un agitador con control de temperatura para asegurar la adecuada
inmersión de los explantos (suspensiones de protoplastos o células vegetales).

El film de polietileno ampliamente utilizado para el cierre de los recipientes de cultivo
posibilita el intercambio gaseoso y resulta relativamente impermeable para el vapor de
agua previniendo, de esta forma, la desecación de cultivos a largo plazo. La
transparencia de este film resulta una ventaja extra en le caso de cultivos que
requieran luz.
El pH de los medios de cultivo determina la disponibilidad de los compuestos
osmóticos y regula un amplio rango de reacciones bioquímicas que tienen lugar en las
células vegetales en cultivo. Siempre debe tenerse en cuenta la posible modificación
del valor de pH luego de la esterilización por autoclave de los medios, debida a las
elevadas temperaturas. Otras causas de modificación del valor de pH son el tipo de
hidrato de carbono adicionado, el agente gelificante (marca o stock) y el uso de carbón
activado. En la actualidad resulta posible conseguir en el mercado formulaciones de
medios de cultivo con una mayor capacidad buffer de manera de prevenir estas
variaciones indeseadas del pH.

Existe en la literatura una gran variedad de formulaciones de medios de cultivo. La
elección de una u otra formulación dependerá del objetivo y la aplicación particular de
alguna de las técnicas del cultivo de tejidos y de la especie o tipo de planta. Los
requerimientos nutricionales básicos del material vegetal cultivado son similares a los
de una planta a campo. Las formulaciones detalladas en las tablas de las
transparencias 17 y 18 son las más difundidas y usadas. Los medios de Schenk y
Hiledebrandt (SH), el de Gamborg (B5) y el de Murashige and Skoog (MS) presentan
una alta concentración de macronutrientes mientras que los restantes contienen
considerablemente menos compuestos inorgánicos.

El termino hormona se reserva para los compuestos naturales que actúan como
reguladores del crecimiento vegetal, se trata en general de metabolitos secundarios
específicos de cada especie involucrados en diversos procesos de desarrollo. Por otra
parte, los compuestos sintéticos que cumplen esta función son denominados
reguladores del crecimiento. El suplemento de auxinas y citoquininas resulta
fundamental para la regulación de la división celular, el alargamiento y la
diferenciación de las células en cultivo y la formación de órganos de novo u
organogénesis. El manejo de diferentes concentraciones relativas de estos
reguladores del crecimiento determina las respuestas organogénicas. Las giberelinas
se utilizan fundamentalmente en el cultivo de meristemas y en estudios de
diferenciación vascular. Actualmente se considera la importancia de otros reguladores
del crecimiento como el etileno (iniciación de yemas) y el ácido abscísico.

Las auxinas, ANA, AIA, AIB, NOA entre otras se solubilizan en NaOH 1 N, a excepción
del 2,4-D que es soluble en etanol o en dimetilsulfóxido (DMSO). Este solvente debe
ser manipulado con precaución ya que puede penetrar la piel y tiene efectos tóxicos.
El AIA, auxina natural, es fotosensible y se degrada por oxidación enzimática por lo
que se la adiciona a los medios de cultivo en concentraciones relativamente elevadas
(1-30 mg/L). Los restantes compuestos auxínicos se utilizan, en términos generales,
en un rango de concentraciones de entre 0,1 y 2 mg/L.

Las citoquininas más usadas en cultivo de tejidos son quinetina, benziladenina y
zeatina. Se las adiciona en relativamente bajas del orden de 0,1 a 1 mg/L. Son
solubles en HCl 1 N. Un compuesto sintético de marcada acción citoquinínica es el
thidiazurón (TDZ), se trata de una fenilurea sustituida. El agua de coco puede utilizarse
como fuente natural de citoquininas concentraciones en una dilución en el medio
sintético de cultivo de 10-15% (v/v).

Las giberelinas al igual que el ácido abscísico son reguladores del crecimiento
ocasionalmente usadas en cultivo de tejidos. Generalmente el GA3 se utiliza para
promover el crecimiento de cultivos celulares de baja densidad, en el cultivo de
meristemas para favorecer el crecimiento de callos y para elongar los entrenudos de
plántulas o vástagos in vitro.
Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores

Transparencias 24-28

Principales consideraciones y objetivos de cada una de las etapas detalladas:

Etapa 1: Seleccionar como planta madre un individuo que reúna las características
varietales deseadas, que se encuentre en adecuado estado fitosanitario y que haya
sido pre-tratada conforme a un programa de fertilización y aplicación de pesticidas.
Ajustar un protocolo de desinfección que permita obtener un gran porcentaje de
explantos libres de contaminantes superficiales y endógenos.
Etapa 2: obtención de yemas y/ o embrioides y en su multiplicación por repiques o
subcultivos sucesivos (cada 20-25 días) a medio fresco. Esta etapa determina la
disponibilidad y ampliación del stock comercial de plantas clonales. El material vegetal
puede multiplicarse y mantenerse bajo condiciones de cultivo in vitro durante un
tiempo prolongado. Resulta de fundamental importancia el renovar el stock
introduciendo permanentemente material vegetal fresco (nuevos explantos) de manera
de evitar la pérdida de la eficiencia y/o tasa de multiplicación debida a la senescencia
de los explantos.
Etapa 3: transferencia de los brotes o yemas obtenidos y amplificados en la etapa
previa a un medio de cultivo que promueva la diferenciación de raíces adventicias para
la obtención de plantas íntegras capaces de sobrevivir bajo condiciones de cultivo en
tierra.
Etapa 4: transferencia de las plantitas clonales a tierra o sustrato mezcla en maceta o
terrinas bajo condiciones controladas, en un invernáculo. En esta etapa se produce la
formación de raíces adventicias. En las especies herbáceas es relativamente fácil
mientras que en muchas especies leñosas resulta más complicada por su limitada
capacidad rizogénica.

Elección del explanto: cualquier tejido u órgano vegetal puede ser usado como
explanto iniciador del cultivo in vitro. El grado de éxito dependerá del sistema de
cultivo utilizado, de la especie vegetal en cuestión y de la adecuada desinfección
superficial inicial del material vegetal. El primer objetivo de la etapa I consiste en
obtener un gran porcentaje de explantos libres de patógenos superficiales. Los
explantos más utilizados para iniciar la propagación clonal in vitro de una planta son
las yemas apicales del vástago, estacas uninodales portando yemas axilares, discos
de hoja, secciones de raíz y meristemas. En general, los órganos jóvenes o bien
rejuvenecidos son los que tienen mejor respuesta en el establecimiento que los
obtenidos a partir de materiales adultos. Es importante además disminuir el daño
mecánico durante el aislamiento del explanto, ya que éste puede asociarse a la
liberación de compuestos fenólicos que pueden inhibir el crecimiento e incluso matar al
explanto.

Como paso preliminar al uso de soluciones desinfectantes resulta en muchos casos
ventajoso lavar el material vegetal bajo agua corriente (entre 30 minutos hasta 2
horas) de manera de reducir la posible carga de contaminantes que portan los
explantos. Esto resulta particularmente aconsejable cuando se trata de explantos
pubescentes, órganos de reserva (tubérculos, bulbos) o raíces. Este lavado puede ser
precedido por el uso de una solución jabonosa. Otros desinfectantes de amplio uso en
cultivo de tejidos vegetales son el peróxido de hidrógeno y el nitrato de plata. La
elección del orden de dilución del desinfectante así como el tiempo de exposición del
material vegetal a dicha solución dependerá del tipo de explanto y de su estado
fitosanitario de partida (por ejemplo si se trata de material que viene de campo o de
cultivo controlado bajo invernáculo, etc.). Una vez ajustadas estas variables de logrará
La esterilización superficial del material a establecer in vitro. En el caso de
contaminaciones bacterianas endógenas resultará necesario el uso de antibióticos
adicionados al medio de cultivo.

Una vez establecido el cultivo in vitro pueden esperarse diferentes respuestas que van
desde la muerte del explanto por la utilización de un medio de cultivo inadecuado; la
contaminación del material por sobre-crecimiento de algún microorganismo endógeno
o por un deficiente tratamiento de desinfección superficial; la regeneración indirecta a
partir de la formación de callo por proliferación de las células desdiferenciadas,
resultado de sucesivas mitosis o, por último, la aparición de brotes o embriones
somáticos directamente a partir del explanto inicial sin previa formación de callo. La
regeneración de brotes, yemas, primordios de raíz o embriones somáticos estará
determinada fundamentalmente por el balance de reguladores del crecimiento
adicionados al medio sintético de cultivo.


Vías morfogenéticas: organogénesis y embriogénesis

Transparencias 29-32

La determinación de cualquiera de estas dos vías morfogenéticas: la organogénesis y
la embriogénesis somática, no está aún claramente esclarecida. Resulta evidente que
se encuentran involucrados diferentes factores: la edad del la planta madre dadora de
explantos, el tipo de explanto, el medio de cultivo, los reguladores del crecimiento y las
condiciones artificiales de cultivo.

La primera respuesta estudiada in vitro fue la organogénesis en callos de tabaco. A
partir de estos estudios iniciales pudo conocerse que esta vía está químicamente
regulada. Un balance relativamente alto de auxinas:citoquininas induce la formación
de raíces adventicias mientras que una relación baja (menor a 1) de los mismos
compuestos favorece la producción de brotes. Además de la relación auxina :
citoquinina, numerosos reportes indican que otros factores están también involucrados
en la vía organogénica: entre ellos otros reguladores del crecimiento tales como las
giberelinas (que suprimen la iniciación de brotes o raíces) y el etileno endógeno (que
bloquea la iniciación de la organogénesis pero promueve el crecimiento y
diferenciación de los primordios de yemas o raíces preexistentes).

Por otro lado, los más importantes factores químicos involucrados en la vía
embriogénica son las auxinas y los compuestos nitrogenados reducidos (NH4Cl, urea,
ácido glutámico, glutamina). El suplemento de los medios de cultivo con carbón
activado promueve, en algunos casos, la embriogénesis al igual que el uso de
poliaminas endógenas (putrescina, espermidina). En términos generales se requieren
dos medios de cultivo diferentes para promover la embriogénesis somática: un medio
de iniciación de las células embriogénicas, conteniendo auxinas (2,4-D) y un segundo
medio para la diferenciación de los embrioides, sin agregado de auxinas o con un nivel
reducido de este tipo de compuesto (no 2,4-D).

Organogénesis en Lotus tenuis: diferenciación de yemas a partir de hipocótilos. Se
observa el primordio de una yema (d: domo meristemático, p: primer par de primordios
foliares). Se observa la conexión vascular de la yema con los restos del explanto
original y la continuidad anatómica entre el explanto y la neoformación. Foto de
embrión somático de Lotus tenuis: se observa un embrión en el estadio torpedo de
diferenciación. No existe conexión entre el embrión y las células parenquimáticas que
forman parte del explanto inicial.
Sistemas de micropropagación vegetal: proliferación de yemas axilares o
apicales

Transparencias 33-34

El desarrollo de yemas axilares y apicales puede ser promovido in vitro por activación
de meristemas quiescentes. Un explanto que contiene una yema única puede, de
acuerdo con las condiciones nutricionales y hormonales del medio de cultivo y con la
especie en cuestión, desarrollar un sólo brote o producir múltiples vástagos. A medida
que estos nuevos vástagos crecen, van surgiendo nuevos meristemas a lo largo de su
eje, los que, a través de repetidos subcultivos, darán lugar a múltiples brotes. La
proliferación de yemas preexistentes se favorece adicionando citoquininas en
concentraciones de entre 1-30 mg/L a los medios sintéticos de cultivo. La gran
mayoría de las especies vegetales puede ser propagada clonalmente con éxito por
este sistema de micropropagación. El mayor potencial de este procedimiento alcanza
a las plantas leñosas en las cuales la embriogénesis somática y la proliferación
adventicia de brotes no resultan ventajosas.


Sistemas    de   micropropagación           vegetal:    proliferación     de    tejidos
desdiferenciados

Transparencias 35-38

La proliferación adventicia de brotes y la formación de callos a partir de los explantos
pueden determinar la pérdida del potencial morfogenético de los cultivos o incrementar
la variabilidad genética. Existen al menos tres posibles explicaciones que explican esta
pérdida de potencialidad: a) pérdida de los centros meristemáticos debido a que estos
son estimulados para producir brotes diferenciados; b) variación en los niveles
endógenos de reguladores del crecimiento que no pueden ser reemplazados
exógenamente y c) acumulación de anormalidades cromosómicas tales como cambios
en el nivel de ploidía o rearreglos de los cromosomas.

La transparencia 37 presenta de manera esquemática las vías directa e indirecta de
regeneración de brotes in vitro. Partiendo de diferentes explantos iniciales (disco de
hoja, suspensión celular, meristema, estaca uninodal, entre otros), es posible
promover una u otra vía en función de la composición del medio de cultivo, el balance
de reguladores, las condiciones físicas del cultivo y la especie en cuestión. La vía
indirecta presupone la desdiferenciación total del explanto, seguida de sucesivas
divisiones mitóticas desordenadas que dan lugar a la proliferación de una masa
amorfa de células indiferenciadas denominada callo. La regeneración directa implica la
aparición de estructuras de novo, ya se trate de primordios de yemas o raíces
adventicias, a partir de células individuales o grupos de células parcialmente
desdiferenciados en el explanto. No existe en este caso proliferación masiva de
células desdiferenciadas con potencialidad meristemática.

Las imágenes contenidas en la transparencia 38 ilustran diferentes etapas y sistemas
de micropropagación de plantas de interés comercial. La foto superior izquierda
muestra vástagos de orquídea completando su enraizamiento in vitro listos para su
rusticación o pasaje a maceta. La foto superior derecha muestra el procedimiento
utilizado para la multiplicación de material clonal de kiwi a través del subcultivo de
estacas de uno o dos nudos. La foto inferior izquierda muestra múltiples yemas de
tomate creciendo de manera indirecta a partir de callos. La foto inferior derecha
muestra vástagos de jojoba en la etapa de enraizamiento.
Sistemas de micropropagación vegetal: cultivo de meristemas

Transparencias 39-41

El cultivo de meristemas representa una metodología para el saneamiento in vitro de
plantas infectadas. Sumados a la disección y establecimiento in vitro de los
meristemas (explantos) de la planta madre infectada resulta aconsejable emplear otros
tratamientos: la termoterapia y la quimioterapia. Estos tres diferentes procedimientos
pueden usarse por separado, pero incrementan notablemente su efectividad cuando
se los combina, trabajando in vivo e in vitro.

Los principales problemas fitosanitarios se deben a la presencia de patógenos cuya
eliminación, a través del uso de antibióticos y fungicidas, no resulta eficiente. Es
conocido que no existen tratamientos para eliminar las enfermedades de origen viral.
Por esto, resulta necesario complementar las técnicas antes mencionadas. El cultivo
de meristemas para el saneamiento de plantas infectadas resulta altamente eficiente
en el caso de plantas que se propagan vegetativamente. En la mayoría de los casos la
reproducción sexual constituye una barrera para la transmisión de virus y bacterias.
Existen excepciones (virus V del tomate, a través de las semillas)


Liberación de patógenos

Transparencias 42-56

La ausencia de contaminantes es un prerrequisito que asegura el adecuado
crecimiento y alta productividad de las especies vegetales de interés comercial. La
propagación clonal o masiva de plantas puede constituir un medio para la
diseminación de contaminantes endógenos entre las plantas cultivadas. Existe una
serie de consideraciones prácticas que minimizan la posibilidad de contaminación del
material vegetal bajo cultivo in vitro. Entre éstas se incluyen la detección temprana y
adecuada caracterización o identificación de los posibles patógenos, la cuidadosa
desinfección superficial del material vegetal y del instrumental requerido para su
manipulación, la selección de los explantos y el uso de agentes antimicrobianos in vivo
o in vitro. Estos procedimientos y recaudos deberán ser particularmente considerados
para la preparación y selección de plantas madres iniciadoras del stock comercial de
plantas micropropagadas. Es de ampliamente conocido el hecho de que los
meristemas vegetales están libres de contaminantes endógenos que afectan el resto
del cuerpo de una planta y por otra parte en general se considera que las plantas
provenientes del cultivo de meristema son idénticas, u homólogas, a la planta madre
de donde se extrajo el explanto. En la mayoría de los casos, se utiliza el domo
meristemático acompañado de 1 ó 2 primordios foliares.

El cultivo de meristemas in vitro permite, en gran cantidad de casos, el establecimiento
de cultivos libres de patógenos. Una vez confirmada la sanidad de las plantas bajo
cultivo, resulta indispensable monitorear regularmente esta condición.

Los principales problemas fitosanitarios se deben a la presencia de patógenos cuya
eliminación a través del simple uso de compuestos antimicrobianos no resulta
eficiente. Cuando se detecta la presencia de patógenos o contaminantes en el material
vegetal propagado, resulta indispensable establecer una estrategia de saneamiento
que contemple el tratamiento más adecuado o la suma de varios tratamientos. La
caracterización preliminar del tipo de microorganismo resulta esencial para la
selección adecuada del procedimiento a seguir. En el caso de la presencia de
bacterias u hongos, deberá intentarse el aislamiento de estos microorganismos en
cultivos puros y determinar su sensibilidad a antibióticos o fungicidas siguiendo
protocolos conocidos. El antibiótico y/o fungicida seleccionado deberá ser agregado a
los medios de cultivo o bien aplicado in vivo a la planta madre, a partir de la cual se
aislarán explantos o meristemas para iniciar el cultivo bajo condiciones controladas in
vitro. En el caso de la presencia de virus y viroides, el tratamiento con calor
(termoterapia), acompañado del uso de agentes antivirales no específicos y de baja
fitotoxicidad como la ribavirina, resulta indispensable. La ribavirina presenta actividad
contra los virus de ARNsc, los que representan a la gran mayoría de virus
fitopatogénicos. También se ha reportado su acción inhibitoria frente a diferentes
viroides. La eficiencia de las metodologías de saneamiento mencionadas se
incrementa notablemente cuando los diferentes tratamientos se utilizan en forma
combinada.

La termoterapia implica el tratamiento con altas o bajas temperaturas de plantas
infectadas con virus y/o viroides. La mayoría de los virus no se transmiten por semilla,
por lo tanto, las especies que se multiplican por esta vía, tienen la posibilidad de
liberarse de estos patógenos en forma natural. Mientras que las especies que se
propagan exclusivamente en forma agámica cuando son infectadas, los virus son
transmitidos desde la planta madre a la descendencia con alta eficiencia, en estos
casos, la obtención y multiplicación de plantas libres de virus por medios artificiales
juega un papel importante para mejorar la producción y calidad.

La adecuada caracterización del patógeno presente facilitará la elección y ajuste del
protocolo a seguir. La efectividad del tratamiento por termoterapia dependerá tanto del
rango de temperaturas seleccionado como del tiempo o ciclos de exposición de la
planta contaminada a las condiciones y temperaturas seleccionadas. Resulta
fundamental minimizar el posible daño irreversible a la planta bajo tratamiento. Una
vez aplicado el protocolo y monitoreada la calidad fitosanitaria de la planta tratada, se
procederá a la disección de los meristemas como explantos iniciadores del cultivo in
vitro.

El tratamiento por quimioterapia de plantas infectadas por diferentes patógenos resulta
una práctica muy difundida, no sólo bajo condiciones de laboratorio e invernáculo, sino
incluso a campo. La efectividad de la aplicación exógena de sustancias con probada
actividad antimicrobiana, de alta especificidad o de amplio espectro, dependerá de la
adecuada identificación del patógeno, del uso de una dosis adecuada y del correcto
manejo de la planta bajo tratamiento. La aplicación de los diferentes agentes tales
como antibióticos, insecticidas, agentes antivirales, podrá realizarse sobre la planta
madre, bajo condiciones de invernáculo o a campo, o bien durante el cultivo in vitro del
material vegetal infectado, adicionando los mencionados compuestos a los medios
sintéticos de cultivo. Cabe considerar que el uso repetido o a largo plazo de un
compuesto antibiótico, insecticida o antifúngico puede desarrollar respuestas de
resistencia o tolerancia por parte del patógeno a controlar. En cuanto a lo agentes
antivirales, hasta ahora no se ha encontrado compuestos que resulten en una solución
definitiva, algunas sustancias ocasionan una disminución en la concentración de virus,
y atenúan o suprimen los síntomas que produce la infección, pero suspendido el
tratamiento se recupera la concentración viral. En el caso de la Ribavirina,
ampliamente utilizado, también es necesario considerar su fitotoxicidad en función de
la especie a tratar, la dosis y el período del tratamiento.

La efectividad de la metodología de saneamiento aplicada debe ser confirmada a
través del monitoreo del estado sanitario de las plantas tratadas, pues cuanto más
temprano descartemos las plantas contaminadas más seguro será el sistema. Una
planta infectada siempre es un foco de contaminación. Esta evaluación fitosanitaria
puede llevarse a cabo por diferentes métodos, dependiendo del tipo de patógeno a
monitorear, de la localización del contaminante dentro de la planta a analizar, del tipo
de síntomas que desarrolla el patógeno, así como del tiempo y recursos de que se
disponga. En el caso de bacterias endógenas, se procederá a cultivar diferentes
explantos de la planta tratada bajo condiciones y medios de cultivo que propicien la
proliferación del patógeno con el fin de determinar su presencia. La microscopía óptica
y electrónica de transmisión constituyen herramientas valiosas para la detección de la
presencia de microorganismos intracelulares o de aquellos que colonizan el espacio
apoplástico. En el caso de hongos, bacterias y virus que desarrollan síntomas
característicos en la planta bajo cultivo, resulta válido conservar plantas bajo
condiciones de invernáculo para monitorear la aparición de los mismos. La posibilidad
de usar plantas indicadoras como método de evaluación sanitaria dependerá del
sistema huésped-patógeno en cuestión. Deberá contarse además con individuos de
una planta indicadora que sea altamente sensible y manifieste síntomas
característicos de la presencia del patógeno.

Muchas enfermedades de origen viral, bacteriano o fúngico presentan síntomas
distintivos que pueden ser fácilmente reconocidos por el observador. La presencia de
dichos síntomas constituye evidencia de la presencia de un patógeno en particular.
Debe aclararse que en algunos casos interfiere la subjetividad del observador, lo que
puede dar lugar a diagnósticos erróneos. La aparición se síntomas y el aspecto de
éstos puede variar con las condiciones medioambientales y con la fenología de la
planta. Por ello, resulta aconsejable mantener las plantas a evaluar en invernáculo
bajo condiciones controladas durante todo el monitoreo.

Muchas enfermedades de origen viral, como el mosaico causado por el Tomato
mosaic virus, presentan síntomas distintivos, tales como manchas cloróticas regulares
a nivel del follaje y la epidermis de los frutos maduros. Erwinia carotovora es una
bacteria gram-negativa que ataca a numerosas especies vegetales de importancia
comercial, entre ellas Solanum tuberosum. Este patógeno desarrolla diferentes
síntomas de acuerdo con el órgano vegetal que infecte. En los vástagos o tallos de
una planta de S. tuberosum infectada, se produce el denominado “pie negro”. Esta
enfermedad puede desarrollarse en cualquier edad de la planta. Los tallos de una
planta infectada presentan el cuello o base (porción comprendida entre el vástago y la
raíz) de color negro intenso. Al cabo de unos días se evidencia una marcada clorosis
en las hojas seguida de la marchitez de los tallos. Los tejidos de conducción a nivel del
vástago se ven también afectados, determinando finalmente la muerte de la planta.
Los tubérculos de S. tuberosum infectados con Erwinia carotovora desarrollan la
denominada “podredumbre blanda”. Esta enfermedad puede manifestarse durante el
almacenamiento de los tubérculos o en el suelo. Los síntomas distintivos incluyen la
maceración del parénquima de reserva con la oxidación de la porción periférica de la
lesión.

La gran mayoría de las enfermedades causadas por hongos presentan síntomas muy
conspicuos y característicos. Uno los ejemplos incluidos en la transparencia 50 es la
antracnosis en Fragaria spp. producida por Colletotrichum fragariae, la forma asexual
de un hongo ascomycete. Las manifestaciones de la antracnosis en Fragaria consisten
en la aparición de lesiones necróticas en estolones y pecíolos. Estas lesiones van
aumentando de tamaño hasta involucrar a todo el órgano. Pueden aparecer también
lesiones firmes, redondeadas y ligeramente deprimidas en la superficie de los frutos
maduros. Estas áreas necróticas van incrementando su tamaño hasta cubrir todo el
fruto que termina por secarse momificándose. El otro ejemplo que se presenta en la
transparencia 50, el Powdery Mildew, es una enfermedad que ataca el follaje de
diferentes especies vegetales y es causada por hongos del género Erysiphe (forma
asexual de un ascomycete). En etapas tempranas de la infección, se observan en
ambas caras de la lámina de las hojas depósitos pulvurulentos blanquecinos debidos a
la esporulación del hongo. En etapas más avanzadas de la enfermedad, se evidencian
áreas necróticas en las hojas. Finalmente se produce la abscisión de estos órganos.

Los nemátodos fitopatógenos son organismos pequeños observables al microscopio.
Presentan forma alargada, el cuerpo liso, no segmentado y carecen de patas u otros
apéndices. Su ciclo de vida incluye cuatro etapas larvarias y se completa en 3 ó 4
semanas. La mayoría de las especies de nemátodos fitopatógenos vive libremente en
el suelo, alimentándose de las raíces y tallos subterráneos de las plantas susceptibles.
La temperatura, humedad y aireación afectan a la supervivencia y a la movilidad de
estos organismos en el suelo. La mayor concentración de nematodos en la región
radical de la planta hospedera se debe principalmente a que es allí donde encuentran
una mayor disponibilidad de alimento, lo que favorece su reproducción y crecimiento,
además del efecto de atracción que ejercen sobre ellos determinadas sustancias
liberadas por la planta. Los nemátodos se distribuyen con gran facilidad a través del
equipo agrícola, el sistema de riego, las inundaciones, las patas de los animales, los
productos agrícolas y las plantas provenientes de viveros. Además, su dispersión se
incrementa cuando los órganos de plantas infectadas entran en contacto con los de
plantas sanas. Al alimentarse, los nemátodos penetran en el espacio apoplástico,
perforan las paredes celulares, inyectan secreciones en las células y succionan parte
de sus contenidos. Los daños provocados en los tejidos de la raíz disminuyen su
capacidad de absorción, por lo que se desarrollan síntomas de deficiencia de agua y
nutrientes en los órganos aéreos de la planta. Finalmente, las lesiones producidas
constituyen puntos de entrada para otros patógenos.

La mayoría de los síntomas producidos por los virus se asemejan a los ocasionados
por insectos u otros patógenos, o a los de ciertas deficiencias nutricionales. La
determinación certera de que determinados síntomas se deben a la presencia de un
virus incluye la exclusión de otros posibles agentes causales de enfermedad y la
transmisión de virus a partir de plantas enfermas. Entre los métodos que se utilizan
para detectar virus fitopatógenos, se incluye la transmisión del virus de una planta
enferma a una sana, ya sea por injerto, frotación o inyección de extractos.
Históricamente, se han utilizado otros métodos de transmisión como insectos vectores
o plantas parásitas (como la cuscuta). La prueba definitiva de la presencia de un virus
en una planta la proporciona su purificación, su observación en el microscopio
electrónico y las pruebas serológicas o moleculares.

Cuando una proteína de un virus o cualquier otra proteína extraña (antígeno) se
inyecta en un mamífero o en un ave, induce la formación de anticuerpos en el suero
sanguíneo, los cuales reaccionan específicamente con el antígeno inyectado. El virus
y su anticuerpo se acoplan en varias formas siendo la más común la reacción de la
precipitina. En esta reacción, los anticuerpos y antígenos se mezclan en solución, se
acoplan en la interfase entre las dos soluciones separadas (prueba de la interfase) o
bien se difunden a través de un gel y se precipitan en una zona en condiciones
apropiadas (prueba de Ouchterlony). En ocasiones, el antígeno es adsorbido sobre la
superficie de partículas grandes y éstas se precipitan al añadir los anticuerpos
(reacción de aglutinación). En todas estas pruebas, la reacción puede observarse
como una precipitación en un tubo de ensayo o la formación de una banda en una
interfase.

La observación directa de los posibles patógenos en el espacio intra- o extracelular
resulta posible con el uso de la microscopía electrónica. Sin embargo, aún con este
instrumento, las partículas virales no siempre son fáciles de detectar. Los virus
fitopatógenos presentan diferentes morfologías, como varillas, bacilos, filamentos,
esferas, formas isodiamétricas e incluso poliédricas. Su tamaño también es variado,
desde 10 nm por 2000 nm (Tristeza mosaic virus) a 17-60 nm de diámetro (diferentes
virus esféricos o poliédricos).


Conservación de germoplasma

Transparencias 57-64

La conservación de la biodiversidad constituye un objetivo prioritario en un escenario
en que las relaciones entre el desarrollo tecnológico y la conservación del ambiente
ocupan crecientemente el debate público. En particular, la conservación de los
recursos fitogenéticos de interés para la agricultura es un factor ampliamente
reconocido para contribuir al desarrollo sostenible de la misma y a la conservación de
los recursos naturales. Uno de los ventajas más destacables del cultivo de tejidos in
vitro es su posibilidad de propagar a gran escala cualquier material vegetal con mínimo
riesgo de introducir o reintroducir patógenos y con alto grado de estabilidad genotípica.
Por esta razón, han encontrado sus aplicaciones en la conservación e intercambio de
recursos fitogenéticos se ha incrementado aceleradamente.

Tradicionalmente, la conservación de recursos fitogenéticos se ha basado en dos
metodologías: ex situ e in situ. La conservación ex situ incluye al cultivo de células y/o
tejidos vegetales (bancos de germoplasma in vitro). Los métodos de conservación in
situ contemplan la preservación de las especies de interés en su hábitat natural. La
criopreservación consiste en la conservación a temperaturas ultra bajas (-196°C) en un
medio criogénico como el nitrógeno líquido. Durante las últimas décadas se ha
avanzado mucho en el estudio de la respuesta del material vegetal a bajas
temperaturas. Como parte de ello, se han estudiado los procesos fisiológicos y
bioquímicos involucrados en la criopreservación y se han investigado las condiciones
que posibilitan la preservación de la viabilidad del material vegetal almacenado por
este método.

Los bancos de germoplasma in vitro posibilitan el mantenimiento a largo plazo de
material vegetal en medios sintéticos de cultivo, bajo condiciones controladas de luz,
fotoperíodo y temperatura. El manejo de este material no difiere demasiado de los
procedimientos generales utilizados para la micropropagación vegetal. Ciertas
variables, tales como la concentración de los compuestos osmóticamente activos, la
concentración del agente gelificante inerte, la temperatura de cultivo y la luz, son
ajustadas de manera de determinar una disminución de la tasa metabólica del material
vegetal. De esta manera, se logra minimizar la manipulación y espaciar los
subcultivos, lo que contribuye al descenso de los costos de mantenimiento. Una
práctica general consiste en disminuir la intensidad lumínica y reducir la temperatura.
Bajo estas condiciones restrictivas (por ejemplo, en oscuridad y a 4°C), es posible
conservar plántulas de Fragaria x ananassa (frutillas o fresas) durante años, con el
agregado esporádico de gotas de medio de cultivo fresco al material en conservación.
Las condiciones estándar de cultivo in vitro sólo pueden utilizarse para conservación a
mediano plazo de especies de crecimiento lento, como por ejemplo Coffea arabiga.
Las plántulas de café micropropagadas pueden ser conservadas en un medio de
cultivo estándar a 27°C, sin necesidad de ser repicadas o subcultivadas
periódicamente a medio fresco, durante un año.

Entre los métodos más conocidos de conservación de recursos filogenéticos ex situ se
encuentran los bancos de semillas. Una gran proporción de especies vegetales de
importancia agronómica produce semillas que pueden ser deshidratadas hasta un bajo
contenido de agua de manera de poder ser conservadas a baja temperatura. En este
sistema de conservación existe una situación de compromiso entre diferentes factores,
como el contenido de agua, la temperatura, la longevidad de la semilla y la
supervivencia del embrión latente. Este sistema, si bien resulta muy práctico y
economico, presenta importantes restricciones para grupos de especies de interés
comercial que no producen semillas y se propagan vegetativamente (Musa spp.), que
se propagan por tubérculos, rizomas o estolones (Solanum tuberosum, Saccharum
spp.), cuya semilla botánica presenta alta variabilidad genotípica o que producen
semillas recalcitrantes (semillas que no toleran la deshidratación ni la conservación a
baja temperatura). Este último es el caso de muchas plantas tropicales que producen
semillas de gran porte con alto contenido de endosperma líquido (Cocos nucifera,
Persea americana).

El primer reporte sobre el mantenimiento en nitrógeno líquido de órganos o tejidos
vegetales data de 1968. En esta oportunidad, Quatrano logró preservar células de
Linum usitatissimum por esta técnica, con el interés agregado de conservar diferentes
genotipos. La metodología publicada en aquella oportunidad no difería del
procedimiento ya conocido y puesto en práctica para la conservación de otros
materiales biológicos (semen y tejidos ováricos de vacunos). El procedimiento
comprendía el uso de sustancias crioprotectoras, el enfriamiento y deshidratación
lentas de la muestra vegetal, el almacenamiento en nitrógeno líquido, y sucesivos
pasos de descongelamiento, lavado y recuperación. En la actualidad, se ha producido
una gran diversificación de las técnicas de crioconservación. Las diferentes opciones
metodológicas dependen del tipo de muestra biológica así como de las facilidades e
infraestructura disponibles. El uso de la crioconservación ofrece varias ventajas en
relación con las técnicas tradicionales, ya que permite la conservación a largo plazo
con bajos costos de mantenimiento, una fácil manipulación de las muestras y no
dependen del suministro eléctrico.

Los pasos incluidos en la técnica de criopreservación pueden variar según el tipo de
material a conservar. Las sustancias crioprotectoras usadas exitosamente en el caso
de tejidos u órganos vegetales pueden resultar tóxicas o inadecuadas para la
preservación de otros tipos de explantos tales como suspensiones celulares o
protoplastos. El congelamiento puede llevarse a cabo de forma lenta, gradual o de
manera rápida. La elección de una u otra vía dependerá del tipo de muestra. En todos
los casos, se trata de evitar la formación de cristales de agua intracelulares que
pudieran destruir las células y dañar las muestras a conservar. Numerosos estudios
han demostrado que la tasa de congelamiento óptima para asegurar una elevada
supervivencia del material conservado oscila entre –1°C a –2°C por minuto. La edad
de las células vegetales en el momento de su congelamiento constituye un factor
importante que determina su supervivencia. Esta condición se relaciona directamente
con el tamaño y contenido de agua celulares. En el protocolo pueden introducirse
modificaciones que incluyan la adición de compuestos osmóticamente activos (manitol,
sorbitol) durante el precultivo del material a conservar, de manera de reducir el tamaño
celular y aumentar su tolerancia al congelamiento.

El material vegetal a conservar deberá ser preparado y preacondicionado con
sustancias crioprotectoras. Estas sustancias minimizan el posible daño a que están
expuestos las células y tejidos durante los pasos de enfriamiento y congelamiento. La
elección de los medios crioprotectores dependerá del tipo de material a congelar.
Cuanto menor sea el nivel de organización del material a preservar, mayores deberán
ser los recaudos que deberán tomarse. Durante el paso de congelamiento, la
eliminación del contenido de agua en las células y el estado del agua remanente en el
interior de ésta, resultan factores críticos. Las modernas técnicas de crioconservación
se basan en el fenómeno de la vitrificación. La vitrificación consiste en la transición
directa del agua del estado líquido al estado amorfo o vítreo sin la formación de hielo
cristalino. En este procedimiento, las muestras a congelar son previamente
deshidratadas por exposición al aire o por el uso de los medios crioprotectores antes
referidos. Estos pasos minimizan la formación de cristales intracelulares que dañarían
la integridad de las células vegetales a conservar.

El descongelamiento puede acelerarse sumergiendo las muestras en un baño de agua
a 40ºC, durante 1-2 min y agregando gradualmente medio de cultivo para diluir las
sustancias crioprotectoras y evitar la plasmólisis celular. El material congelado puede,
de lo contrario, dejarse a temperatura ambiente en el laboratorio, lográndose así un
descongelamiento lento. Una vez recuperadas las muestras debe estudiarse su
viabilidad. Existen diferentes métodos o pruebas que permiten estimar la viabilidad de
células y protoplastos. Las pruebas colorimétricas como el método del cloruro de
2,3,5-trifenil tetrazolio (TTC) y la tinción con diacetato de fluoresceína (FDA) permiten
distinguir las células vivas de las no viables por desarrollo de color o de fluorescencia.
El material vegetal descongelado viable podrá ser recultivado bajo condiciones
controladas, haciendo uso de los mismos medios y condiciones en que se lo cultivaba
antes de su criopreservación.

El congelamiento constituye el paso crítico de la crioconservación. La elección de
alguna de una de las tres modalidades de congelamiento (rápido, lento o escalonado)
dependerá de las características del material a preservar. Si la muestra es pequeña
podrá practicarse un congelamiento rápido, haciendo uso de sustancias
crioprotectoras. En el caso de muestras de mayor tamaño, podrá optarse por un
procedimiento lento o gradual, dependiendo del contenido de agua del material a
conservar. Para muestras de alto contenido de agua, el congelamiento escalonado
resulta aconsejable luego de la deshidratación cuidadosa de la muestra. El
congelamiento lento y el procedimiento gradual aseguran un adecuado progreso del
congelamiento desde el interior de la muestra hacia la superficie externa.

La transparencia 64 muestra un esquema de los pasos implicados en la
crioconservación de meristemas de soja. Los meristemas son diseccionados bajo lupa
estereoscópica y establecidos in vitro en un medio conteniendo la formulación salina
de Murashige y Skoog complementada con diferentes reguladores del crecimiento.
Una vez desarrollados los vástagos o brotes, sus meristemas son nuevamente
separados como explanto a crioconservar. Como sustancia crioprotectora se utiliza
dimetilsulfóxido (DMSO) al 5%. La tasa de congelamiento se ajusta a 0,84°C por
minuto, de manera de evitar la formación de cristales intracelulares. Una vez
congelados, los meristemas son sumergidos en nitrógeno líquido y conservados a
largo plazo a -196°C. La recuperación del material vegetal incluye su
descongelamiento a temperatura ambiente, su lavado y su siembra en condiciones de
cultivo que incluyen medios nutritivos ricos y reguladores del crecimiento. Estos
factores favorecen el desarrollo de nuevos vástagos que crecerán in vitro para dar
lugar a plantas completas. Otra posible vía para la recuperación del material
conservado, consiste en la encapsulación de los meristemas recuperados en cápsulas
de alginato para su manejo como semilla sintética. Estas semillas artificiales pueden
ser luego sembradas en condiciones de germinación adecuadas para obtener plantas
completas.


Cultivo in vitro de células haploides y embriones

Transparencias 65-71

Las células haploides contienen un único juego de la dotación cromosómica, por lo
que constituyen una valiosa herramienta para la selección de caracteres deseables en
los programas de mejoramiento. El fenotipo de las plantas derivadas de estas células
resulta de la expresión de la única copia del material genético, por lo que no existe
enmascaramiento de caracteres debido a efectos de dominancia. El objetivo del
cultivo de anteras y polen es producir plantas haploides partiendo de esporas
monoploides, ya sean éstas granos inmaduros de polen o microsporas, mediante la
inducción de la embriogénesis. El complemento cromosómico de estos haploides
puede ser luego duplicado con el uso de colchicina o a través de la regeneración de
diploides homocigotas fértiles. Con los métodos convencionales de mejoramiento, la
homocigosis práctica se logra recién luego de varias generaciones de
autofecundación. En las plantas autógamas, en forestales y frutales aún siendo posible
la autopolinización, el largo tiempo requerido para alcanzar la fase adulta resulta un
obstáculo. Mientras que con una técnica de producción de haploides seguida de
duplicación cromosómica, es posible llegar a homocigosis completa en solo una
generación.

Las anteras de numerosas especies vegetales, entre ellas el tabaco, pueden ser
cultivadas de manera relativamente simple, en medios conteniendo minerales y
sacarosa. En general, la formulación salina más utilizada es la de Murashige y Skoog
aunque, para el caso de algunas plantas, resulta conveniente modificar el contenido
relativo de NH4. Algunas otras especies requieren la adición de compuestos orgánicos
y hormonas vegetales. La adición de reguladores del crecimiento del tipo de las
auxinas da lugar a la formación de callos, lo que resulta desaconsejable porque
promueve la variabilidad genética. En 1953, Tulecke observó por primera vez la
inducción de callos haploides a partir de granos de polen maduros de la gimnosperma
Gynkgo biloba en condiciones adecuadas de cultivo. Hacia 1966, Guha y Maheshwuari
reportaron la observación de divisiones repetidas de granos de polen de diferentes
angiospermas in vitro. Estos investigadores realizaron experimentos de cultivo de
granos de polen de Datura inoxia (una planta solanácea) como medio para el estudio
de los factores reguladores de la meiosis. En el marco de esta investigación, lograron,
la obtención de embriones somáticos que dieron origen a plantas normales con un
único juego de cromosomas.

La capacidad de respuesta al cultivo de anteras, denominada capacidad androgénica,
puede ser evaluada a través de la producción de callos y de plantas verdes. El estadio
de desarrollo de las anteras en el momento de inicio del cultivo resulta el factor más
importante para la obtención de una respuesta morfogenética. En el caso de las
angiospermas con un número indeterminado de anteras, es conveniente seleccionar
botones florales con diferente número de las mismas en los distintos estadios de
maduración. En el caso de especies con número determinado de anteras, deberá
examinarse cierta cantidad de pimpollos para contar al inicio del cultivo con anteras en
diferentes estadios de maduración. La relación entre el grado de desarrollo y la
respuesta al cultivo in vitro permite definir tres tipos de anteras: a) anteras pre-
mitóticas; son aquellas que responden mejor al cultivo in vitro una vez que las
microsporas han completado su meiosis (ejemplo, Hordeum vulgare); b) anteras
mitóticas; son aquellas que responden óptimamente al cultivo cuando se las siembra
luego de la primera división mitótica del grano de polen (ejemplo, Nicotiana tabacum) y
c) anteras post-mitóticas; son aquellas que responden al cultivo cuando los granos de
polen ya han alcanzado su estado bicelular (ejemplo, Atropa belladona). El tratamiento
de anteras o panículas de arroz a 10ºC durante 8 d aumenta su respuesta al cultivo in
vitro, disminuye el albinismo de los cereales y estimula la división mitótica ecuatorial
de las microsporas androgenéticas.

En un programa de mejoramiento, el tiempo requerido para obtener una línea
isogénica se reduce de 5/6 generaciones a 1/2 cuando se emplea el cultivo de
haploides in vitro. La duplicación del material genético de los haploides obtenidos se
logra tratando las anteras con colchicina antes de la primera división mitótica del
polen. Se obtiene así una primera generación de homocigotas, recuperándose la
fertilidad. Cuando el cultivo se inicia a partir de microsporas no tratadas con colchicina,
las plantas producidas resultan haploides (y por lo tanto estériles), pero pueden ser
diploidizadas posteriormente. La producción de haploides in vitro no presenta
limitaciones una vez introducidos al protocolo los necesarios ajustes para cada
especie de interés.

Un protocolo general de cultivo de granos de polen incluye los siguientes pasos: a)
cultivo in vitro de las anteras durante 2-3 d; b) ruptura y siembra en medio de cultivo
líquido para obtener suspensiones de aproximadamente 5x104 granos de polen; c)
filtración y centrifugación de la suspensión; d) resuspensión del polen en medio de
cultivo líquido a la densidad deseada. Las condiciones generales de cultivo de los
granos de polen incluyen la formulación salina de Sunderland y Roberts (1977),
oscuridad (durante los primeros 15 d de cultivo), y temperatura de 28°C.

El cultivo in vitro de polen implica la interrupción del desarrollo normal de la gameta
masculina, forzando la evolución de estas células hacia la formación de una plántula
haploide. Para favorecer esta diferenciación, los granos de polen deben ser aislados
de su medio natural dentro de las anteras e incubados bajo condiciones artificiales de
cultivo. Antes de iniciar el cultivo de polen, debe considerarse muy cuidadosamente el
estado de la planta a partir de la cual se obtendrá el mismo (planta dadora). Esta
deberá mantenerse en condiciones favorables de cultivo bajo un régimen óptimo de
iluminación. Durante el período de desarrollo del polen (androgénesis) deberán
extremarse los cuidados de la planta madre para evitar cualquier condición de estrés
que resultaría en un anormal desarrollo de las células de interés. Antes de la remoción
del polen del interior de las anteras, resulta aconsejable mantener los botones florales
a temperatura adecuada. El frío sincroniza el desarrollo de los granos de polen,
promoviendo el cese de su actividad metabólica y preparándolos para iniciar su
división vegetativa cuando se restablecen condiciones inductoras adecuadas (medio
de cultivo, temperatura, luz). El efecto de la baja temperatura puede compararse a una
vernalización o dormición inducida. El rango de temperaturas a utilizar depende de la
especie vegetal en cultivo.

La polinización seguida de la fertilización resulta en la formación de un embrión
contenido en una semilla. En la gran mayoría de las angiospermas la autopolinización
se encuentra limitada. Además, las hibridaciones interespecíficas e intergenéricas son
muy poco frecuentes en la naturaleza. Por esta razón, la polinización y la fertilización
in vitro constituyen herramientas muy útiles en los programas actuales de
mejoramiento. La gran mayoría de los embriones obtenidos por estas vías no resultan
viables en condiciones naturales, por lo que deben ser rescatados, es decir cultivados
bajo condiciones controladas in vitro, fuera de la semilla.

El cultivo de embriones inmaduros consiste en la disección de los mismos bajo
condiciones de esterilidad y en su transferencia a un medio adecuado de cultivo bajo
condiciones controladas. En general, resulta fácil obtener embriones libres de
patógenos, ya que se encuentran protegidos dentro del medio estéril del ovario. Antes
de la disección y establecimiento in vitro, se debe proceder a desinfectar
superficialmente los ovarios, semillas y/o frutos que los contienen. En el caso de
semillas con tegumentos duros o gruesos, se las sumergirá en agua durante uno o
pocos días para luego utilizar soluciones desinfectantes. Las semillas esterilizadas
deben ser abiertas dentro de un gabinete de flujo laminar. Los embriones inmaduros
se remueven de la semilla y se siembran en medio nutritivo estéril. En muchos casos,
la disección de los embriones se lleva a cabo bajo una lupa estereoscópica instalada
dentro del cuarto estéril. Durante la manipulación debe tenerse particular cuidado para
evitar daños mecánicos o deshidratación. El aspecto más importante del cultivo de
embriones es la composición del medio sintético de cultivo. Cuanto más joven o
inmaduro es el embrión, mayores son sus requerimientos nutricionales, requiriendo
sales inorgánicas y una fuente de hidratos de carbono (sacarosa), diferentes
combinaciones de vitaminas, aminoácidos, reguladores del crecimiento y, en algunos
casos, extractos naturales de endospermo, tales como agua de coco. Dado que en
general los embriones inmaduros se encuentran naturalmente embebidos dentro del
endospermo que los rodea, resulta recomendable adicionar compuestos
osmóticamente activos al medio de cultivo (por ejemplo, manitol).

La técnica de la polinización y fertilización in vitro fue desarrollada por investigadores
de la Universidad de Delhi, India, en los años 60 utilizando como especie modelo
Papaver somniferum. El éxito de esta técnica depende de dos factores básicos: a) el
estado de los granos de polen y de los óvulos a utilizar y, b) la composición del medio
nutritivo adecuado para la inducción de la germinación del polen, el crecimiento del
tubo polínico y el desarrollo del embrión. Para el manejo de estas condiciones, resulta
imprescindible el conocimiento de la biología floral de la especie de interés, lo que
implica poseer información sobre los procesos de antesis, la dehiscencia de las
anteras, la polinización, la germinación del polen y el desarrollo del endosperma y del
embrión.


Semillas sintéticas

Transparencias 72-75

La posibilidad de obtener embriones somáticos a gran escala ha sentado las bases
para el desarrollo de la denominada tecnología de las semillas sintéticas. La
producción de estas semillas artificiales se ha convertido en una alternativa para el
manejo extensivo de especies cultivables. Numerosas especies de interés agronómico
pueden hoy en día ser multiplicadas clonalmente y sembradas a campo utilizando esta
tecnología. Estas semillas pueden ser manejadas como si se tratara de semillas
tradicionales, incluso con el auxilio de maquinaria agrícola.

La transparencia 32 mostraba un esquema de la vía embriogénica iniciada a partir de
un trozo de tejido o de células vegetales en suspensión. Se grafica la regeneración
indirecta, que pasa por des-diferenciación del explanto inicial y sucesivas divisiones
mitóticas par dar lugar a la formación de un callo. En algunos casos, resulta posible
promover la regeneración directa de embriones somáticos (sin formación de callo),
minimizándose de esta forma la posibilidad de variabilidad genotípica. Los embriones
o embrioides de origen somático pueden mantenerse bajo condiciones de cultivo in
vitro, subcultivándolos en un medio que propicie su germinación, o bien pueden
encapsularse para la obtención de semillas sintéticas. En ambos casos su germinación
dará lugar a una planta idéntica a la planta madre seleccionada.

Para la obtención de semillas sintéticas, los embriones somáticos son encapsulados
en gotas de alginato de sodio al 2%. Existen diferentes procedimientos, incluso
mecanizados, para disponer los embriones en el interior de cada gota. El más sencillo
consiste en dispensar, mientras la solución de alginato se engloba por goteo, un
embrión dentro de una gota en formación con auxilio de una pipeta o jeringa. Las
gotas conteniendo los embriones se agregan a ritmo lento en una solución de NO3Na
100 mM, lo que promueve su gelificación y da lugar a la formación de semillas
sintéticas (perlas de alginato conteniendo embriones somáticos). tipos de semillas
sintéticas. Las semillas sintéticas pueden fabricarse de diferentes maneras,
básicamente se pueden usar embriones hidratados (tal como resultan de la
embriogénesis somática) o bien pueden ser desecados. El sistema más usado, es de
la semilla con embriones somáticos hidratados y provistos de una cubierta protectora,
ya que al no estar expuestos a la desecación se obtienen mayores valores de
conversón en plantas.

El tipo de embrión es quizás el factor más importante que influye en la calidad de la
semilla sintética. Deben poder generarse rápidamente, en grandes cantidades, no
fusionarse entre sí, ni formar callos. Deben desarrollarse de manera sincronizada y
convertirse rápidamente en plantas. Es altamente deseable que conserven su
viabilidad por largo tiempo en condiciones de laboratorio o mantenidos en
refrigeradores comerciales. Generalmente la falta de embriones de calidad es el factor
limitante de la producción de semillas sintéticas.


Cultivo de protoplastos

Transparencias 76-80

La transparencia 77 muestra una típica suspensión de protoplastos de Nicotiana
tabacum. Los protoplastos son células vegetales desprovistas de pared celular. La
introducción en la década de los años 60 de métodos de aislamiento de protoplastos
viables por tratamientos enzimáticos posibilitó su obtención a gran escala y su
utilización para estudios experimentales. En medios nutritivos adecuados y bajo
condiciones controladas de cultivo, los protoplastos pueden regenerar su pared
celular, dividirse y diferenciarse dando lugar a plantas completas.

Los protoplastos constituyen un explanto ideal para diferentes aplicaciones
biotecnológicas. La ausencia de pared celular rígida y la completa exposición de la
membrana plasmática hacen de los protoplastos un sistema útil para el estudio de los
fenómenos de transporte a través de esta última. Numerosas investigaciones acerca
del proceso de infección y replicación de virus fitopatógenos se han valido de los
protoplastos como herramienta de indagación. También han sido utilizados para la
elucidación de la especificidad y modo de acción de patógenos fúngicos y bacterianos.
Los protoplastos aislados son capaces de incorporar organelas exógenas, tales como
núcleos y cloroplastos, así como también ADN, proteínas, y otras macromoléculas, lo
que posibilitó el desarrollo de ensayos de transformación genética y de fusión. Estos
explantos pueden ser empleados con éxito en ensayos de mutagénesis y la
regeneración posterior de plantas transgénicas.

El incremento en la variabilidad genética puede inducirse en poblaciones homogéneas
de células vegetales, protoplastos o callos, mediante la exposición a agentes
mutagénicos físicos o químicos. Estos agentes permiten de incrementar el aislamiento
de variantes genéticas cuando los cultivos son mantenidos bajo condiciones selectivas
que permiten la rápida detección de mutantes. Los principales tipos de mutantes son:
a) auxotróficos; aquellos que requieren suplementos nutricionales para su crecimiento;
b) resistentes; los que resisten a drogas específicas, antimetabolitos o condiciones
nutricionales anormales y c) autotróficos; aquellos que crecen y prosperan en medios
de cultivo deficitarios y son capaces de sintetizar compuestos normalmente requeridos
por las líneas wild type.

La mayor ventaja que ofrece el cultivo in vitro de protoplastos es la posibilidad de tratar
un gran número de células con los agentes mutagénicos y de seleccionar dichos
explantos bajo condiciones controladas. Los avances en las técnicas de cultivo in vitro
han posibilitado el perfeccionamiento de este procedimiento para la producir líneas
celulares, tejidos y organismos mutantes en forma más rápida y eficiente que los
procedimientos convencionales. Con la difusión de la mutagénesis y cultivo in vitro, los
investigadores han podido encarar el desarrollo de numerosas aplicaciones de interés
económico. Ejemplos de ello son la selección de líneas resistentes a estrés para
obtener plantas adaptadas a suelos salinos, la obtención de plantas resistentes a
herbicidas y pesticidas, la selección de líneas celulares y plantas tolerantes al
anegamiento o a temperaturas elevadas y la obtención de plantas con alteraciones en
la síntesis de metabolitos secundarios de valor comercial (pigmentos y alcaloides).

La fusión de protoplastos posibilita el cruzamiento de individuos que no son
compatibles en la naturaleza y que no puede lograrse a través de las técnicas
tradicionales de mejoramiento. Los protoplastos pueden fusionarse espontáneamente
durante su aislamiento o ser inducidos a ello por exposición a condiciones especiales.
Los heterocariontes resultantes pueden contener numerosos núcleos. Estos
protoplastos multinucleados forman una nueva pared y sus núcleos entran en mitosis
sincrónicamente. El proceso meiótico continúa y se sincroniza en los homocariontes.
Los productos de la fusión pueden ser estudiados por diferentes métodos. La tinción
diferencial de núcleos permite monitorear los productos de fusión. La relación 1:1 entre
los núcleos de cada especie resulta ser la más frecuente. Los protoplastos
multinucleados se deterioran mientras que los productos de la fusión se recuperan del
tratamiento con polietilenglicol (PEG) y forman su nueva pared dentro de las 24 h. La
producción de células híbridas entre diferentes familias de plantas como tabaco y soja,
zanahoria y cebada, tomate y papa, entre otras, sugiere la ausencia de mecanismos
de incompatibilidad entre las células somáticas. La naturaleza híbrida de las progenies
celulares puede establecerse en base a estudios de ultraestructura, identificación de
cromosomas, isoenzimas, patrón de polipéptidos, marcadores moleculares, etc.


Variación somaclonal

Transparencias 81-84

La variación genética espontánea ha sido tradicionalmente utilizada para desarrollar
nuevas variedades de plantas. Durante el cultivo in vitro, cuando los tejidos pasan por
fases de des-diferenciación, se producen alteraciones que pueden originar cambios
genéticos en las plantas regeneradas. Estos cambios se denominan variación
somaclonal y puede servir como fuente de variación genética para programas de
mejoramiento de plantas de importancia económica. También puede ser utilizada
como fuente para la obtención de mutantes con características genéticas, bioquímicas,
fisiológicas y agronómicas determinadas.

La frecuencia de aparición de variantes somaclonales es generalmente mayor en la
regeneración indirecta (aquella que pasa por la formación de un callo) y en los cultivos
celulares que incluyen alteraciones en el número de juegos cromosómicos
(poliploidia), pérdida de cromosomas (aneuploidia), aberraciones cromosómicas
(deleciones, traslocaciones, inversiones) o mutaciones puntuales. Esto hace de los
cultivos de callos y células en suspensión sistemas interesantes y útiles para el
aislamiento, por medio de distintas presiones de selección, de células variantes o
mutantes con características específicas. Por ejemplo, la variación somaclonal puede
utilizarse para aislar células resistentes a sustancias tóxicas (herbicidas, toxinas
microbianas, metales pesados, etc.) o a factores abióticos como el frío, la salinidad y la
sequía.

Durante el cultivo in vitro de células y/o tejidos vegetales puede ocurrir la obtención de
regenerantes que presenten una alteración espontánea de su fenotipo. En los
programas de propagación clonal masiva, esta variabilidad resulta desventajosa o
negativa, principalmente cuando se origina a partir de mutaciones cromosómicas o
genómicas. Debido a que estos nuevos genotipos difieren del tipo varietal de la planta
madre de origen, deben ser descartados y separados del cultivo. Sin embargo, en los
últimos años la variación somaclonal ha comenzado a considerarse una fuente valiosa
para el mejoramiento intra-cultivar. Este tipo de variabilidad puede verse favorecida
bajo condiciones restrictivas o bajo presión de selección.

En un protocolo de selección de variantes somaclonales, resulta fundamental aplicar la
presión de selección adecuada durante el cultivo. Esta presión de selección puede
estar dada por el agregado de determinados compuestos al medio de cultivo
(antibióticos, herbicidas, etc.), o por el aumento o la modificación de la concentración
relativa de algunos componentes de la formulación salina (por ejemplo, alta
concentración de NaCl), por variación de la temperatura en la cámara de crecimiento,
o por la alteración de las condiciones de iluminación (intensidad o fotoperíodo), entre
otras.

Luego de la generación de mutantes, las poblaciones generadas pueden ser
evaluadas mediante un análisis de genética reversa como la técnica de TiLLiNG (del
inglés Targeting Induced Local Lesions in Genomes) para la búsqueda de mutaciones
focalizada en un gen o secuencia nucleotídica conocida, permitiendo el análisis de
muestras de muchos individuos.

				
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